酶的分离纯化

1、Chapter 4 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme酶的分离纯化酶的分离纯化Contents of chapter 4第一节、发酵醪液预处理第二节、酶的初步纯化第四节、酶的浓缩与干燥酶的浓缩与干燥第五节、酶纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价第三节、酶的高度纯化第一节、发酵醪液预处理第一节、发酵醪液预处理一一、 酶在细胞中分布及发酵醪液预处理酶在细胞中分布及发酵醪液预处理二、细胞破碎二、细胞破碎三、发酵液的固液分离发酵液的固液分离第一节、发酵醪液预处理 一、酶在细胞中的分布及发酵醪预处理1、酶在细胞中分布、酶在细胞中

2、分布l胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。l胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。细胞结构与酶分布2、酶分离原则：l在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活力。3 3、 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线预处理预处理酶初步分离纯化酶初步分离纯化酶浓缩、干燥酶浓缩、干燥酶产品酶产品发酵醪液发酵醪液沉淀分离、提取、离沉淀分离、提取、离心心酶

3、高度分离纯化酶高度分离纯化细胞破碎、离心、过滤细胞破碎、离心、过滤膜过滤、层析分离，电泳分膜过滤、层析分离，电泳分离离l预处理预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。破碎（分离胞内产物）等。l初步纯化初步纯化（rough fractionation） （提取）：除（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。去与目的产物性质差异很大的杂质。l高度纯化高度纯化（fine fractionation） （精制）：除（精制）：除去与产物性质相似的杂质。去与产物性质相似的杂质。l浓缩与干燥浓缩与干燥（concentration and desic

4、cation）（成品加工）（成品加工）: :使酶与溶剂分离的过程。使酶与溶剂分离的过程。二、二、 细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活

5、性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过通过机械运动产生的剪切机械运动产生的剪切力力，使组织、细胞破碎。，使组织、细胞破碎。通过通过各种物理因素的作用，各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过通过各种化学试剂各种化学试剂对细胞对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过通过细胞本身的酶系或外细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，加酶制剂的催化作用，使使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理本章目录三、发酵液的固液分离三、发酵

6、液的固液分离1 . 过滤：过滤：借助过滤介质使不同大小、不同形状组分分离。借助过滤介质使不同大小、不同形状组分分离。 过滤介质：滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等过滤介质：滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等 根据推动力产生条件不同过滤分为：根据推动力产生条件不同过滤分为： （1）常压过滤常压过滤：以液位差为推动力。如滤纸、吊篮或吊袋过滤：以液位差为推动力。如滤纸、吊篮或吊袋过滤 （2）加压过滤加压过滤：以压力泵或压缩空气产生的压力为动力：以压力泵或压缩空气产生的压力为动力如板框压如板框压滤滤 （3）减压过滤减压过滤：在通过过滤介质下方抽真空，使产生压力差。：在通过过滤介质下方抽真空，使产生压力差。

7、 如转鼓式真空吸滤机。如转鼓式真空吸滤机。在发酵醪液预处理中采用的是粗滤，即过滤悬浮液中直径大于在发酵醪液预处理中采用的是粗滤，即过滤悬浮液中直径大于2m的颗粒的颗粒2 2、离心分离、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的的颗粒大小、密度和特性的不同颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的，选择适当的离心机、离心方法和离心条件离心机、离心方法和离心条件。（一）离心机的选择（一）离

8、心机的选择离心机的种类离心机的种类1 1、常速离心机常速离心机 最大转速最大转速8000rpm8000rpm(r/min), (r/min), 用于用于细细胞、细胞碎片胞、细胞碎片和和培养基残渣培养基残渣等分离；等分离；2 2、高速（冷冻）离心机、高速（冷冻）离心机 1 110104 4-2.5-2.510104 4rpmrpm, ,用于用于沉淀沉淀、细胞器细胞器等分离；等分离；3 3、超速离心机、超速离心机 转速转速2.5-82.5-810104 4rpmrpm，用于，用于DNADNA、RNARNA蛋白质及细胞器病毒分离纯化蛋白质及细胞器病毒分离纯化；检测纯度检测纯度；沉降系沉降系数和相对分

9、子量测定数和相对分子量测定等。等。l分制备用、分析用、制备及分析用三种。分析用超分制备用、分析用、制备及分析用三种。分析用超速离心机装有光学检测系统、自动记录系统、数据速离心机装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统；处理系统；l温度类型：温度类型：常温及冷冻常温及冷冻l超速离心机均为冷冻型。超速离心机均为冷冻型。l使用冷冻离心机时提前使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。降温，预冷离心头。l使用超速离心机时先抽使用超速离心机时先抽真空。真空。l外摆式一般为低速，外摆式一般为低速， l角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 l角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖要旋紧。角

10、式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖要旋紧。材质：玻璃，塑料材质：玻璃，塑料强度：和离心速度强度：和离心速度相配相配大小：和转子配套大小：和转子配套高速超速管要加盖高速超速管要加盖l平衡、定温、定速、定时。平衡、定温、定速、定时。（二）离心方法的选择（二）离心方法的选择l所分离的颗粒大小和密度相差较大所分离的颗粒大小和密度相差较大:常速常速、高速离心高速离心;l若从样品液中分离若从样品液中分离2种以上大小和密度不同的颗粒：种以上大小和密度不同的颗粒： 差速离心差速离心;l超速离心超速离心:差速离心法差速离心法和和密度梯度离心法密度梯度离心法，后者又分速，后者又分速率率区带离心区带离心

11、和和等密度等密度离心。离心。离心分离示意图离心分离示意图（a）离心前的悬浮液）离心前的悬浮液 （b）（）（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况）离心不同时间后颗粒的沉降情况 差速离心示意图差速离心示意图已破碎的细胞已破碎的细胞 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核） 上清液上清液 沉淀（细胞膜碎片、沉淀（细胞膜碎片、线粒体、溶酶体）线粒体、溶酶体） 上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白体）沉淀（核糖核蛋白体） 上清液（可上清液（可溶性组分）溶性组分）500g,1010 000g,101差速离心差速离心 （differential centrifugation） 采用不同的采用不同的离心速度离心速度和和离心时间离心

12、时间，使沉降速度不同的颗粒，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。分批分离的方法。l适用：适用：分离大小和密度差异较大的颗粒。分离大小和密度差异较大的颗粒。 l优点：优点：操作简单操作简单 。l缺点：缺点：1）分离效果较差，）分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。不能一次得到纯颗粒。 2）壁效应严重。）壁效应严重。 3）沉降的颗粒受到挤压）沉降的颗粒受到挤压2密度梯度离心密度梯度离心 (区带离心区带离心) （density gradient centrifugation）l样品在样品在密度梯度介质密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。

13、接近的组分得以分离的一种区带分离方法。l常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖、甘油蔗糖、甘油溶液。（溶液。（5%5%60%60%）l密度梯度介质一般采用密度梯度混合器进行制备密度梯度介质一般采用密度梯度混合器进行制备l特点：特点： 区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。 适宜分离密度相近而大小不同的固相物质适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。密度升高密度升高3种梯度示意图BABAABa.线性梯度线性梯度b.凸型梯度凸型梯度c.凹型梯度凹型梯度Density gradient ultracentrifugation3. 等密度梯度离心等

14、密度梯度离心l又称又称沉降平衡离心沉降平衡离心 （sedimentation equilibrium centrifugation）l根据根据颗粒的密度不同颗粒的密度不同而进行分离。而进行分离。l离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。再移动，形成区带。 l常用常用氯化铯氯化铯（CsCl）作为梯度介质。）作为梯度介质。l特点：特点： 介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度

15、。 适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。本节目录梯度回收梯度回收1、穿刺法、穿刺法l采用针穿刺离心管底部，使梯度靠重力自由滴采用针穿刺离心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法适用于薄壁塑出，然后依次作分布收集，此法适用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小试管中，经分析决料管，流出液部分收集于小试管中，经分析决定取舍或合并。定取舍或合并。l此法对梯度扰动小，但离心管不能再用，不适此法对梯度扰动小，但离心管不能再用，不适合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢或厚壁塑料管。或厚壁塑料管。2、取代法、取

16、代法浓浓取取代代液液收集收集 稀稀 浓浓通入空气、轻液体通入空气、轻液体收集收集 浓浓 稀稀l优点：是不破坏离心管优点：是不破坏离心管，能用于较粘梯度，可借，能用于较粘梯度，可借光学（放射性）系统进行光学（放射性）系统进行流出液跟踪，简化分析化流出液跟踪，简化分析化验工作。验工作。l缺点：开始取代操作时缺点：开始取代操作时易引起扰乱，操作需特别易引起扰乱，操作需特别小心，梯度粘度太大时也小心，梯度粘度太大时也不合适。不合适。 向上取代向上取代向下取代向下取代3 3、虹吸法、虹吸法 用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯 度，度，它也不损伤离心管，尤

17、其适用于不锈钢管中物质的分级它也不损伤离心管，尤其适用于不锈钢管中物质的分级分离，但虹吸时易引起分离区带扰乱，最好使用专门的分离，但虹吸时易引起分离区带扰乱，最好使用专门的装置。装置。l除取代法和虹吸法外，有时从管上部直接仔细地用除取代法和虹吸法外，有时从管上部直接仔细地用注射注射器或吸管定量移出梯度液器或吸管定量移出梯度液，效果也较好。，效果也较好。4 4、切割法、切割法 适用于极粘梯度，就是用离心管切割器将冻结的塑料适用于极粘梯度，就是用离心管切割器将冻结的塑料管子切成薄片，从而将梯度分部收集，此法仅适用于赛管子切成薄片，从而将梯度分部收集，此法仅适用于赛璐璐或硝酸纤维素管。璐璐或硝酸纤维

18、素管。（三）离心条件选择（三）离心条件选择1. 离心力离心力 Fc = m ac m r2 m r ( 2 N/60 ) 2 N为离心机每分钟转数为离心机每分钟转数 （r/min ）；）； Fc通常以相对离心力通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，即离心力表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数的大小相当于地球引力（重力常数g）的多）的多少倍。一般用少倍。一般用g（或数字（或数字 g）表示。）表示。 RCF = m r (2 N/60)2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系，此公式描述了相对离心力与

19、转速之间的关系， 旋转半径旋转半径用用r平均代替平均代替 r平均平均=1/2（r大大+r小）小）cm通常：通常：l低速离心以低速离心以每分钟的转数每分钟的转数表示，如：表示，如：4000r/min。l高速离心（超速），常以高速离心（超速），常以相对离心力相对离心力（RCF）表示，如：表示，如：65000g。l 两者可换算或查测算图。两者可换算或查测算图。2、离心时间、离心时间 不同离心方法，离心时间的概念不同。不同离心方法，离心时间的概念不同。l对常速离心、高速离心、差速离心对常速离心、高速离心、差速离心,指颗粒完全指颗粒完全沉降到离心管底的时间沉降到离心管底的时间,沉降时间或澄清时间沉降时间

20、或澄清时间;l等密度梯度离心等密度梯度离心,指颗粒完全到达等密度点时平指颗粒完全到达等密度点时平衡时间，衡时间，平衡时间平衡时间;l对密度梯度离心对密度梯度离心,指形成界限分明区带的时间，指形成界限分明区带的时间，区带形成时间区带形成时间;沉降时间沉降时间l指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间;l决定于沉降速度和沉降距离。决定于沉降速度和沉降距离。沉降系数已知颗粒沉降系数已知颗粒S：沉降系数；：沉降系数；:角速度；角速度；r1，r2:转轴中心到液面与管底距离。转轴中心到液面与管底距离。效率因子效率因子KK与转子半径和转速有关；与转子半径和转速

21、有关；实际操作中：实际操作中：1、某一颗粒、某一颗粒S定值，故定值，故K小，小，t也小，效率高（转子的选择）；也小，效率高（转子的选择）；2、转子与离心机确定，具体颗粒的、转子与离心机确定，具体颗粒的2t是常数，故可调整是常数，故可调整与与 t 得相同效果。得相同效果。3、温度和、温度和pH值值l一般为一般为4。l稳定性好的酶，可取室温；稳定性好的酶，可取室温；l超高速离心需冷冻。超高速离心需冷冻。lpH值应处于酶稳定的值应处于酶稳定的pH范围。范围。第二节、酶的初步分离纯化第二节、酶的初步分离纯化一、酶的提取二、酶的沉淀分离三、膜过滤酶的提取：酶的提取：是指在一定的条件下，用适当是指在一定的

22、条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。一、一、 酶的提取酶的提取 (extraction)(extraction) l提取目标：提取目标： a.a.将目的酶最大限度地溶解出来。将目的酶最大限度地溶解出来。 b.b.保持生物活性。保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（一般采用低温下（0-100-10）操作。）操作。l提取原则提取原则 a.a.相似相溶。相似相溶。 b.b.远离等电点的远离等电

23、点的pHpH值，溶解度增加值，溶解度增加酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶本章目录酶的提取主要影响因素是酶的提取主要影响因素是酶在所使用溶剂中的溶解度酶在所使用溶剂中的溶解度，以及，以及酶酶向溶剂相中的扩散速度向溶剂相中的扩散速度。此外还受到此外还受到温度温度、

24、pH值值和和提取液体提取液体积积等提取条件的影响。等提取条件的影响。大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象盐溶现象。 二、沉淀分离二、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法） 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 选择性沉淀（热变性和酸碱变性）选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 等电点沉淀等电点沉淀 有机聚合物沉淀有机聚合物沉淀1、盐析沉淀法（改

25、变离子强度）、盐析沉淀法（改变离子强度）（1）. 基本原理（盐溶和盐析）基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：两种现象： 1) 盐溶盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。l在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质溶解度不同，由此在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质溶解度不同，由此可达到分离的目的。可达到分离的目的。蛋白质的盐析原因：原因： 高盐浓度下

26、盐离子与高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称蛋白质先后析出，称分段盐分段盐析析。（2） 盐析用盐盐析用盐1）中性盐的选择）中性盐的选择 常用常用(NH4)2SO4，其突出优点：，其突出优点： a. 溶解度大溶解度大 b. 分离效果好分离效果好 c. 不易引起变性不易引起变性 d. 价格便宜价格便宜2） 盐浓度的表示盐浓度的表示 用饱

27、和（溶解）度表示用饱和（溶解）度表示: 溶液中饱和硫酸铵的体积溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度饱和度 溶液的总体积溶液的总体积3) 调整盐浓度的方式调整盐浓度的方式 a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）l适于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不适于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。太高时。l配制饱和硫酸铵溶液配制饱和硫酸铵溶液l所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算： V=V0 式中式中 V,V0为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度S2 - S

28、11 - S2b. 添加固体硫酸铵添加固体硫酸铵l适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。达到的盐浓度又很高时。l按下式计算，得表中数据按下式计算，得表中数据 W= A,B常数，与温度有关。常数，与温度有关。 实际使用时，可直接查表实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下需加固体硫酸（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）铵的量）。B(S2-S1)1-AS2l低饱和度：低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过般终饱和度不超过40。l高饱和度高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积

29、。固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。l操作步骤：操作步骤： 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。 2）冰箱中（）冰箱中（4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。 3）沉淀再溶解后可用超滤（）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透析、透析（dialysis）或层析（）或层析（chromatography）方法脱盐。）方法脱盐。硫酸铵浓度（硫酸铵浓度（%） 枯草杆菌枯草杆菌 -淀粉酶发酵液的盐析曲线淀粉酶发酵液的盐析曲线 （4）盐析的影响因素）盐析的影响因素1) 离子强度和种类（介绍盐析常数）离

30、子强度和种类（介绍盐析常数） 蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系： I：离子强度，I = MZ2； M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数， Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。 IKSSs0loglogl当温度和当温度和pH一定时，一定时，S0对于某一溶质是常数，用对于某一溶质是常数，用表示，盐析方程式可改写为：表示，盐析方程式可改写为： log S = - Ks I l两种盐析法：两种盐析法：Ks

31、分级盐析法分级盐析法 ：在一定的在一定的pH和温度条件下，利和温度条件下，利用不同蛋白质用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变浓度（即改变I值）的沉淀方法。值）的沉淀方法。分级盐析法分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变溶在一定离子强度下，通过改变溶液的液的pH及温度的沉淀方法。及温度的沉淀方法。2) 蛋白质浓度： 过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%- 3%最好。 3) pH值：等电点处最易沉淀。4) 温度的影响：l稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。l浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。l 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在

32、04下操作。 2、有机溶剂沉淀（降低介电常数）有机溶剂沉淀（降低介电常数） 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。离的方法。 （1） 沉淀机理沉淀机理 降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数 破坏蛋白质表面水膜破坏蛋白质表面水膜 （2） 常用有机溶剂常用有机溶剂 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积的甲醇，用量一般为酶液体积的2 2倍左倍左 右，终浓度为右，终浓度为70%70%。 l 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40

33、。l 溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 本节目录（3）优缺点：l优点优点：1）分辨率比盐析法高分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心）溶剂易蒸发，沉淀易离心l缺点：缺点：1）容易引起蛋白质变性失活）容易引起蛋白质变性失活 2)2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。较高。（4） 影响有机溶剂沉淀的因素影响有机溶剂沉淀的因素 1）温度）温度 ：低温（低温（0）操作。）操作。 2）pH 值

34、：值：尽可能靠近其等电点。尽可能靠近其等电点。 3）离子强度：）离子强度：采用采用 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤微滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤超滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透反渗透20 (40,000) 压力差，100kPa 筛分 超滤UF 120 (10,000-40,000) 压力差，100kPa 筛分 纳滤NF 1 (1001000) 压力差，100) 压力差，1000kPa 优先吸附、溶解扩散 四种常用膜分离技术的基本特征四种常用膜分离技术的基本特征 四种常用膜分离过程的截留特性四种常用膜分离过程的截

35、留特性本节目录Reverse Osmosis (RO)Ultrafiltration (UF)Nanofiltration (NF)Microfiltration (MF)2、电场膜分离、电场膜分离在半透膜的两侧分别装上正负极，电场作用下小分子在半透膜的两侧分别装上正负极，电场作用下小分子带电物或离子向与其本身电荷相反的电极移动，透过带电物或离子向与其本身电荷相反的电极移动，透过半透膜，达到分离目的。半透膜，达到分离目的。电渗析电渗析离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析应用：应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸

36、及凝胶电洗脱。脱。用离子交换膜代替一般的半透膜。用离子交换膜代替一般的半透膜。样品液样品液缓冲液3、扩散膜分离、扩散膜分离透析膜透析膜商品透析膜大多制成管状商品透析膜大多制成管状 。材料：纤维素衍生物。材料：纤维素衍生物。1）透析膜的预处理透析膜的预处理：目的：目的：除杂质。除杂质。 2）透析袋的保存透析袋的保存 ：防腐剂防腐剂冷藏。冷藏。第三节、酶的高度分离第三节、酶的高度分离一、层析分离二、电泳分离二、层析分离二、层析分离 层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学年俄国植物学家家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶发现并命名的。将植物色素溶液通过装有液

37、通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。不同的色带而被分开。 色谱色谱组分色素石油醚石油醚碳酸钙颗粒色谱起源色谱起源用色彩（用色彩（chromachroma）和图谱（）和图谱（graphsgraphs）组成色谱）组成色谱 一词，（一词，（Chromatography) Chromatography) 。层析法的基本原理利用混合物中各组分的物理化学性质利用混合物中各组分的物理化学性质( (分子大小和分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数形状、分子极性、吸附力

38、、分子亲和力、分配系数等等) )的差别，的差别，使各组分在流动相和固定相中的分布使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。：携带样品流过整个系统的流体：携带样品流过整个系统的流体：静止不动的一相：静止不动的一相层析法的分类l按两相所处的状态分类：按两相所处的状态分类： 液相层析液相层析气相层析气相层析液液-液层析液层析液液- -固层析固层析气气- -液层析液层析气气- -固层析固层析l 按层析原理分类按层析原理分类 层析方法分离依据吸附层析吸附层析利用吸附剂表面对不同组分吸附性能差异吸附性能差异而使混合物中各组分

39、分离分配层析分配层析利用各组分在两相中的分配系数分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对不同组分的亲和力亲和力不同，而达到分离目的凝胶层析凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用凝胶对相对分子质相对分子质量量不同不同各种组分的阻滞作用不同，而达到物质分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的专一而又可逆的亲和力亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离l按操作形式不同分类：柱层析柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方：将固定相装于柱内，使样品

40、沿一个方向移动而达到分离。向移动而达到分离。纸层析纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。（一）吸附层析（一）吸附层析（adsorption chromatography）l原理原理 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用

41、）的差异进行分离。的差异进行分离。l吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。性质有关。l吸附层析的关键是吸附层析的关键是吸附剂吸附剂和和洗脱剂洗脱剂的选择。的选择。常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析吸附层析柱柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。的过程。 溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法 吸附层析操作：吸附层析操作：2.吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用

42、等与待分吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。离物质的极性官能团作用。1 1）吸附剂的选择：）吸附剂的选择：根据吸附能力强弱分为：根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭强吸附剂：氧化铝、活性炭吸附剂的选择根据相似相溶原则：吸附剂的选择根据相似相溶原则：l极性强的吸附剂易吸附极性强的物质极性强的吸附剂易吸附极性强的物质l非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。l但为了便于解吸附，对于极性强的物质通常选但为了便于解吸附

43、，对于极性强的物质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附用极性弱的吸附剂进行吸附2）吸附剂的性质：l活性炭：活性炭：常用的吸附介质。常用的吸附介质。l硅胶：硅胶：常用的极性吸附介质。常用的极性吸附介质。l羟基磷灰石羟基磷灰石 （HA） Ca10(PO4)6.(OH)2 : 微晶型的磷酸钙制品，表面有微晶型的磷酸钙制品，表面有Ca2+和和PO43-两两种带电基团；种带电基团； 酸性和中性蛋白质可与酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白结合；碱性蛋白质可与质可与PO43-结合。结合。 吸附原理是吸附原理是HA的的Ca2+与蛋白质的负电荷基与蛋白质的负电荷基团作用。团作用。 3. 洗脱剂要求：要求： 粘

44、度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分分离的成分,易与目标分子分离。易与目标分子分离。选择：选择：l具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。l生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。常用洗脱剂种类：常用洗脱剂种类：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等（二）分配层析（二）分配层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数：分配系数：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。

45、在层析条件确定后，层析系数是一常数。K=固定相中溶质的浓度固定相中溶质的浓度流动相中溶质的浓度流动相中溶质的浓度由于不同溶质有不同的分配系数，移动速度不同，从而达由于不同溶质有不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离到分离p 在分配层析中，通常采用多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。p 另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。 纸上层析：纸上层析：滤纸为载体，纸上结合水为固定相，有机溶剂为流动相滤纸为载体，纸上结合

46、水为固定相，有机溶剂为流动相分配薄层层析：纤维素、硅藻土为支持物。分配薄层层析：纤维素、硅藻土为支持物。 （三）离子交换层析（三）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC）1.1.原理原理: :根据待分离物质带电性质不同的分离根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。纯化方法。1）离子交换剂：）离子交换剂：l离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。 如羧甲基纤维素离子交换剂组成如羧甲基纤维素离子交换剂组成 纤维素纤维素O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ + 载体载体 电荷基团电荷基团 反离子反离子是含

47、有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。（活性基团）而制成。 化学原料合成化学原料合成 ：树脂类物质：树脂类物质（酚醛树脂、苯乙烯树脂）（酚醛树脂、苯乙烯树脂） 载体载体 天然材料制成：天然材料制成： cellulose cellulose sephadex sepharose 阳离子交换剂阳离子交换剂: 电荷基团（）电荷基团（）, 反离子（）反离子（）电荷基团电荷基团 阴离子交换剂阴离子交换剂: 电荷基团（）电荷基团（）, 反离子（）反离子（

48、） 如：如：DEAE-纤维素，纤维素， CM-Sepharose离子交换剂离子交换剂-带有电荷基团的带有电荷基团的不溶性不溶性载体载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3载体载体Cl-Diethylaminoethyl(DEAE) 阴离子交换剂阴离子交换剂(可吸附可吸附带负电的蛋白质带负电的蛋白质) 阳离子交换剂阳离子交换剂(可吸附可吸附带正电的蛋白质带正电的蛋白质)阴离子交换剂：阴离子交换剂：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基羟丙基阳离子交换剂：阳离子交换剂：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO- l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3-

49、DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3类型类型说明说明功能基功能基反离子反离子DEAE-SephadexDEAE-Sephadex A-25 A-25 ，A-50A-50弱碱性阴离弱碱性阴离子交换剂子交换剂二乙氨基己基二乙氨基己基氯氯QAE-SephadexQAE-Sephadex A-25 A-25 ，A-50A-50强碱性阴离强碱性阴离子交换剂子交换剂二乙氨基己二乙氨基己基基2-2-羟丙羟丙基基氯氯CM-SephadexCM-Sephadex C-25 C-25 ，C-50C-50弱酸性阳离弱酸性阳离子交换剂子交换剂羧甲基羧甲基钠钠

50、SP-SephadexSP-Sephadex C-25 C-25 ，C-50C-50强酸性阳离强酸性阳离子交换剂子交换剂磺丙基磺丙基钠钠Ion-exchange chromatography1. 基本原理基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。后流出层析柱。凝胶层析柱中装有多孔凝胶多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于

51、凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的层析柱，而达到分离的目的。Size-exclusion chromatography凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数KdKd表示：表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水体积外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（，层析柱内凝

52、胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi内水体积内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve某组分的洗脱体积某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（高峰时的洗脱液体积（ml）凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰. K. Kd d=0=0时时, ,即即VeVe=Vo,=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。先流出。. K. Kd d=1=1时时, ,即即VeVe=Vo+Vi=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，

53、说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。最后流出。. . 其它组分其它组分0K0Kd d1,1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。因分子大小而改变洗脱峰的位置。KdKd小的先小的先流出，流出，KdKd大的后流出。大的后流出。分配系数分配系数Kd的意义：的意义：1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。可定量地衡量各组分的流出顺序。2) 判断分离效果，判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，差异大，分离效果好， Kd差异小，分离效果差。差异小，分离效果差。2.凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质1)交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（dextran gel) 商品名商品名:Sephadex 型号型号 Sepha

54、dex G10至至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。交联度越小，孔径越大，分离范围越广。葡聚糖凝胶层析介质的有关参数葡聚糖凝胶层析介质的有关参数 凝胶型号凝胶型号 颗粒大小颗粒大小/m/m 溶胀体积溶胀体积/(ml/g)/(ml/g) 分离范围（分离范围（MrMr） SephadexSephadex G-10 G-10 SephadexSephadex G-15 G-15 SephadexSephadex G-25 G-25 SephadexSephadex G-50 G-50 SephadexSep

55、hadex G-75 G-75 SephadexSephadex G-100 G-100 SephadexSephadex G-150 G-150SephadexSephadex G-200 G-2004 4120120 4 4120120 5050150150 5050150150 4040120120 4040120120 4040120120 4040120120 2 23 3 2.52.53.53.5 4 46 6 9 91111 12121515 15152020 20203030 20203030 小于小于7 710102 2 小于小于1.51.510103 3 1.01.0101

56、03 35.05.010103 3 1.51.510103 33.03.010104 43.03.010103 38.08.010104 4 4.04.010103 31.01.010105 5 5.05.010103 33.03.010105 5 5.05.010103 36.06.010105 5 2）琼脂糖凝胶（）琼脂糖凝胶（agarose gel)商品名商品名:Sepharose （瑞典）（瑞典）; Bio-Gel A (美国）美国）依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。度越大，网状结构越密集。Sepharose及及

57、Bio-gel A 型号型号 型号型号 使用范围（蛋白质的分子量）使用范围（蛋白质的分子量）含琼脂糖含琼脂糖（） 6B6BSepharoseSepharose 4B 4B 2B 2B10104 43 310106 610105 53 310107 710106 610108 8 6 64 4 2 2 6B 6BSepharoseSepharose CL 4B CL 4B 2B 2B 同上同上 同上同上 0.5m0.5m Bio-Gel A 1.5mBio-Gel A 1.5m 5m 5m 15m 15m 50m 50m 150m 150m101050050010103 310101500150

58、0101050005000404015000150001001005000050000 1000 1000150000150000 10108 86 64 42 2 1 1 3）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）l商品名为商品名为Bio-Gel,型号从型号从 Bio-Gel P2至至P-300，P值越大，孔径也越大。值越大，孔径也越大。l以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。剂聚合成的高分子聚合物。3. 操作：操作：1）凝胶的选择和处理）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶

59、根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。介质。 将干胶悬浮于将干胶悬浮于510倍的蒸馏水中倍的蒸馏水中 ，充分溶，充分溶胀，抽气，装柱。胀，抽气，装柱。2）柱的选择）柱的选择 采用采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速影响流速。3）加样）加样 体积不能过多，不超过床体积的体积不能过多，不超过床体积的5，脱盐时，脱盐时可在可在10左右。左右。4）洗脱）洗脱 洗脱液与平衡时用的洗脱液与平衡时用的buffer一致。一致。 洗速不可过快，保持恒速。洗速不可过快，保持恒速。5）胶的保存）胶的保存 洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，洗脱完毕后，凝胶柱已恢复

60、到上柱前的状态，不必再生处理。不必再生处理。 用用0.02%NaN3防腐。防腐。4. 应用应用 1）脱盐）脱盐) 生物大分子物质的分离纯化生物大分子物质的分离纯化 3）分子量的测定）分子量的测定 4）溶液浓缩）溶液浓缩 （五）亲和层析(Affinity Chromatography) 由吸附层析发展起来的由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。白质的最好方法。 1.1.原理原理 利用生物大分子间利用生物大分子间特异的亲和力特异的亲和力来纯化生物大分子，来纯化生物大分子，如：如：抗原抗原和和抗体抗体；酶酶和和底物底物或或辅酶辅酶或或抑制剂抑制剂；激素