ITC introduce(等温滴定量热)

1、Isothermal Titration Calorimetry 等温滴定量热ITC：测定分子相互作用的方法：测定分子相互作用的方法u在一次实验中，在一次实验中，ITC可以测定：可以测定：u结合的结合的亲和力常数（亲和力常数（K）；u结合反应中的结合反应中的焓变焓变和和熵熵变（变（H、S）；u结合位点结合位点数数（n）实验也可以测定有多个结合位点的样品实验也可以测定有多个结合位点的样品等温等温滴定量热仪滴定量热仪(ITC)神奇的微量热控制功率补偿Isothermal Titration Calorimetry实验流程实验流程u1) 样品池中加入待测样品池中加入待测大分子；大分子；u2) 参照池

2、中加入缓冲参照池中加入缓冲液；液；u3) 将待测配体吸入将待测配体吸入注射器中；注射器中；u4) 注射器置于样品池注射器置于样品池中；中；u5) 调整温度、搅拌速度和每次注射调整温度、搅拌速度和每次注射体积。体积。典型的典型的 ITC 数据数据上半部分表示每次注射采集的上半部分表示每次注射采集的数据；数据；下下半部分表示每次注射的释放的半部分表示每次注射的释放的热量；（热量；（上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图作图ITC 理论理论基础基础uG=-RT lnKBuG = H TS令人郁闷的公式说明了什么？令人郁闷的

3、公式说明了什么？1. 相同的相同的KD有着相同的有着相同的G；2. 相同的相同的G却有着不同的却有着不同的H与与S组合。组合。引发焓变和熵变的主要引发焓变和熵变的主要因素因素Enthalpy (-H) 焓变Hydrogen bonds氢键Ionic interactions离子作用特异性结合Entropy (+S)熵变Hydrophobic interactions疏水作用Conformational freedom构象自由度非特异性结合ITC 技术的应用技术的应用领域领域u分子相互作用分子相互作用：溶液溶液中的几乎所有天然状态分子：中的几乎所有天然状态分子： 包括蛋白质、包括蛋白质、核酸、多

4、肽核酸、多肽、药物分子、药物分子、脂、脂类、金属离子、小类、金属离子、小分子等等分子等等；u工艺工艺过程的开发和过程的开发和控制控制u酶动力学酶动力学u药物研发药物研发u非非生物系生物系统统抗生素抗性的菌种为什么能更好抗生素抗性的菌种为什么能更好的消灭抗生素的消灭抗生素DNA形成了三螺旋形成了三螺旋？药物结合的热动力学药物结合的热动力学特征特征一样的亲合力，不一样的一样的亲合力，不一样的微观世界微观世界HIVHIV蛋白酶抑制剂开发的蛋白酶抑制剂开发的“成长烦恼成长烦恼”ITCITC在小分子药物结构方面的在小分子药物结构方面的优化优化u抗疟疾新药就这样放弃吗抗疟疾新药就这样放弃吗？Kd = 76

5、 nMH = -6.0 kcal/molH = -4.8 kcal/mol-TS = 5.7 kcal/molKd = 0.5 nMH = -5.5 kcal/molH = -4.3 kcal/mol-TS = 2.2 kcal/mol酶反应动力学的酶反应动力学的研究研究u传统酶分析法的传统酶分析法的局限性局限性（连续（连续分析法，不连续分析法，分析法，不连续分析法，偶合分析偶合分析法）法）1. 1. 溶剂不透明或有混浊并对光谱溶剂不透明或有混浊并对光谱检测检测有干扰；有干扰；2. 2. 天然的、重组的或突变的天然的、重组的或突变的酶活酶活性低于性低于分析方法的检测限；分析方法的检测限；3.

6、3. 产物或底物没有光谱基团或产物或底物没有光谱基团或荧荧光基团光基团，或者标记的成本太高或太，或者标记的成本太高或太耗时；耗时；4. 4. 不连续分析要求多步进行；不连续分析要求多步进行；5. 5. 不存在直接的偶合反应；不存在直接的偶合反应；6. 6. 偶合分析不精确；偶合分析不精确；7. 7. 底物或酶活性不清楚；底物或酶活性不清楚；8. 8. 蛋白质功能不清楚。蛋白质功能不清楚。uITCITC的优点的优点1. 1. 方法开发简单；方法开发简单；2. 2. 只要反应过程中有热量变化，只要反应过程中有热量变化， ITC即即可作为普适的方法；可作为普适的方法；3. 3. 是一项灵敏的技术是一

7、项灵敏的技术-噪音水平噪音水平0.01cal/sec，利用现在的先进，利用现在的先进仪器仪器可可以获得很高的信噪比；以获得很高的信噪比；4. 4. 无需带荧光或光谱特征的底物无需带荧光或光谱特征的底物参与反参与反应应；5. 5. 单次实验即可获得数据；单次实验即可获得数据；6. 6. 适用于研究多种类型的酶适用于研究多种类型的酶;7. 7. 可以用于不透明的样品可以用于不透明的样品;8. 8. 所得数据可以与其它方法进行比较；所得数据可以与其它方法进行比较；9. 9. 除了获得热力学数据外还可以除了获得热力学数据外还可以获得动获得动力学数据。力学数据。酶反应动力学的酶反应动力学的研究研究(不一般的不一般的ITC曲线曲线）酶反应动力学酶反应动力学应用应用ITC ApplicationsITC ApplicationsEnzyme KineticsEnz