第5章 目的基因的克隆与基因文库的构建

1、基基 因因 工工 程程复旦大学 刘明秋1第五章第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建但是，但是，前提条件前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，是从生物体基因组中分离克隆目的基因， 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目

2、的基因，然后将之克隆表达。扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 基因工程或基因工程或DNA重组技术重组技术三大用途三大用途: :1.1.或确定基因的表达调控机制和生物学功能；或确定基因的表达调控机制和生物学功能；2.2.或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）；或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）；3.3.或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。2第五章第五章 目的基因的克隆与基因文

3、库的构建鸟枪法鸟枪法cDNA法法PCR法法化学合成法化学合成法基因文库的构建基因文库的构建3一一 鸟枪法鸟枪法第五章第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建1.1 鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略1.2 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进1.3 鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性41.1 鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的

4、基因。鸟枪法适重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离用于原核细菌目的基因的克隆分离 51.1 鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体染色体DNA的切断的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控 部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交

5、法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞的受体细胞. .转化转化受体细胞受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基

6、因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 61.2 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率. 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 71.2 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb的的SalI片段中，将染色体片段中，将染色体DNA用用SalI切切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切

7、下开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后片段，然后与载体进行拼接与载体进行拼接在连接前将在连接前将DNA片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb81.2 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进冻融法冻融法滤纸法滤纸法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法凝胶凝胶DNA片段片段 91.3 1.3 鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目

8、的基因不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构10二二 cDNA法法第五章第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建 2.1 cDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略2.2 cDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序 2.3 cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性112.1 cDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略mRNA2.1.1 c2.1.1 cDNA第一链的合成第一链的合成 ：（：（2种方法：种方法： oligo dT , ,随机引物随机引物）5ppp5G G AAAAAA

9、AAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dNTPs122.1.2 c2.1.2 cDNA第二链的合成第二链的合成 煮沸煮沸NaOH 降解降解mRNA自身引导法：自身引导法：获得的双链获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp

10、5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1132.1.2 c2.1.2 cDNA第二链的合成第二链的合成 DNApol I dNTPsRNaesH置换合成法：置换合成法：避免了避免了cDNA双链末端的缺损双链末端的缺损5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55 AAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T

11、4-DNA ligase142.1.2 c2.1.2 cDNA第二链的合成第二链的合成 dCTPTdT引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火退火KlenowdNTPs152.1 cDNA法克隆目的基因的基本战略法克

12、隆目的基因的基本战略2.1.3 双链cDNA的克隆 双链平头的双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，平头两端分别接同聚物尾，最好是最好是AT同聚物尾，这样重组同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收以便插入片段回收 161718192.2 cDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基

13、本程序2.2.1 完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等 202.2 cDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序2.2.2 特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等 21cDNA法

14、分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序2.2.3 差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能 222.2.3 差异分离程序 多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链双链cDNA单链单链cDNA提取提取mRNA合成合成cDNA合成第二链合成第二链克隆克隆提取mRNA共价交联上柱原位原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆232.3

15、 cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感,分 离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因 243 PCR法第五章第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建 n1985年美国年美国Cetus公司的公司的Mullis等人建立起了一套大量快速地等人建立起了一套大量快速地扩增特异扩增特异DNA片段的系统，即聚合酶链式反应片段的系统，即聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)系统。系统。nMullis在在1993年获得了

16、诺贝尔化学奖。在一项年获得了诺贝尔化学奖。在一项实用性的发明实用性的发明做做出后仅仅出后仅仅8年就荣质诺贝尔奖，这在科学史上是绝无仅有的，这年就荣质诺贝尔奖，这在科学史上是绝无仅有的，这也从另一个侧面说明了也从另一个侧面说明了PCR技术的重大价值。技术的重大价值。nPCR技术自问世以来已在生物学、医学、考古学、人类学等许技术自问世以来已在生物学、医学、考古学、人类学等许多领域内获得了广泛的应用，可以说多领域内获得了广泛的应用，可以说PCR技术给整个分子生物技术给整个分子生物学领域带来了一场变革。同样学领域带来了一场变革。同样PCR技术技术也成为在也成为在DNA重组技术重组技术领域获得领域获得外

17、源基因外源基因的一个有效手段，的一个有效手段，PCR技术就是在体外通过技术就是在体外通过酶促反应成百万倍地扩增一段目的基因。酶促反应成百万倍地扩增一段目的基因。25它要求反应体系具有以下条件：它要求反应体系具有以下条件：要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNADNA引物引物( (约约2020个碱基个碱基左右左右) )；具有热稳定性的酶如具有热稳定性的酶如Taq DNATaq DNA聚合酶；聚合酶；dNTP; dNTP; 作为模板的目的作为模板的目的DNADNA序列。序列。一般一般PCRPCR反应可扩增出反应可扩增出1005000 bp1

18、005000 bp的目的基因。的目的基因。3.1 PCR法定向扩增目的基因的基本原理使用PCR法克隆目的基因的前提条件是： 已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物2655目的基因目的基因5变性变性加热加热55引物引物退火退火55底物底物聚合聚合5555加热加热变性变性5555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加热加热变性变性引物引物退火退火底物底物聚合聚合12327 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP

19、具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase，末端脱氧核苷酸转移酶)末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆 3.2 PCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序55AATT55PCR扩增产物T 载体T7lacZ MCSoriApr283.3 PCR方法的改进o 在获得目的基因时，除了要用到普通的PCR方法外，还要用到一些改进的PCR方法，现分别介绍如下： 293.3.1 锚定PCR(anchored PCR)o 锚定PCR特别适合于扩增那些只知道一端序列的目的DNA。o 例如，

20、对于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段， 可以通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增(图234)。303.3.23.3.2反向反向PCR(inverse PCR)PCR(inverse PCR)o 反向反向PCRPCR特别适用于扩增已知序特别适用于扩增已知序列的两端的未知序列。列的两端的未知序列。o 具体方法：选择一个在已知序具体方法：选择一个在已知序列中没有，而在其两侧都存在列中没有，而在其两侧都存在的限制性内切酶位点，用相应的限制性内切酶位点，用相应的限制性内切酶酶解后，将酶的限制性内切酶酶解后，将酶切的片段在

21、连接酶的作用下环切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于环状分化，使得已知序列位于环状分子上。根据已知序列的两端序子上。根据已知序列的两端序列设计两个引物，以环状分子列设计两个引物，以环状分子为模板，就可以扩增出已知序为模板，就可以扩增出已知序列两侧的未知序列列两侧的未知序列( (图图235)235)。314 化学合成法第五章第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建4.1 化学合成法的基本战略4.2 化学合成的单元操作4.3 DNA化学合成的用途324.1 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略4.1.1 全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：l 小片段

22、粘接法： 混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 334.1 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略4.1.1 全基因合成l 补钉延长法： 混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合344.1 化学合成法的基本战略4.1.1 全基因合成l 大片段酶促法： 混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合354.1

23、 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略4.1.1 全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的的单片段愈短，收率单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成则合成50个碱基长的个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率

24、只有7.7%364.1 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略4.1.2 探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的编码的DNADNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNAcDNA法得到法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时由于大多

25、数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在17-2017-20个核苷酸之间个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域探针内部不应出现可能的互补区域374.1 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略4.1.2 探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列 CysMet AspGluMetLys ArgAsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C C

26、GA CGG CGT CGC设计的简并探针序列TGTATGGACGAAATGATGTATGGATGAAATGATGCATGGACGAGATGATGCATGGATGAGATGA 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计expressed sequence tag384.2 化学合成的单元操作化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、激活、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前

27、者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。（固定，每一步可以过量反应试剂，保证反应完全进行）394.2 化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT： 二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基激活激活缩合缩合氧化氧化脱取代基脱取代基玻璃珠玻璃珠连接臂连接臂40表2 2 化 学 合 成D N A的 产 率 与 偶 联 效 率 的 关 系 偶 联 效 率 D N A合 成 的 产 率 （ ） （ ） 20碱 基 40碱 基 60碱 基

28、 80碱 基 100碱 基 90 95 98 99 99.5 12 36 67 82 90 1.5 13 45 67 82 0.18 4.6 30 55 74 0.02 1.7 20 45 67 0.003 0.6 13 37 61 为了保证为了保证DNADNA化学合成的产量，要求每步的效率都在化学合成的产量，要求每步的效率都在9898以上以上( (表表2 22)2)，所以在反应过程中要对偶联效率加以监控。常用的方法是，所以在反应过程中要对偶联效率加以监控。常用的方法是利用分光光度计检测在每步反应中脱下的三苯甲基的浓度，从而利用分光光度计检测在每步反应中脱下的三苯甲基的浓度，从而推算出反应的效

29、率。推算出反应的效率。414.3 DNA化学合成的用途化学合成的用途4.3.1 合成天然基因合成天然基因4.3.2 4.3.2 修饰改造基因修饰改造基因 4.3.4 设计新型基因设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 425 基因文库的构建第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建5.1 基因文库的基本概念5.2 基因文库的构建程序5.3 基因组文库重组克隆的排序435.1 基因文库的基本概念基因文库的基本概念5.1.1 基因库与基因文库基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然

30、存在）特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因）（含有全部基因） 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）（含有全部蛋白质编码的结构基因） 445.1 基因文库的基本概念5.1.2 基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自

31、材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种种类不同类不同（即基因的表达谱不同），（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的因此同种生物体的cDNA文库文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库文库的信息量远小于基因组文库4546o 当目的基因在某一细胞类型中高表达时，这种利用当目的基因在某一细胞类型中高表达时，这种利用mRNA的克隆方法显得特别有用。的克隆方法显得特别有用。例如，

32、麦醇溶蛋白是小麦中一种重要的营养蛋白，在发育例如，麦醇溶蛋白是小麦中一种重要的营养蛋白，在发育的小麦种子中，编码的麦醇溶蛋白基因高水平表达。的小麦种子中，编码的麦醇溶蛋白基因高水平表达。这些细胞中总这些细胞中总mRNA的的30是麦醇溶蛋白的是麦醇溶蛋白的mRNA。显然，如果从小麦种子中克隆显然，如果从小麦种子中克隆mRNA，将会得到大量特将会得到大量特异表达麦醇溶蛋白的克隆。异表达麦醇溶蛋白的克隆。47o得到的得到的cDNAcDNA克隆代表了最初制备时的克隆代表了最初制备时的mRNAmRNA。mRNA可通过可通过cDNA进行进行克隆克隆485.1 基因文库的基本概念基因文库的基本概念5.1.3

33、 基因文库的完备性基因文库的基因文库的完备性完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中：其中： P = P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小 / / 生物基因组的大小生物基因组的大小例如，人的单倍体例如，人的单倍体DNA总长为总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的

34、平均基因文库中克隆片段的平均大小为大小为15 kb，则构建一个完备性为则构建一个完备性为0.9的的基因文库至少需要基因文库至少需要45万个克隆；万个克隆；而当完备性提高到而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要时，基因文库至少需要180万个克隆万个克隆495.1 基因文库的基本概念5.1.4 基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选505.2

35、基因文库的构建程序基因文库的构建程序5.2.1 基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNA在分离纯化操作中应在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。尽量避免过度的断裂。制备的制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAA用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在的长度一般在100 kb左右左右如果先将细胞固定在低融

36、点凝如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有胶中，然后置入含有SDS、蛋蛋白酶白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的大小的DNA片段片段515.2 基因文库的构建程序5.2.2 基因组DNA的切割 用于用于基因组基因组文库构建的文库构建的DNA片段的切割一般采用片段的切割一般采用超声波处理和超声波处理和限制性内切酶限制性内切酶部分酶切部分酶切两种方法，其目的是：两种方法，其目的是： 第一，保证第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证DNA片段大小均一片段大小均一超声波处理超声波处理后的后的DNA片段呈平头

37、末端，需加装人工接头片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：如：Sau3AI或或MboI等，这样等，这样DNA酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！片段随机连为一体！52535.2 基因文库的构建程序5.2.3 载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如

38、动植物和人类）需使用YAC或BAC载体l-DNA 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体.通常选质粒 上述几种载体的最大装载量如下：质粒考斯质粒15 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌5455n柯斯质粒上带有多个单克隆位点柯斯质粒上带有多个单克隆位点(RE2)，两个两个cos位点，位点，DNA复制启始位点和抗生素抗性基因复制启始位点和抗生素抗性基因，在两个，在两个cos位点之间还有一个限制性内切酶位位点之间还有一个限制性内切酶位点点(RE1)。n克隆时，先用克隆时，先用REl将

39、柯斯质粒切开，再用单克隆将柯斯质粒切开，再用单克隆位点中的某个限制性内切酶位点中的某个限制性内切酶(RE2)酶解，然后将酶解，然后将用经用经RE2酶解的长约酶解的长约40kb大小的外源大小的外源DNA片段片段克隆进单克隆位点，形成一个长约克隆进单克隆位点，形成一个长约50kb的线性的线性DNA分子，分子，n这个这个DNA分子由于含有两个相距约分子由于含有两个相距约50kb的的cos位点，因此可以在体外包装进入空的噬菌体头位点，因此可以在体外包装进入空的噬菌体头部，没有插入部，没有插入DNA的空载体或插入片段大小不的空载体或插入片段大小不符合要求的重组分子则无法包装。符合要求的重组分子则无法包装

40、。n重组噬菌体的重组噬菌体的DNA可以通过侵染大肠杆菌而传可以通过侵染大肠杆菌而传递。一旦进入大肠杆菌，由于进入头部时两个递。一旦进入大肠杆菌，由于进入头部时两个cos位点都已切割掉了，它们通过碱基配对可以位点都已切割掉了，它们通过碱基配对可以将整个将整个DNA分子变成一个环状的质粒分子，复分子变成一个环状的质粒分子，复制起始位点的存在又可以保证其在宿主细胞中制起始位点的存在又可以保证其在宿主细胞中稳定复制保存，转化的细胞可以通过稳定复制保存，转化的细胞可以通过 抗生素进抗生素进行筛选。行筛选。n柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克隆。柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克隆。565.2 基因文库的

41、构建程序基因文库的构建程序5.2.4 从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因 大型基因组大型基因组文库文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选正选择筛选程序程序（如（如抗药性筛选法抗药性筛选法、酵母双杂交技术酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮文库筛选均需多轮操作步骤操作步骤57o 对细菌、酵母和真菌来讲，一个完整的

42、基因组文对细菌、酵母和真菌来讲，一个完整的基因组文库所需的克隆数还是在可操作的范围内的。库所需的克隆数还是在可操作的范围内的。 但植物和动物的一个完整的基因组文库包含了太但植物和动物的一个完整的基因组文库包含了太多的不同的克隆，如要从中鉴定出目的克隆，工多的不同的克隆，如要从中鉴定出目的克隆，工作量是相当庞大的。作量是相当庞大的。o 对于这些生物体来说，只针对某一特定细胞类型对于这些生物体来说，只针对某一特定细胞类型而非整个生物体的基因文库，可能更为有用。而非整个生物体的基因文库，可能更为有用。58基因文库的筛选基因文库的筛选o 构建了文库以后，就需要鉴定出文库中带有目的构建了文库以后，就需要

43、鉴定出文库中带有目的序列的克隆。有序列的克隆。有3种通用的鉴定方法，种通用的鉴定方法，o 一是用标记的一是用标记的DNA探针作探针作DNA杂交；杂交；o 二是用抗体对蛋白产物进行免疫杂交；二是用抗体对蛋白产物进行免疫杂交；o 三是对蛋白的活性进行鉴定。三是对蛋白的活性进行鉴定。595.2.4.1 DNA杂交筛选杂交筛选o DNA杂交成功与否取决于探针和目的序列之杂交成功与否取决于探针和目的序列之间的碱基对能否形成稳定的碱基配对。间的碱基对能否形成稳定的碱基配对。o 双链双链DNA分子可以通过热处理或碱变性的方分子可以通过热处理或碱变性的方法变性成单链的法变性成单链的DNA分子。分子。o 如果加

44、热后迅速冷却，那么破坏了氢键的如果加热后迅速冷却，那么破坏了氢键的DNA链就会保持单链的形式链就会保持单链的形式(变性变性)。o 如果加热后温度缓慢下降，那么如果加热后温度缓慢下降，那么DNA的双螺的双螺旋的构型就会在碱基配对作用下重新恢复旋的构型就会在碱基配对作用下重新恢复(复复性性 ) 。 加 热 后 慢 慢 冷 却 的 过 程 称 为 退 火。 加 热 后 慢 慢 冷 却 的 过 程 称 为 退 火(annealing)。o 退火后有的退火后有的DNA分子的两条链分别来自于不分子的两条链分别来自于不同的同的DNA分子，即形成了杂合分子，即形成了杂合DNA分子。分子。60DNA杂交筛选(2

45、)o 在DNA杂交实验中，目的DNA先变性，然后把单链的目的DNA在高温下结合到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。单链DNA探针用放射性同位素或其他物质进行标记，与膜一起保温。o 如果DNA探针与样品中的某一个核苷酸序列互补的话，那么通过碱基配对的作用就会形成杂合分子(图2-21)，o 最后通过放射自显影或其他方式检测出来。o 通常，探针的长度在100 bp至 1 kb之间，但有时用小于100 bp 或大于 1 kb 的探针，也能得到较好的结果。o 杂交反应的条件非常重要，稳定的结合往往需要在至少50个碱基的片段里80的碱基完全配对。61探针的同位素标记oDNA探针的标记方法有多种，随机引物法即是其中的

46、一种。随机引物法用的是人工合成的随机六聚核苷酸，把这些六聚核苷酸的混合物作为DNA合成的引物。根据概率来算，这些引物至少会有一些与探针DNA模板互补(图222)。o当寡聚引物与变性的探针DNA混合后，加入4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)和大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段，Klenow片段保持了DNA聚合酶和3外切酶的活性，但它没有5外切酶的活性，因而不会降解新合成的DNA链。o这些随机引物在酶的作用下，合成新的DNA链。如果使用放射性同位素标记，就在其中的一种脱氧核糖核苷三磷酸的。磷酸位置上换上同位素32P(图2-23)，这样，新合成的DNA分子就被同位素标记上了。62非同位素

47、标记法非同位素标记法o 可以把生物素可以把生物素(biotin)等非同位素标记物连接到其中一种脱氧等非同位素标记物连接到其中一种脱氧核糖核苷三磷酸中，然后掺入到新合成的核糖核苷三磷酸中，然后掺入到新合成的DNA链中。要检测这链中。要检测这种标记需要利用一种中间化合物，即链霉抗生物素蛋白种标记需要利用一种中间化合物，即链霉抗生物素蛋白(streptavidtn)，它能与生物素结合，同时它自身带有某种酶，它能与生物素结合，同时它自身带有某种酶，可以催化形成有颜色的化合物，最后的结果通过肉眼就能分辨可以催化形成有颜色的化合物，最后的结果通过肉眼就能分辨出来。出来。GCTTGAGCAGTAACCTG生

48、色底物生色底物颜色产物颜色产物Biotin 生物素生物素烷烃连接臂烷烃连接臂Avidin 生物素结合蛋白生物素结合蛋白显色酶显色酶63用于筛选基因文库的探针来源用于筛选基因文库的探针来源o 一是从近缘生物体中克隆的一是从近缘生物体中克隆的DNA用作异源探针，用作异源探针，这种情况的杂交条件应该调整到要允许一定程度这种情况的杂交条件应该调整到要允许一定程度的探针与目标的探针与目标DNA之间的错配，以补偿这两种的之间的错配，以补偿这两种的序列之间自然存在的差异；序列之间自然存在的差异；o 二是根据从一个目的基因编码的蛋白的已知氨基二是根据从一个目的基因编码的蛋白的已知氨基酸序列推导出可能的核苷酸序

49、列。通过化学合成酸序列推导出可能的核苷酸序列。通过化学合成的方法来合成一个探针。的方法来合成一个探针。64基因文库的筛选过程o 基因文库通常先涂布到母基因文库通常先涂布到母盘培养基上，然后再把这盘培养基上，然后再把这些菌落的样品吸印到硝酸些菌落的样品吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然纤维素膜或尼龙膜上。然后裂解细胞，去掉蛋白质，后裂解细胞，去掉蛋白质，使使DNA变性，结合在膜上变性，结合在膜上; 这时加入标记的探针，如这时加入标记的探针，如果出现杂交信号，那么从果出现杂交信号，那么从母盘上就可以把包含杂交母盘上就可以把包含杂交信号的菌落分离、培养出信号的菌落分离、培养出来来(图图224)。65筛

50、选结果的分析筛选结果的分析o 由于大多数基因文库都是通过由于大多数基因文库都是通过部分酶解的方式构建部分酶解的方式构建的，因此杂的，因此杂交一般都会得到多个阳性克隆。要鉴定哪一个克隆包含了目的交一般都会得到多个阳性克隆。要鉴定哪一个克隆包含了目的基因的完整的序列，就要通过凝胶电泳和限制性内切酶酶谱先基因的完整的序列，就要通过凝胶电泳和限制性内切酶酶谱先初步分析出每一个插入片段的长度，同时也鉴定出完全相同的初步分析出每一个插入片段的长度，同时也鉴定出完全相同的克隆以及有重叠序列的克隆。通过序列的重叠，就可能得到一克隆以及有重叠序列的克隆。通过序列的重叠，就可能得到一个完整的基因，如果一个克隆中的

51、插入大到可以包含一个完整个完整的基因，如果一个克隆中的插入大到可以包含一个完整的基因，那么就可以通过的基因，那么就可以通过DNA测序来认定，看它是否有起始测序来认定，看它是否有起始密码子和终止密码子。密码子和终止密码子。o 在一个文库里人们有可能得不到某个基因的完整序列，这就需在一个文库里人们有可能得不到某个基因的完整序列，这就需要用另一个不同的限制性内切酶去构建另一个文库，再用原先要用另一个不同的限制性内切酶去构建另一个文库，再用原先的探针进行筛选。还有就是构建一种插入片段比原来核基因的的探针进行筛选。还有就是构建一种插入片段比原来核基因的平均长度大的基因文库，以增加获得完整目的基因的可能性

52、。平均长度大的基因文库，以增加获得完整目的基因的可能性。665.2.4.2 通过免疫反应筛选o如果没有如果没有DNA探针，还可以用其他的方探针，还可以用其他的方法来筛选文库。法来筛选文库。o例如，如果一个目的例如，如果一个目的DNA序列可以转录序列可以转录和翻译，那么只要出现这种蛋白，甚至只和翻译，那么只要出现这种蛋白，甚至只需要蛋白的一部分，就可以用免疫的方法需要蛋白的一部分，就可以用免疫的方法来检测。来检测。o从技术上讲，这个过程与从技术上讲，这个过程与DNA杂交过程杂交过程有许多共同之处。先对文库中所有的克隆有许多共同之处。先对文库中所有的克隆都在培养基上进行培养，然后转到膜上，都在培养

53、基上进行培养，然后转到膜上，对膜进行处理，使菌裂解，同时释放出蛋对膜进行处理，使菌裂解，同时释放出蛋白质附着于膜上，这时加入针对某一目的白质附着于膜上，这时加入针对某一目的基因编码的蛋白的抗体基因编码的蛋白的抗体(称为一抗称为一抗)，反，反应后多余的杂物经洗脱除去；再加入针对应后多余的杂物经洗脱除去；再加入针对一抗的第二种抗体一抗的第二种抗体(称为二抗称为二抗)，二抗上，二抗上通 常 都 连 有 一 种 酶 ， 如 碱 性 磷 酸 酶通 常 都 连 有 一 种 酶 ， 如 碱 性 磷 酸 酶(alkaline phosphatase)等，再次洗等，再次洗脱后就加入该酶的一种无色底物。如果二脱后

54、就加入该酶的一种无色底物。如果二抗与一抗结合，无色底物就会被连在二抗抗与一抗结合，无色底物就会被连在二抗上的酶水解，从而产生一种有颜色的产物上的酶水解，从而产生一种有颜色的产物(图图225)。n在培养基上培养菌落在培养基上培养菌落n 转膜转膜n菌落影印在膜上菌落影印在膜上n 裂解裂解n菌落的蛋白质裸露出来菌落的蛋白质裸露出来n 加一抗加一抗n一抗与裸露的蛋白质结合一抗与裸露的蛋白质结合n 洗去游离的一抗洗去游离的一抗n 加二抗加二抗n二抗与一抗结合二抗与一抗结合n 洗去游离的二抗洗去游离的二抗n 加显色剂加显色剂n 显色显色n找出阳性克隆找出阳性克隆 图图225 通过免疫反应进行基因文库的筛选

55、通过免疫反应进行基因文库的筛选67通过免疫反应筛选(2)o 根据发生颜色变化的克隆所在的位置，找出原始的培养板上与之相对应的克隆，这个克隆可能包含一个完整的基因，也可能包含基因的一部分，但即使是基因的一部分，它也能产生足以让一抗识别的蛋白结构域区域。o 因此，还需要进一步鉴定阳性克隆中包含的基因是否完整。 685.2.4.3 通过酶活性筛选通过酶活性筛选o如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，那么就可以通过检查酶活性存在与否来筛选目的基因。o例如，多种生物体中编码淀粉酶、葡聚糖内切酶(endoglucanase)和葡糖苷酶(-glucosidase)的基因就是通过这种方法分离出来的，即先把核基因文库转入一选择性菌株，铺在带有一种特定底物的培养基上培养，筛选那些可以利用这种底物的克隆。o如果要寻找的基因所编码的蛋白对突变的宿主菌细胞的生长极为重要的话，那么将基因文库导人这些突变的细胞以后，那些能在没有所需底物的基本培养基上生长的细胞中必定就带有一个具功能的目的基因。o运用这种遗传互补的方法已经成功地分离出了许多具有重要功能的基因，包括那些与