第1章 色谱分析法和气相色谱法

1、第1页食品学院食品学院 色谱分析法色谱分析法色谱法导论色谱法导论气相色谱法气相色谱法第2页食品学院食品学院 本章重点：本章重点： 1. 理解色谱分离的基本原理；理解色谱分离的基本原理； 2. 掌握色谱法的基本概念和术语；掌握色谱法的基本概念和术语； 3. 掌握色谱法的定性和定量方法掌握色谱法的定性和定量方法; 4. 了解气相了解气相液相色谱的分析原理、仪器结构液相色谱的分析原理、仪器结构 和在食品分析中的应用和在食品分析中的应用.第3页食品学院食品学院 描述描述: : 色谱法是一种分离技术色谱法是一种分离技术. . 混合物最有效的分离、分析方法混合物最有效的分离、分析方法. . 色谱法分离发生

2、在色谱柱上色谱法分离发生在色谱柱上. . 可用于检测大多数有机物质可用于检测大多数有机物质. .1. 色谱法导论色谱法导论第4页食品学院食品学院 1906 1906年年, ,俄国植物学家俄国植物学家茨维特茨维特 对植物叶的色素成分进行研究对植物叶的色素成分进行研究 时时, ,使用右图装置使用右图装置: : 将植物叶子的萃取物倒入填有将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙碳酸钙的直立的直立玻璃管内玻璃管内, ,然后加然后加入入石油醚石油醚使其自由流下使其自由流下, ,结果色结果色素中各组分互相分离形成各种素中各组分互相分离形成各种颜色的谱带颜色的谱带. .这种分离物质的方这种分离物质的方 法因此得名为

3、法因此得名为色谱法色谱法. .1.1 概述概述第5页食品学院食品学院 1.2 色谱法分类色谱法分类 (1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。流动相为气体（称为载气）。 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱 按色谱柱可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按色谱柱可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；(2)液相色谱：流动相为液体（称为淋洗液）。流动相为液体（称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 第6页食品学院食品学院 1.3 1.3 色谱法的特点色谱法的特点（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异

4、构体、手性异构体。复杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。高效液相色谱高效液相色谱分离复杂单糖分离复杂单糖第7页食品学院食品学院 （2） 灵敏度高 可以检测出可以检测出g.gg.g-1-1(10(10-6-6) )级甚至级甚至ng.gng.g-1-1(10(10-9-9) )级的物质量。级的物质量。（3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于气相色谱：沸点低于400、结构稳定的各种有机或无机、结构稳定的各种有机或无机 试样的分析。试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的

5、分离分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 第8页食品学院食品学院 （一）组分分离（一）组分分离 当流动相中样品混合物经过当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相的差异，与固定相相互作用相互作用的类的类型、强弱也有差异，因此在同一型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。先后不同的次序从固定相中流出。1.4 1.4 色谱曲线图及有关术语色谱曲

6、线图及有关术语第9页食品学院食品学院 （二）色谱峰（二）色谱峰 由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。 第10页食品学院食品学院 基线：在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流基线：在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流 出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h h）表示。表示。第11页食品学院食品学院 （三

7、）（三） 保留时间保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。的时间，称为保留时间，如下图。 组分在色谱柱中的保留时间组分在色谱柱中的保留时间t tR R包含组分通过柱包含组分通过柱子的时间和组分在固定相中滞留的时间，所子的时间和组分在固定相中滞留的时间，所以以t tR R实际上是组分在固定相中保留的总时间。实际上是组分在固定相中保留的总时间。进样进样tR第12页食品学院食品学院 （四）（四） 分离度分离度 分离度是描述难分离物质对的实际分离程度。分离度是描述难分离物质对的实际分离程度。 柱效较高，柱效较高，K(分配系数分

8、配系数)较大较大,完全分离；完全分离； K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，柱效较低，K较大较大,但分离的不好；但分离的不好； K小，小，柱效低，分离效果更差。柱效低，分离效果更差。第13页食品学院食品学院 1.5 定性和定量分析定性和定量分析1 定性分析定性分析 在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留时在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留时 间。间。 通过比较已知物和未知物的保留参数或在通过比较已知物和未知物的保留参数或在固定相固定相 上的位置，即可确定未知物是何种物质。上的位置，即可确定未知物是何种物质。1.94

9、5甲酯 - 4.0184.870丙酯 - 6.373丁酯 - 8.941AU0.000.050.100.15分钟0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.002.5382.5702.926甲 - 4.053丙 - 6.457丁 - 9.070AU0.0000.0100.020分钟0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00未知样品图已知标样图第14页食品学院食品学院 利用纯物质定性的方法 利用保留值定性利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰

10、，来确定试样中是否含有该质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。得的数据之间的对比。 利用加入法定性利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。察各组分色谱峰的相对变化。第15页食品学院食品学院 2 定量分析定量分析 在一定色谱条件下，组分在一定色谱条件下，组分i的质量（的质量（mi）与检测器）与检测器响应讯号（峰面积响应讯号（峰面积Ai）成正比。）成正比。色谱定量分析的色谱定量分析的依据依据iAiiAfm=第16页食品学院食品学院 3

11、3 定量分析方法定量分析方法 (1)(1)外标法外标法( (标准曲线法标准曲线法) )：将欲测组分的纯物质配制成不：将欲测组分的纯物质配制成不同浓度的标准溶液进行色谱分析，以峰面积对浓度作图。同浓度的标准溶液进行色谱分析，以峰面积对浓度作图。测得样品的信号后从标准曲线上查出对应浓度。测得样品的信号后从标准曲线上查出对应浓度。1 2 3 4 5 6 SampleAmmiAi第17页食品学院食品学院 （2 2） 归一化法归一化法 将试样中将试样中所有组分的含量之和按所有组分的含量之和按100%100%计算，以它计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数，通过下式计们相应的色谱峰面积或峰高为定量参

12、数，通过下式计算各组分的含量：算各组分的含量：%100%1=niAisiAisiifAfAm前提：样品中所有组分都有响应（出峰）前提：样品中所有组分都有响应（出峰）第18页食品学院食品学院 1mg样品溶解后，经过高效液相色谱分析后得到样品溶解后，经过高效液相色谱分析后得到4个个峰，经验证样品中只有峰，经验证样品中只有4种物质，那么每种物质所占种物质，那么每种物质所占比例与对应峰面积所占比例一致。即比例与对应峰面积所占比例一致。即 M1=1mg A1/(A1+A2+A3+A4)验证方法：验证方法：薄层色谱法薄层色谱法最常用。二极管阵列检测器最常用。二极管阵列检测器3124第19页食品学院食品学院

13、 练习题：练习题：1.色谱分离主要发生在色谱分离主要发生在 （ ）上。）上。 1.按照固定相的物态不同，可将液相色谱法分为（按照固定相的物态不同，可将液相色谱法分为（ ）和）和（ ），前者的固定相为固体，后者的固定相为液体。），前者的固定相为固体，后者的固定相为液体。3. 是色谱分析中用于描述难分离物质对的实际分离程是色谱分析中用于描述难分离物质对的实际分离程度。度。4.色谱分析法的定量方法有色谱分析法的定量方法有 、和、和 ， 其中其中 需要所有物质都出峰。需要所有物质都出峰。5.色谱分析法的定性依据和定量依据分别是什么？色谱分析法的定性依据和定量依据分别是什么？液固色谱液液色谱分离度分离度

14、标准曲线法标准曲线法归一化法归一化法归一化法归一化法色谱柱保留时间（或出峰时间）；峰面积。第20页食品学院食品学院 2 2 气相色谱法气相色谱法第21页食品学院食品学院 气相色谱仪第22页食品学院食品学院 气相色谱仪主要包括气相色谱仪主要包括五部分五部分：1 1、载气系统、载气系统2 2、进样系统、进样系统3 3、分离系统、分离系统 4 4、温控系统、温控系统5 5、检测系统、检测系统2.1 气相色谱仪的组成气相色谱仪的组成第23页食品学院食品学院 压缩气体钢瓶压缩气体钢瓶减压阀、稳压阀减压阀、稳压阀净化器净化器检测器检测器色谱柱色谱柱汽化室汽化室尾气尾气1、载气系统、载气系统第24页食品学院

15、食品学院 气相色谱对气相色谱对载气的基本要求载气的基本要求：（1）纯净）纯净通过活性炭或分子筛净化器，除去载气中的通过活性炭或分子筛净化器，除去载气中的水分、氧等有害杂质。水分、氧等有害杂质。（2）稳定）稳定采用稳压阀或双气路方式：采用稳压阀或双气路方式：载气（3 3）常用的载气：）常用的载气：氮气氮气 氢气氢气 氦气氦气 氩气氩气第25页食品学院食品学院 2、进样系统、进样系统 进样装置进样装置和和汽化室汽化室 进样通常用微量注射器和进样阀将样品引入。进样通常用微量注射器和进样阀将样品引入。液体样品引入后需要瞬间汽化。汽化在汽化室进行。液体样品引入后需要瞬间汽化。汽化在汽化室进行。 进样量不

16、能太小（大于检测限），也不能太大进样量不能太小（大于检测限），也不能太大（会使峰型拖尾）。（会使峰型拖尾）。 进样速度要快。进样速度要快。 第26页食品学院食品学院 液体进样装置和汽化室液体进样装置和汽化室 液体进样器：注射器液体进样器：注射器第27页食品学院食品学院 载气入口载气入口加热块加热块接色谱柱汽化室：使样品瞬间汽化而又不分解。汽化室：使样品瞬间汽化而又不分解。 接色谱柱接色谱柱对对汽化室的要求汽化室的要求：（1）体积小；）体积小；（2）热容量大；）热容量大；（3）对样品无催化作用）对样品无催化作用第28页食品学院食品学院 3.分离系统色谱柱色谱柱: :色谱仪的核心部件色谱仪的核心部

17、件, ,其作用是分离样品。其作用是分离样品。 主要有两类：主要有两类：填充柱填充柱和和毛细管柱毛细管柱。1 1）填充柱）填充柱 填充柱由不锈钢制成，内装固定相，一填充柱由不锈钢制成，内装固定相，一 般内径为般内径为2 24 mm4 mm，长长1 13m3m。填充柱的形状有填充柱的形状有U U 型和螺旋型二种型和螺旋型二种. .第29页食品学院食品学院 2 2）毛细管柱）毛细管柱 毛细管柱又叫空心柱，分为涂壁，多孔层和毛细管柱又叫空心柱，分为涂壁，多孔层和涂载体空心柱。涂壁空心柱是将固定液均匀地涂涂载体空心柱。涂壁空心柱是将固定液均匀地涂在内径在内径0.l0.l0.5 mm0.5 mm的毛细管内

18、壁而成，毛细管材的毛细管内壁而成，毛细管材料可以是不锈钢，玻璃或石英。料可以是不锈钢，玻璃或石英。 与填充往相比，其分离效率高、分析速度块、与填充往相比，其分离效率高、分析速度块、样品用量小，但柱容量低、要求检测器的灵敏度样品用量小，但柱容量低、要求检测器的灵敏度高，并且制备较难。高，并且制备较难。第30页食品学院食品学院 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相与固定相之间产生的作用

19、力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。流出。第31页食品学院食品学院 4.温控系统 温度是色谱分离条件的重要选择参数；温度是色谱分离条件的重要选择参数； 气化室、分离室、检测器气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制三部分在色谱仪操作时均需控制 温度温度. 气化室气化室：保证液体试样瞬间气化，一般比分离室温度高：保证液体试样瞬间气化，一般比分离室温度高50 - 100度；度； 分离

20、室分离室：准确控制分离需要的温度。当试样复杂时，分离：准确控制分离需要的温度。当试样复杂时，分离 室温度需要按一定程序控制温度变化，各组分在室温度需要按一定程序控制温度变化，各组分在 最佳温度下分离；最佳温度下分离； 检测器检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝；：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝； 色谱柱的温度控制方式有色谱柱的温度控制方式有恒温恒温和和程序升温程序升温二种。二种。第32页食品学院食品学院 对于沸点范围很宽的混合物，往往采用对于沸点范围很宽的混合物，往往采用程序升程序升温法温法进行分析。程序升温指在一个分析周期内柱温进行分析。程序升温指在一个分析周期内柱温随时间由低温向

21、高温作线性或非线性变化，以达到随时间由低温向高温作线性或非线性变化，以达到用最短时间获得最佳分离的目的。用最短时间获得最佳分离的目的。程序升温程序升温:第33页食品学院食品学院 恒温和程序升温分析烃类化合物恒温和程序升温分析烃类化合物第34页食品学院食品学院 5.检测和数据处理系统 这个系统是指样品经色谱柱分离后，各成分这个系统是指样品经色谱柱分离后，各成分按保留时间不同，顺序地随载气进入按保留时间不同，顺序地随载气进入检测器检测器，检，检测器把进入的组分按时间及其浓度或质量的变化，测器把进入的组分按时间及其浓度或质量的变化，转化成易于测量的转化成易于测量的电信号电信号，经过必要的放大传递，经

22、过必要的放大传递给给记录仪或计算机记录仪或计算机，最后得到该混合样品的色谱，最后得到该混合样品的色谱流出曲线及定性和定量信息。流出曲线及定性和定量信息。第35页食品学院食品学院 1 热导检测器（热导检测器（TCD）(1)(1)热导检测器的结构热导检测器的结构池体池体: 一般用不锈钢制成一般用不锈钢制成.热敏元件热敏元件：电阻率高、电阻温度系数大、且价廉易加工的钨电阻率高、电阻温度系数大、且价廉易加工的钨 丝制成。丝制成。参考臂参考臂：仅允许纯载气通过，通常连接在进样装置之前。：仅允许纯载气通过，通常连接在进样装置之前。测量臂测量臂：需要携带被分离组分需要携带被分离组分 的载气流过，则连接在的载

23、气流过，则连接在 紧靠近分离柱出口处。紧靠近分离柱出口处。2.2 常用检测器常用检测器第36页食品学院食品学院 (2) (2) 检测原理检测原理平衡电桥平衡电桥钨丝通电，加热与散热达到平衡后，两臂电阻值：钨丝通电，加热与散热达到平衡后，两臂电阻值： R参参=R测测 ; R1=R2 则：则： R参参R2=R测测R1 无电压信号输出无电压信号输出,记录仪走直线（基线）。记录仪走直线（基线）。第37页食品学院食品学院 进样后进样后: : 载气携带试样组分流过测量臂而这时参考臂流过的仍是载气携带试样组分流过测量臂而这时参考臂流过的仍是纯载气，使测量臂的温度改变，引起电阻的变化，测量臂和纯载气，使测量臂

24、的温度改变，引起电阻的变化，测量臂和参考臂的电阻值不等，产生电阻差，参考臂的电阻值不等，产生电阻差，R参参R测测则：则： R参参R2R测测R1 这时电桥失去平衡，这时电桥失去平衡，a、b两端存在着电位差，有电压信两端存在着电位差，有电压信号输出。信号与组分浓度相关。号输出。信号与组分浓度相关。记录仪记录下组分浓度随时间记录仪记录下组分浓度随时间变化的峰状图形。变化的峰状图形。不同气体有不同的热导系数不同气体有不同的热导系数第38页食品学院食品学院 某些气体与蒸气的热导系数（某些气体与蒸气的热导系数（），），单位：单位：J / cms第39页食品学院食品学院 2. 2. 氢火焰离子化检测器（氢火

25、焰离子化检测器（FIDFID） 氢火焰离子化检测器是氢火焰离子化检测器是以氢气和空气燃烧以氢气和空气燃烧的火焰作为能源的火焰作为能源，利用含碳有机物在火焰中燃，利用含碳有机物在火焰中燃烧产生离子，在外加的电场作用下，使离子形烧产生离子，在外加的电场作用下，使离子形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离出的组分。测被色谱柱分离出的组分。第40页食品学院食品学院 第41页食品学院食品学院 特点特点: 1, 能检测大多数含碳有机化合物；能检测大多数含碳有机化合物； 2, 灵敏度很高，比热导检测器的灵敏度高约灵敏度很高，比热导检测器的灵敏度高约1

26、03倍；倍； 检出限检出限 低，可达低，可达10-12gS-1； 3, 是目前是目前应用最广泛应用最广泛的色谱检测器的色谱检测器 之一。之一。缺点：缺点： 不能检测永久性气体、水、一氧化碳、二氧化碳、氮的不能检测永久性气体、水、一氧化碳、二氧化碳、氮的氧化物、硫化氢等物质。氧化物、硫化氢等物质。第42页食品学院食品学院 3.3.电子捕获检测器电子捕获检测器(ECD)(ECD) 特点特点:电子捕获检测器是一种选择性很强的检测器电子捕获检测器是一种选择性很强的检测器, 目前分析目前分析 痕痕 量电负性有机物最有效量电负性有机物最有效 的检测器，对具有的检测器，对具有电负性物质电负性物质（如含（如含

27、卤素、硫、磷、氰等的物质）的检测有很高灵敏度卤素、硫、磷、氰等的物质）的检测有很高灵敏度（检出限（检出限约约1O-14g/ml）。）。缺点缺点: 线性范围窄，只有线性范围窄，只有103左右，且响应易受操作条件的影响，左右，且响应易受操作条件的影响，重现性较差。重现性较差。应用应用:电子捕获检测器已广泛应用于农药残留量、大气及水质污电子捕获检测器已广泛应用于农药残留量、大气及水质污染分析，以及生物化学、医学、药物学和环境监测等领域中。染分析，以及生物化学、医学、药物学和环境监测等领域中。第43页食品学院食品学院 4.火焰光度检测器火焰光度检测器(FPD) 火焰光度检测器，火焰光度检测器，又称硫、

28、磷检测器又称硫、磷检测器，它是，它是一种对含磷、硫有机化合物具有高选择性和高灵一种对含磷、硫有机化合物具有高选择性和高灵敏度的质量型检测器，检出限可达敏度的质量型检测器，检出限可达10-12gS-1（对（对P）或或10-11gS-1（对对S）。）。 这种检测器可用于大气中痕量硫化物以及农这种检测器可用于大气中痕量硫化物以及农副产品，水中的毫微克级有机磷和有机硫农药残副产品，水中的毫微克级有机磷和有机硫农药残留量的测定。留量的测定。第44页食品学院食品学院 2.3 检测器性能评价指标检测器性能评价指标灵敏度（灵敏度（S） ： S 表示单位质量的物质通过检测器时，产生的响应信表示单位质量的物质通过检测器时，产生的响应信号的大小。号的大小。S值越大，检测器（也即色谱仪）的灵敏度也值越大，检测器（也即色谱仪）的灵敏度也就越高。检测信号通常显示为色谱峰，则响应值也可以由就越高。检测信号通常显示为色谱峰，则响应值也可以