发酵设备的异常和染菌培训课件

1、第十章一、热灭菌的原理和方法 1干热灭菌的原理和方法干热灭菌的主要作用： 干热对微生物有氧化、使细胞蛋白质变性和电解质浓缩等从而使微生物细胞中毒死亡。 其中导致微生物死亡的主要作用是氧化。在干热处理中，只要有足够高的温度和足够长的时间，所有微生物都可被杀灭。 一般采用的干热灭菌的条件: 160 、120 min。一、热灭菌的原理和方法 干热灭菌的效果不如湿热灭菌： 微生物对干热的耐受力要比对湿热的耐受力强得多。这可用温度系数Q10来表征。 Q10是指：温度升高10时微生物的死亡速度常数与原来温度时的死亡速度常数的比值。一、热灭菌的原理和方法 表中列出了一些微生物菌种的Q10。从表中的内容可知，

2、干热灭菌时嗜热脂肪芽孢杆菌的Q10仅为2.86，而在湿热灭菌时的Q10却高达14.28。某些微生物的Q10微生物名称干热灭菌湿热灭菌嗜热脂肪芽孢杆菌2.8614.28枯草杆菌黑色亚种2.728.71凝结芽孢杆菌2.60大肠杆菌营养体50.44 干热灭菌的适用范围： 适用于工业上要求的灭菌后仍能保持干燥状态的物料的灭菌。实验室规模的玻璃器皿等器具常采用干热灭菌。 干热灭菌的温度和时间的关系可参考下表。一、热灭菌的原理和方法 灭菌温度（0C)灭菌时间17060160120150150140180121过夜干热灭菌的温度和时间2湿热灭菌的原理和方法湿热灭菌的原理： 借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中

3、的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键遭到破坏而引起不可逆的变性导致微生物死亡。 下表列出了卵蛋白中水分的含量与其凝固温度的关系。蛋白质水分含量和凝固温度卵蛋白水分含量（%）凝固温度（0C)50562576159651490165湿热灭菌中水分的作用：1.由于水分子的存在，使蛋白质更易因受热而凝固变性。2.在高温下水还能直接与复杂的生化成分反应，破坏必需的细胞成分或者产生有毒的副产物。一、热灭菌的原理和方法 湿热灭菌中水分的作用：3.在灭菌过程中水有助于杀死微生物的第二条途径是通过增加热导系数。犹如人能将其手快速地穿过800的蜡烛火焰而不会感到灼热或疼痛，而穿过100的茶壶喷出的蒸汽流

4、时，手指会受伤。方法： 利用蒸汽进行湿热灭菌时，可通过调节蒸汽的压强来调节灭菌温度。但应注意的是，有时压力计指示的压力并不总是表示相应的温度。因此，在采用湿热灭菌时，应注意以下两个因素： (1)压力计的选用 压力计选用包括选定压力计的型式及决定压力计的量程两个方面。弹簧管压力计是测量蒸汽压力而被广泛使用的压力计。在被测压力比较平稳的情况下，规定被测压力的最大值是选用压力计满刻度的34。如被测压力是脉动的，则规定被测压力的最大值是选用的压力计满刻度的2/3。 被测压力的低限，在以上两种情况下都不应该低于所选压力满刻度的13，以保证读数误差不致太大。选用满刻度或太小的压力计，都不能得到准确的读数。

5、 (2)压力容器中残留空气的排放 压力容器中有空气存在时，空气与蒸汽混合，蒸汽分压与空气分压之和为容器的总压力。蒸汽分压低于无空气残留时的蒸汽压力时，则蒸汽冷凝温度降低，不能起到完全灭菌的作用。残留空气愈多，温度则愈低。 判断压力容器中的空气是否排除干净的判断方法： 可根据排气口排出气体的温度来判断。若排气温度已达到100，则表明空气已排除干净。 容器上的压力计和温度计的安装位置须能正确指示容器内的压力和温度。压力计应安装在远离蒸汽进口的上方，温度计则安装在近空气出口处。一、热灭菌的原理和方法 3培养基及有关设备的灭菌方法 培养基灭菌过程中，除了微生物被杀死外，还伴随着培养基成分的破坏。在蒸汽

6、加压加热情况下，氨基酸和维生素等都易被破坏。在工业生产中必需选择既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏量减少到最小的条件。 根据微生物对数残留定律(灭菌过程中，在一定温度下残留微生物的数量随时间增加而以对数速率减少)，灭菌过程中培养基受热破坏呈化学反应的一级动力学反应。生产实践证明，灭菌温度较高而时间较短的灭菌效果要比灭菌温度较低而时间较长的好。 (1)实罐灭菌(分批灭菌) 先将输料管路内的污水放尽并冲洗干净，再特配制好的培养基用泵打到发酵耀、种子耀或补料罐内(较小体积的配料可直接在罐内配制)，然后开动搅拌器进行灭菌。其操作过程大致可分为：培养基预热 灭菌时培养基需先加热到80-90，然后再导入

7、蒸气升温到120-180。 预热的目的： 一是若直接导入蒸汽，由于培养基与蒸汽的温差过大会产生大量的冷凝水使培养基稀释。 二是若直接导入蒸汽容易造成泡抹急剧上升而引起物料外溢。培养基预热 预热的方法：先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升到8090，将排气阀逐渐关小。培养基灭菌 将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接导入罐内(如有冲视镜管则也同时导入蒸气)，使罐温上升到120130，罐压维持在105Pa(表压)左右，并保温30min。 灭菌时应注意：各路蒸气进口的进气要畅通，防止短路逆流，罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度； 排气量不宜过大，以节约蒸气用量；灭菌将

8、要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而抽吸外界空气；在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基(或物料)将倒流入过滤器内，灭菌时总蒸气压力不低于33.5 105 Pa(表压)，使用压力不低于2 105Pa(表压)。 (9)连续灭菌 培养基通过连续灭菌以比分批灭菌高的温度和较短的时间，进行快速连续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酸罐中。培养基预热 将料液预热到60-75，避免连续灭菌 时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水气撞击声。 连续灭菌 连续灭菌是在连消塔中完成的。连消塔的主要作用是使高温蒸气与料液

9、迅速接触混合，并使料液温度很快升高到灭菌温度。 连续灭菌的温度一般以126132为宜。由于输送培养基的连消泵的出口压力一般为6105Pa，所以总蒸汽压力要求达到4.55.0105Pa以上。只有当两者压力接近，培养基流速才能均匀稳定，否则流速非快即慢，影响灭菌质量。 维持灭菌温度 由于连消塔加热时间较短，光靠这短时间的灭菌是不够的。因此，利用维持罐使料液在灭菌温度下保持67min，以达到灭菌的目的。维持罐的罐压一般维持在 4105Pa左右。冷却 生产上一般采用冷水喷淋冷却，即用冷水在排管外从上向下喷淋，使管内料液逐渐冷却。一般料液冷却到40-50后，输送到预先空消过的罐内。在冷水喷淋前，冷却管内

10、应充满填料。 连续灭菌的特点： 连续灭菌的温度较高，时间较短，培养基受到的破坏较少，故质量较好。 连续灭菌时由于培养基灭菌不在发酵罐内进行，所以发酵罐的利用率较高，此外，连续灭菌时蒸汽负荷均衡一致。 但连续灭菌的不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。 (4)发酵附属设备及管路的灭菌 发酵附属设备：总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。 一般糖水罐灭菌时罐压为1105Pa、时间为30min。灭菌时要使糖水翻腾良好，温度不宜过高，否则糖料易炭化。 油罐(消沫剂)的罐压为1518105Pa、时间为60 min。(4)发酵附属设备及管路的灭菌 总空气过滤器灭菌时，先关闭总进气和出气

11、阀门，开启放气阀门，使总空气过滤器内的压力降到零(表压)。 总空气过滤器灭菌的蒸汽压力为36105Pa左右，蒸汽自上端输入，上下放气口放气，总过滤器内压控制为152.0105Pa(表压)，灭菌时间2h。灭菌完毕，自上端输入空气，自上而下吹干过滤介质。 常用的化学药剂包括： 甲醛、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉、过氧乙酸、乙醇和新洁尔灭等。 其用途和使用方法见表11-11。 射线灭菌即利用紫外线、高能量的电磁波或粒子幅射灭菌。紫外线的灭菌功能： 低压水银电弧发射的紫外线，对微生物有杀灭作用。其波长在2100-3132范围内有效，而最常用的有效波长为2537。 紫外线对芽饱和营养细胞都能起作用，但其穿透

12、力极低，只能用于表面灭菌，它对真菌孢子的杀灭能力不大。 紫外线灭菌的适用范围： 在发酵生产和实验室规模，紫外线主要用来进行一定空间内空气的灭菌(如无菌室等），而用于大量空气的灭菌，技术上有许多困难，因此在工业生产中用紫外线对杀灭大量流动空气中的细菌意义不大。 紫外灯的使用寿命：商品紫外灯输出波长2637的紫外线达95，长期使用后能量逐渐衰减，杀菌效果亦即降低，因此需定期更换。l 介质过滤除菌主要是用于空气除菌以得到发酵工业所需的无菌空气。l 空气(即大气)是一种气态混合物，除氧气、氮气、二氧化碳、惰性气体和水蒸气外，尚有悬浮在空气中的灰尘。l 灰尘主要是由构成地壳的无机物质微粒、烟灰、植物的花

13、粉、以及种类繁多的细菌和其他微生物组成。l 灰尘的含量和粒子的大小很大程度上因地区、气候的不同而异。一船城市多于农村或山区，夏天多于冬天，特别是气候温和温润的地区，空气中的细菌往往较多。 1介质除菌的机理 杂菌在空气中很少单独游离存在，常以一定形式与其他物质结合在一起，大部分杂菌附着在烟灰、微滴等粒子上。介质过滤或静电除尘法除菌就是把这些粒子与附着在粒子上的杂菌，以及空气中单独游离存在的杂菌除去。介质除菌过程涉及到下述五种除菌机理。 (1)沉降作用 微粒具有一定的重力，当微粒的重力超过空气作用于它的浮力时(不计气流速度的影响)，即产生一种沉降速度。低速度的气流通过介质时，微粒沉降在介质表面。实

14、际上，由于气流速度大于微粒沉降速度，因而沉降效果不明显。所以在介质除菌过程中，沉降是去除微生物和尘埃的次要因子。 (2)截留作用 截留是空气中的微生物或尘埃表面与过滤介质表面简单接触，微生物和尘埃吸着在介质表面。除菌介质，如纤维等的直径愈细，填充密度愈大，截留效果愈好。截留作用在介质过滤中也不是除菌的主要机理。 (3)惯性碰撞 气流中的微尘具有一定的惯性力，当气流遇到过滤介质而改变方向时，微尘仍作直线运动以致与过滤介质碰撞而被阻拦在过滤介质表面。当气体流速达到一定值时，惯性碰按是介质过滤除尘的主要因子。四、介质过滤除菌的原理和方法(5)静电吸附 许多微生物及其孢子都带有电荷，约有75的孢子带有

15、160负电子单位，15的孢子带有514正电子单位，其余10的孢子为中性。介质过滤中带电荷的粒子可被带相反电荷的介质吸引除去。2空气过滤除菌的工艺过程 工业发酵过程中为得到无菌空气。 主要目的： 一是，提高压缩前空气的质量(洁净度)。 二是，去除压缩空气中所带的油和水。 三是，再加热到3035，最后通过总过滤器和分过滤器(有的不用分过滤器)除菌，从而获得洁净度、压力、温度和流量都符合工艺要求的无菌空气。(1)提高压缩前空气的质量 主要措施是提高空气吸气口的位置和加强吸入空气的压缩前过滤。提高空气吸气口的高度可以减少吸入空气的微生物含量。一般空气吸入口以离地面510m为较好。装上前过滤器可减少往复

16、式空气压缩机活塞和气缸的磨损，减轻介质过滤除菌的负荷。 冷却后的空气其相对湿度提高到100，由于温度处于露点以下，其中的油、水即凝结为油滴和水滴。进而用空气贮藏罐来沉降大的油滴、水滴和稳定压力，用旋风分离器分离5um以上的液滴，用丝网除沫器分离5um以下的液滴。 (3)无菌空气的获得 分离油、水以后的空气的相对湿度仍为100，当湿度稍微下降时(例如冬天或过滤器阻力下降很大时)就会析出水来，使过滤介质受潮。因此，还必须使用加热器来提高空气温度，降低空气的相对湿度(要求在60以下)，以免析出水来。这样的空气(3035)再经过总过滤器和分过滤器除菌后即能得到符合工艺要求的无菌空气。 染菌原因常因工厂

17、不同而有所不同，但设备渗漏、空气有菌、种子带菌、灭菌不彻底和技术管理不善等则是造成各厂染菌的普遍原因。值得注意的是，原因不明的染菌率愈高，从某种程度上说明该厂的分析水平较低，有待于进一步提高。下面介绍一些常见的染菌原因和防治措施。 种子染菌的判断： 根据长期的生产经验，在种子培养过程中，06h内种子染菌是较少见的，绝大多数染菌在10h以后。种子污染芽孢菌，推测可能是由于灭菌不彻底所致，故不应作为种子带菌统计。 但种子污染酵母菌、霉菌则可能是种子带菌的缘故。 种子染菌的判断方法： 为了弄清染菌是否为种子带菌所致，在接种后要将接种瓶中剩余的少量种子液继续进行培养，以观察判定是否为种子带菌。 发酵设

18、备及其附件一旦渗漏，就会造成染菌。 例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔进入发酵罐而招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。二、设备及附件渗漏造成的染菌及其防治措施 设备漏隙，如肉眼所能见者，容易被发现也容易被治理。但对于肉眼看不见的微小漏隙，则必须通过加压等各种试漏方法才能被发现。 由于各种设备和附件都可能发生这种微小的渗漏，加之目前还缺少快速准确的检测手段，故很难发现。因此，常常发生这种情况，即虽已判定是设备或其附件渗漏而引起的染菌，但控往部找不到渗漏源，以致因同一处渗漏而造成连续多批染菌。 了解渗漏的原因，及时采取措施，不但可以防止发酵染菌，还可以延长

19、设备及其附件的使用寿命。 一般来说，造成发酵设备及附件渗漏的有下述四项原因。1化学腐蚀及其防止 所谓化学腐蚀是指金属或合金与介质间直接的化学作用而引起的破坏。发酵设备及附件所接触的介质主要为蒸汽、空气、油、糖及含氮的水溶液。这些介质的化学性质稳定、与金属或合金间的化学作用非常缓慢。调节发酵液的pH值需用酸和碱，前体如苯乙酸(青霉素发酵)、丙酸(红霉素发酵)等，这些物质均能产生化学作用，即发生化学腐蚀。 但由于接触时间较短，且这些物质的数量不多，因此，可以认为在抗生素发酵中，化学腐蚀并不是设备损坏的主要原因。但在有机酸发酵过程中，化学腐蚀是设备损坏的主要原因。二、设备及附件渗漏造成的染菌及其防治

20、措施二、设备及附件渗漏造成的染菌及其防治措施2电化学腐蚀及其防止 金属腐蚀经常伴有电流发生。当电子从金属的某一区域的电介质溶液移动而引起的破坏称为电化学腐蚀，即由于电介质的存在，在金属表面产生微电池作用，从而使较活泼的金属放出电子而发生氧化反应的一种腐蚀。电化学腐蚀能不断深入金属内部，使设备腐蚀穿孔，电化学腐蚀的破坏性比化学腐蚀严重。在抗生素发酵过程中，需要连续输入空气，又连续产生二氧化碳，从而使发酵设备加速腐蚀。防止办法： 电化学腐蚀常采用阴极保护法来防止，其基本原理是使要保护的金属成为阴极，因为由于阴极是还原反应，从而使金属得到保护。但对抗生素发酵设备的电化学腐蚀来说，几乎还没有保护的办法

21、。 3腐蚀及其防止 金属、合金或非金属材料与介质长期连续不断地摩擦而引起的破坏称为腐蚀。腐蚀没有化学和电化学反应发生，纯粹是机械磨损。 产生腐蚀的原因： 工业发酵培养基中常含有黄豆饼粉、花生粉或其他种籽饼粉等固体成分，在发酵过程中因搅拌而与罐壁、盘管、搅拌轴、挡板等长期连续摩擦，使罐体、盘管磨蚀而穿孔泄漏。各种籽实在榨油和籽饼加工过程中，可能掺杂泥沙、金属等异物，从而使磨蚀加快。 二、设备及附件渗漏造成的染菌及其防治措施腐蚀的原因： 培养基中的其他成分如玉米浆等，也常混有固体异物，这些都是造成磨损的原因。造成磨蚀的另一个不可忽视的原因是蒸汽和压缩空气对设备的冲击。 3腐蚀及其防止 腐蚀的防止方

22、法： 一是，对发酵用的培养基中的固体成分研磨到相当的细度。如美国施贵宝公司将培养基中的黄豆饼粉研磨到200目以下。 二是，设备定期检修时，应检查一下设备中受蒸汽、空气和其他流体冲击的部位是否被磨蚀，如被磨蚀应及时采取措施。4设备加工不良遭成渗漏及其防止 由于设备制作加工者对工业发酵工艺要求不了解，所以设备加工不良或有缺陷而引起穿孔渗漏，也是常见的染菌原因之一。 属于制作加工不良的渗漏多发生在弯头和焊缝处。因此工厂在正式投入使用前，应进行适当的调研和试验，以保证所用设备或附件能适应工艺要求。二、设备及附件渗漏造成的染菌及其防治措施4设备加工不良遭成渗漏及其防止 设备及附件渗漏而导致染菌的机率很高

23、，因此，有必要对发酵用的设备及附件进行规范化的维修。各种设备及附件的检查内容、时间间隔、维修质量标准等列于表11-1711-25(抗生素发酵)。 三是，设备制作或安装不合理而使灭菌时蒸汽短路。由培养基灭菌不彻底而产生的染菌大多表现在发酵前期，且污染的杂菌大多为耐高温的芽孢菌。 根据上述几种造成培养基灭菌不彻底而导致染菌的原因，采取相应的措施，能够防止。 如灭菌时的蒸气压力、蒸气量和灭菌时间一定要保证；灭菌时从常温升到灭菌温度的升温时间不宜太快(一般为45min左右)，以防止大量泡沫的产生，因为染菌大多是由于通蒸气灭菌时泡沫上升到发酵罐罐顶不易消失造成的。 为防止灭菌时泡沫的产生，最好将含有大量

24、糖及氮的培养基分开灭菌，尤其是在当原材科易受潮、结块、甚至发霉变质的季节，将糖氮分开灭菌会减少泡沫的产生。 投料方式有时也会影响泡沫的形成。进气和排气控制不当，容易产生泡沫，故要缓慢开启进气和排气阀门以防止泡沫上升。再则，合理地创作加工和安装设备及有关的附件，使灭菌时蒸汽能够通到各个部位而不留有“死角”。 空气系统导致染菌是抗生素发酵染菌的主要原因之一。 因空气不洁造成的染菌，可波及许多发酵罐批，对生产危害甚大。 空气除菌系统环节较多，彼此相互制约，倘若一个环节失调，就会使灭菌失败，这是空气系统容易染菌的主要原因。 空气带菌主要包括： (1)油掺入空气和列管式冷却器穿孔；可采用无润滑油活塞式空气压缩机和定期检查列管式冷却器来解决。 (2)空气过滤器过滤介质松动、过滤介质老化、操作不当使过滤介质受潮、灭菌时被冷凝水润湿等。可通过严格按操作规程操作，定期更换过滤介质和检修过滤器来解决。 良好的发酵设备和严格的灭菌操作是防止染菌的先决条件。但是，单纯重视技术操作而忽视技术管理，就不能取得令人满意的防止发酵染菌的效果。 在发酵工业中普遍存在噬茵体危害，尤其在谷氨酸、酶制剂、抗生素、有机溶剂、微生物杀虫剂和干酪、酸乳的生产中，噬菌体的污染造成严重的经济损失。 此外，几乎一些重要的发酵工业都曾先后发现噬菌体的危害。 防治措施包括以下内容。