第5章体细胞胚胎发生 - 副本

1、第第5章章 体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生v1. 体细胞胚胎发生的概念体细胞胚胎发生的概念v1.1 胚状体（胚状体（embryoid，非合子胚），非合子胚）v在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体（图这种类似胚的结构称为胚状体（图41）。）。 图图41 胚状体胚状体1.2 体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）v由单细胞（体细胞）或一群细胞被诱导不

2、断由单细胞（体细胞）或一群细胞被诱导不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育过程称为体细胞胚胎发生。过程称为体细胞胚胎发生。v发生过程见图发生过程见图42（p61)。图图42 体细胞胚胎发体细胞胚胎发生的各个时期生的各个时期单个细胞经过反复的细单个细胞经过反复的细胞分裂形成一个小细胞胞分裂形成一个小细胞团，它经历球形期、心团，它经历球形期、心形期和鱼雷形期的发育形期和鱼雷形期的发育过程之后，最终由体细过程之后，最终由体细胞胚长成一个小植株。胞胚长成一个小植株。 （Dodds和和Roberts，1995）vKohlenbach关于胚的分类关于胚的分类:v(

3、1)合子胚：合子胚：由受精卵或合子形成的胚。由受精卵或合子形成的胚。v(2)非合子胚：非合子胚：由合子之外的细胞形成的胚。由合子之外的细胞形成的胚。v体细胞胚体细胞胚由孢子体细胞（除合子外）离体由孢子体细胞（除合子外）离体培养形成的胚。培养形成的胚。v非体细胞胚非体细胞胚即指芽、短枝、愈伤组织、花即指芽、短枝、愈伤组织、花粉胚、块茎、球茎等繁殖体。粉胚、块茎、球茎等繁殖体。v孤雌生殖胚孤雌生殖胚由未受精卵形成的胚。由未受精卵形成的胚。v孤雄生殖胚孤雄生殖胚由雄配子体（小孢子花粉粒）由雄配子体（小孢子花粉粒）形成的胚。形成的胚。2. 体细胞胚胎发生的途径体细胞胚胎发生的途径v直接途径：直接途径：

4、指从培养中的器官、组织、细胞指从培养中的器官、组织、细胞或原生质体某些部位的或原生质体某些部位的胚性细胞胚性细胞直接诱导分直接诱导分化出体细胞胚胎，中间不经过愈伤组织阶段化出体细胞胚胎，中间不经过愈伤组织阶段(图图43 A，图，图43 B)。 这种这种“胚性细胞胚性细胞”是在胚胎发生之前就已是在胚胎发生之前就已“决定决定”了的。了的。v间接途径：间接途径：指外植体先脱分化形成愈伤组织，指外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞，即重新再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎 (图图43 C)。图图43 植物体细胞胚胎发

5、生方式示意图植物体细胞胚胎发生方式示意图A由外植体外层细胞直接产生体细胞胚；由外植体外层细胞直接产生体细胞胚；B由外植体组由外植体组织内的细胞产生体细胞胚；织内的细胞产生体细胞胚；C愈伤组织表层细胞分化为愈伤组织表层细胞分化为体细胞胚体细胞胚(引自王亚馥等，引自王亚馥等，2000)v多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的。它通常分两个阶段完成：的。它通常分两个阶段完成：v胚胎发生丛（胚胎发生丛（embryogenic clump，EC）的形成的形成。v胚状体的发育胚状体的发育。EC在转入降低或去除生长在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成

6、胚状素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体发育。体发育。关于体细胞胚胎的起源：关于体细胞胚胎的起源：v体细胞胚胎究竟起源于单细胞还是多细胞，体细胞胚胎究竟起源于单细胞还是多细胞，目前仍然有争论。但研究结果发现，目前仍然有争论。但研究结果发现，绝大多绝大多数体细胞胚起源于单细胞（例子？）。数体细胞胚起源于单细胞（例子？）。但也但也有人认为它们起源于一个以上的细胞（证有人认为它们起源于一个以上的细胞（证据？）据？）v体细胞胚发生的体细胞胚发生的实质实质是细胞分化，即细胞在是细胞分化，即细胞在离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现遗传信息的表达。遗传信息的表达

7、。3. 影响体细胞胚胎发生的因子影响体细胞胚胎发生的因子v对于体细胞胚胎发生特别重要的是培养基中对于体细胞胚胎发生特别重要的是培养基中的两种成分，的两种成分，即生长素和氮源即生长素和氮源。 3.1生长素生长素v例子例子1：胡萝卜体细胞胚的发育（：胡萝卜体细胞胚的发育（p6566） v结论：结论：在增殖培养基中生长素的存在，对于在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。因此，可把增殖培养基看成是必不可少的。因此，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的体细胞胚胎发生的“诱导培养基诱导培养基”。 v例子例子2：咖啡体细胞胚的

8、发育（咖啡体细胞胚的发育（p66） v例子例子3：对甜橙驯化愈伤组织的详细研究，对甜橙驯化愈伤组织的详细研究，也证实了生长素对胚胎发生的重要作用也证实了生长素对胚胎发生的重要作用（p6667） 。v最终结论：最终结论：对于离体条件下体细胞胚胎发对于离体条件下体细胞胚胎发生来说，一个最低限度的内源或外源生长生来说，一个最低限度的内源或外源生长素是必不可少的。素是必不可少的。 v成功诱导体细胞胚胎发生的步骤：成功诱导体细胞胚胎发生的步骤：v第一步，在生长素浓度高第一步，在生长素浓度高(2,4-D 0.51 mgL)的培养基（增殖培养基）上的培养基（增殖培养基）上诱导和增殖诱导和增殖愈伤组织，高浓度

9、生长素诱导愈伤组织局部愈伤组织，高浓度生长素诱导愈伤组织局部细胞形成的分生组织细胞，称为胚性细胞团细胞形成的分生组织细胞，称为胚性细胞团(EC)。v第二步，将第二步，将EC转移到极低水平生长素转移到极低水平生长素(0.010.1 mgL)或完全无生长素的培养基或完全无生长素的培养基（胚发育培养基）上，（胚发育培养基）上，EC发育为成熟胚胎。发育为成熟胚胎。v其它激素的作用：其它激素的作用：v细胞分裂素：细胞分裂素：BAP可促进胡萝卜愈伤组织的可促进胡萝卜愈伤组织的细胞分裂，但抑制它的成胚潜力；细胞分裂，但抑制它的成胚潜力；ZT促进；促进；咖啡叶片愈伤组织要求激动素与生长素比例咖啡叶片愈伤组织要

10、求激动素与生长素比例高。高。v赤霉素：赤霉素：能抑制体细胞胚胎发生能抑制体细胞胚胎发生3.2 氮源氮源v除生长素外，培养基中氮源的形态也会显著除生长素外，培养基中氮源的形态也会显著影响离体条件下的胚胎发生。影响离体条件下的胚胎发生。体细胞胚诱导体细胞胚诱导和成熟需要大量氮素，通常为还原态氮如铵和成熟需要大量氮素，通常为还原态氮如铵盐。盐。v例子例子 1：野生胡萝卜体细胞胚诱导：野生胡萝卜体细胞胚诱导v例子例子 2：栽培胡萝卜体细胞胚诱导：栽培胡萝卜体细胞胚诱导v培养基中还原态氮和硝酸盐培养基中还原态氮和硝酸盐(NH4ClNO3)组合似乎更有利于许多培养体系的体细胞胚组合似乎更有利于许多培养体系

11、的体细胞胚胎诱导。胎诱导。v欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有一个最低数量的内源一个最低数量的内源NH4存在存在(每千克鲜重每千克鲜重的组织约的组织约5 mmol)。如果内源。如果内源NH4达不到这达不到这个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要使细胞内使细胞内NH4达到这个水平，不但需要有很达到这个水平，不但需要有很少量的外源少量的外源NH4存在存在(2.5 mmolL)，还需，还需要供应相对浓度很高的要供应相对浓度很高的NO3(60 mmolL)。v虽然对于胚胎发生来说，其他形式的还原态虽然对于胚胎发生来说，其他

12、形式的还原态氮都不如氮都不如NH4有效，但有效，但水解酪蛋白水解酪蛋白、谷氨酰谷氨酰胺胺和和丙氨酸丙氨酸等也可用做可靠的代替品。等也可用做可靠的代替品。3.3 其他因子其他因子v钾的浓度：钾的浓度：在野生胡萝卜中，高浓度的钾在野生胡萝卜中，高浓度的钾（20 mmolL）是胚胎发生所必需的。）是胚胎发生所必需的。 v溶解氧的含量：溶解氧的含量：培养基中溶解氧的含量应低培养基中溶解氧的含量应低于一个临界值（于一个临界值（1.5 mgL）。）。v活性炭：活性炭：培养基中加入活性炭也能提高胡萝培养基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率卜细胞胚胎发生的频率 。v某些挥发性和非挥发性物质：某些挥发

13、性和非挥发性物质：抑制愈伤组织抑制愈伤组织中的体细胞胚胎发生。中的体细胞胚胎发生。 4. 体细胞胚胎发生的解剖学和细胞学体细胞胚胎发生的解剖学和细胞学v在胡萝卜悬浮培养中，对愈伤组织形成和生在胡萝卜悬浮培养中，对愈伤组织形成和生长的解剖学和组织学的研究表明，在培养中长的解剖学和组织学的研究表明，在培养中存在着两种类型的细胞：存在着两种类型的细胞：v自由分散在培养基中的大而高度液泡化的自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，一般不具胚胎发生潜力。细胞，一般不具胚胎发生潜力。v成簇成团存在的体积小而细胞质致密的细成簇成团存在的体积小而细胞质致密的细胞，具成胚潜力。胞，具成胚潜力。 5.体细胞胚成

14、熟和植株发育体细胞胚成熟和植株发育v用脱落酸处理，体细胞胚可以发育成熟。用脱落酸处理，体细胞胚可以发育成熟。v高水平生长素能抑制茎尖分生组织发育，当高水平生长素能抑制茎尖分生组织发育，当胚性细胞悬浮液转入缺乏生长素的培养基时，胚性细胞悬浮液转入缺乏生长素的培养基时，胚胎常能发育成熟。胚胎常能发育成熟。v与与ABA结合，加入低水平的细胞分裂素（玉结合，加入低水平的细胞分裂素（玉米素米素0.1 molL）可能有利于低密度细胞培）可能有利于低密度细胞培养的胚胎发生。养的胚胎发生。v体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生可能重复发生可能重复发生，从成熟体细，从成熟体细胞胚上又形成一些胚胎发生的新中心。胞胚上又形

15、成一些胚胎发生的新中心。v体细胞胚的萌发阶段受到体细胞胚高度不同体细胞胚的萌发阶段受到体细胞胚高度不同步发育的不利影响。步发育的不利影响。 v各种物理因素也可能影响体细胞胚成熟，如各种物理因素也可能影响体细胞胚成熟，如温度、蔗糖浓度、光照等。温度、蔗糖浓度、光照等。v体细胞胚在无植物生长调节剂的琼脂培养基体细胞胚在无植物生长调节剂的琼脂培养基上萌发。单胚萌发的培养基最好添加低水平上萌发。单胚萌发的培养基最好添加低水平的玉米素的玉米素(0.lmmolL)。v小植株形成大量叶片以后，应将其移栽到营小植株形成大量叶片以后，应将其移栽到营养钵或蛭石中继续生长和发育。养钵或蛭石中继续生长和发育。6.体细

16、胞胚与合子胚的比较体细胞胚与合子胚的比较v自学内容（自学内容（p7172）7. 胚性培养物形态发生潜能的丧失胚性培养物形态发生潜能的丧失v7.1 遗传假说遗传假说v培养细胞中培养细胞中细胞核物质变化细胞核物质变化，如多倍性、非，如多倍性、非整倍性和染色体结构突变，可能与长期培养整倍性和染色体结构突变，可能与长期培养物器官发生或胚胎发生潜能丧失有关。这种物器官发生或胚胎发生潜能丧失有关。这种由遗传原因造成的形态发生潜力的丧失是由遗传原因造成的形态发生潜力的丧失是不不可逆可逆的。的。 7.2 生理假说生理假说v在某些情况下，形态发生潜力的下降在某些情况下，形态发生潜力的下降可能是可能是由于细胞或组

17、织内激素平衡关系的改变造成由于细胞或组织内激素平衡关系的改变造成的，或是由于细胞对外源生长调节物质敏感的，或是由于细胞对外源生长调节物质敏感性的改变造成的。性的改变造成的。在这种情况下，细胞虽然在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但不一定就丧失停止了器官和胚胎的分化，但不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部处理条件，有可能够恢复细胞形果改变外部处理条件，有可能够恢复细胞形态发生的潜能（器官和胚胎分化）。态发生的潜能（器官和胚胎分化）。7.3竞争假说竞争假说v在复合多细胞外植体中，只有少数细胞能产在复合多细胞外植体中，只有少数

18、细胞能产生胚性细胞团，其余细胞没有细胞全能性。生胚性细胞团，其余细胞没有细胞全能性。按照竞争假说，按照竞争假说，在有利于非胚性细胞生长的在有利于非胚性细胞生长的条件下，外植体中的非胚性细胞大量增殖，条件下，外植体中的非胚性细胞大量增殖，结果在不断反复继代培养的过程中导致胚性结果在不断反复继代培养的过程中导致胚性细胞逐渐消失。细胞逐渐消失。到了一定时期之后，培养物到了一定时期之后，培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。复它们的胚胎发生能力就不可能了。7.3竞争假说竞争假说v如果培养物中尚存少量胚性细胞，它们由于如果培养物

19、中尚存少量胚性细胞，它们由于非胚性细胞的抑制作用，不能表达自身的细非胚性细胞的抑制作用，不能表达自身的细胞全能性，此时可以通过改变培养基成分，胞全能性，此时可以通过改变培养基成分，选择性地增殖具有胚发生全能性的细胞，有选择性地增殖具有胚发生全能性的细胞，有可能恢复培养物形态发生的潜能。可能恢复培养物形态发生的潜能。8. 体细胞胚胎发生的实际应用体细胞胚胎发生的实际应用v8.1 无性繁殖无性繁殖v由于胚性细胞生长和随后的体细胞胚发育可由于胚性细胞生长和随后的体细胞胚发育可以在液体培养基中进行，所以将体细胞胚发以在液体培养基中进行，所以将体细胞胚发生与工程技术结合，可以建立大规模的机械生与工程技术

20、结合，可以建立大规模的机械化或自动化培养体系。这种培养体系能循环化或自动化培养体系。这种培养体系能循环生产大量的繁殖体（体细胞胚胎），且成本生产大量的繁殖体（体细胞胚胎），且成本低廉。低廉。v通过重复体细胞胚胎发生形成体细胞胚无性通过重复体细胞胚胎发生形成体细胞胚无性系。系。8.2 人工（合成）种子的制备人工（合成）种子的制备v植物人工种子（植物人工种子（plant artificial seed）概念）概念最早由最早由Murashige（1978）提出，它是）提出，它是指将指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状完

21、整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体等）包埋在含有营养物质和具有保护功能体等）包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够发芽出苗的外壳内形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体的颗粒体（图（图44，图，图45）。）。图图44 人工种子人工种子图图45人工种子萌发形成的幼苗人工种子萌发形成的幼苗v通过用人工种皮包被体细胞胚而制造人工种通过用人工种皮包被体细胞胚而制造人工种子（或称合成种子），用以子（或称合成种子），用以繁殖遗传工程植繁殖遗传工程植物、减数分裂不稳定的基因型、自交不亲合物、减数分裂不稳定的基因型、自交不亲合植物、稀有的和珍贵的物种或远缘杂交种，植物、稀有的和珍贵

22、的物种或远缘杂交种，以及通过人工授粉而得到的杂种等以及通过人工授粉而得到的杂种等是当前的是当前的一个研究热点之一。一个研究热点之一。8.2.1 单胚人工种子的制造过程单胚人工种子的制造过程v人工种子由包裹在防护层中的体细胞胚组成人工种子由包裹在防护层中的体细胞胚组成（图（图46），在制造单胚人工种子的时候，），在制造单胚人工种子的时候，主要采用诸如藻酸钠一类的水凝胶作为体细主要采用诸如藻酸钠一类的水凝胶作为体细胞胚的包被物质。胞胚的包被物质。v当体细胞胚与藻酸钠混合以后，再滴人到硝当体细胞胚与藻酸钠混合以后，再滴人到硝酸钙或氯化钙溶液（酸钙或氯化钙溶液（100 mmolL）中，）中，30 mi

23、n内表面即可完全络合，形成一层持久的内表面即可完全络合，形成一层持久的种皮（种皮（图图47 ，图，图48 ）。图图46 人工种子示意图（引自人工种子示意图（引自Redenbaugh，1990）图图4 7 用漏斗分离器生产藻酸钙包被的人工种子用漏斗分离器生产藻酸钙包被的人工种子 （引自（引自Redenbaugh，1990） 图图4 8 人工种子的制作人工种子的制作表表4 41 1 可用于包被体细胞胚的几种水凝胶可用于包被体细胞胚的几种水凝胶水凝胶水凝胶浓度浓度(，WV)络合剂络合剂浓度浓度(mmolL)藻酸钠藻酸钠0.55.0钙盐钙盐30100藻酸钠藻酸钠及明胶及明胶2.05.0钙盐钙盐3010

24、0角叉藻聚糖角叉藻聚糖及洋槐豆胶及洋槐豆胶0.20.80.41.0KCl或或NH4CI500v表表41列出了可用做种皮材料的各种水凝胶。列出了可用做种皮材料的各种水凝胶。 v此外，在种皮基质中还可加入一些对体细胞此外，在种皮基质中还可加入一些对体细胞胚有益的物质，如能促进生长的微生物、营胚有益的物质，如能促进生长的微生物、营养物质、生长调节物质、杀虫剂以及用于旱养物质、生长调节物质、杀虫剂以及用于旱地播种的亲水性化合物等作为人工胚乳。地播种的亲水性化合物等作为人工胚乳。 8.2.2 工业化生产人工种子工业化生产人工种子v首先首先，必须建立起适当的组织培养技术体系，必须建立起适当的组织培养技术体

25、系，从中能产生高质量的大小一致和发育期同步从中能产生高质量的大小一致和发育期同步的、功能像合子胚一样的体细胞胚。的、功能像合子胚一样的体细胞胚。 v促成体细胞胚同步发育的途径：（促成体细胞胚同步发育的途径：（p7576）v（1）使用）使用DNA合成抑制剂或低温培养合成抑制剂或低温培养v（2）过筛）过筛v（3）利用渗透压控制胚胎发育同步性）利用渗透压控制胚胎发育同步性 v其次其次，还必须建立大规模自动化的液体培养，还必须建立大规模自动化的液体培养体系，以便生产数量足够的体细胞胚。体系，以便生产数量足够的体细胞胚。v此外此外，生产具有适当水分含量的种皮的方法，生产具有适当水分含量的种皮的方法，掺入

26、营养物质和其他附加物质的方法，以及掺入营养物质和其他附加物质的方法，以及用于包埋体细胞胚的设备等，也都有待改进。用于包埋体细胞胚的设备等，也都有待改进。8.3 分离可再生的原生质体的材料分离可再生的原生质体的材料v胚性愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚已作胚性愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚已作为许多植物原生质体分离的材料。这些培养为许多植物原生质体分离的材料。这些培养体系中的细胞或组织在培养过程中表现出再体系中的细胞或组织在培养过程中表现出再生植株的潜能，为此，其原生质体也有形成生植株的潜能，为此，其原生质体也有形成完整植株的能力。在禾本科植物、松柏类植完整植株的能力。在禾本科植物、松柏类植物和柑橘植物中，胚性培养物作为可再生的物和柑橘植物中，胚性培养物作为可再生的原生质体材料具有特别的价值。原生质体材料具有特别的价值。8.4 遗传转化遗传转化v遗传转化从培养物分离的单细胞，然后将其培养在遗传转化从培养物分离的单细胞，然后将其培养在选择培养基上（营养培养基含抗生素、卡那霉素），选择培养基上（营养培养基含抗生素、卡那霉素），形成愈伤组织系，最后在除去生长素的培养基上形形