食用菌的遗传与育种

1、会计学1食用菌的遗传与育种食用菌的遗传与育种一一 食用菌的繁殖方式食用菌的繁殖方式二二 食用菌的生活史食用菌的生活史三三 食用菌的育种技术食用菌的育种技术食用菌育种食用菌育种 食用菌育种的原理、技术路线和方法食用菌育种的原理、技术路线和方法一食用菌的繁殖方式一食用菌的繁殖方式 多数食用菌完整生活史包括无性及有性两多数食用菌完整生活史包括无性及有性两个阶段，主要进行从担孢子萌发再到新一代个阶段，主要进行从担孢子萌发再到新一代担孢子产生的有性生殖过程，其间要经过质担孢子产生的有性生殖过程，其间要经过质配、核配及减数分裂三大步骤。配、核配及减数分裂三大步骤。 无性繁殖无性繁殖无性繁殖：不通过有性生殖

2、细胞的结合，而由亲无性繁殖：不通过有性生殖细胞的结合，而由亲代直接产生新个体的生殖方式叫无性繁殖，食用代直接产生新个体的生殖方式叫无性繁殖，食用菌的无性繁殖主要有以下几种形式：菌的无性繁殖主要有以下几种形式：1.1.以菌丝断裂的方式繁殖；以菌丝断裂的方式繁殖；2.2.以产生无性孢子的方式繁殖：如香菇产生节以产生无性孢子的方式繁殖：如香菇产生节孢子，双孢蘑菇产生次生孢子，草菇产生厚垣孢孢子，双孢蘑菇产生次生孢子，草菇产生厚垣孢子，黑木耳产生钩状分生孢子等；子，黑木耳产生钩状分生孢子等；3.3.以出芽方式繁殖。以出芽方式繁殖。 无性孢子在不良条件下有较强抗无性孢子在不良条件下有较强抗性，在适宜条件

3、下可再萌发为原来的性，在适宜条件下可再萌发为原来的一级菌丝或二极菌丝，继续进行有性一级菌丝或二极菌丝，继续进行有性生活过程。生活过程。有性繁殖有性繁殖通过有性生殖细胞的结合，产生新个体的通过有性生殖细胞的结合，产生新个体的繁殖方式，叫有性繁殖。繁殖方式，叫有性繁殖。孢子核基因的不同就决定了其所萌发成的单核菌孢子核基因的不同就决定了其所萌发成的单核菌丝的不同性别。有性繁殖根据进行质配的单核菌丝的不同性别。有性繁殖根据进行质配的单核菌丝的性别，又可以分为以下两种形式。丝的性别，又可以分为以下两种形式。（一）同宗结合（一）同宗结合（二）异宗结合（二）异宗结合 同宗结合同宗结合：即质配发生在同一个孢子

4、萌发的两：即质配发生在同一个孢子萌发的两条单核菌丝之间，不需与异性结合，又称自条单核菌丝之间，不需与异性结合，又称自交亲和，这种自交可育的繁殖方式称为同宗交亲和，这种自交可育的繁殖方式称为同宗结合。可分为初级同宗结合和次级同宗结合结合。可分为初级同宗结合和次级同宗结合。 初级同宗结合初级同宗结合 担孢子担孢子只含有减数分裂减数分裂后产生的后产生的4 4个核中的一个，单核担孢子个核中的一个，单核担孢子萌发形成的单核菌丝细胞间不须经过异萌发形成的单核菌丝细胞间不须经过异体菌丝的融合，就可自己发生双核化，体菌丝的融合，就可自己发生双核化，并完成核配和减数分裂的有性生活史的并完成核配和减数分裂的有性生

5、活史的全部过程。草菇即属于这一类型。全部过程。草菇即属于这一类型。次级同宗结合次级同宗结合 每个担子只产生每个担子只产生2个担孢个担孢子，每个担孢子内含有减数分裂后形成子，每个担孢子内含有减数分裂后形成的的4个核中具有不同交配型基因的个核中具有不同交配型基因的2个核个核，双核担孢子，双核担孢子 萌发后形成可孕的多核的萌发后形成可孕的多核的异核菌丝体，这种菌丝体不与其他菌丝异核菌丝体，这种菌丝体不与其他菌丝交配就可自行完成有性生活史。双孢蘑交配就可自行完成有性生活史。双孢蘑菇即属于这一类型菇即属于这一类型异宗结合：异宗结合：大多食用菌的担孢子或单核菌丝有大多食用菌的担孢子或单核菌丝有 “ “雌雌

6、”、“雄雄”性之分（常用性之分（常用“”、“”表示）。其性别表示）。其性别是由遗传因子控制的，只有异性的单核菌丝，才能质是由遗传因子控制的，只有异性的单核菌丝，才能质配成双核菌丝，而同性别的菌丝永不亲和，也不产生配成双核菌丝，而同性别的菌丝永不亲和，也不产生有性孢于，这种现象称异宗结合，也称自交不育。有性孢于，这种现象称异宗结合，也称自交不育。9090的菌类属异宗结合，有两种类型的菌类属异宗结合，有两种类型：二极性和四极性。：二极性和四极性。 二极性二极性 是由一对遗传因子是由一对遗传因子 （AaAa）所控制的，这类食用菌所产生的担孢子以及）所控制的，这类食用菌所产生的担孢子以及其萌发的初生菌

7、丝，不是其萌发的初生菌丝，不是A A型，就是型，就是a a型，四个型，四个担孢子分属二种类型，即二个是担孢子分属二种类型，即二个是A A，二个是，二个是a a，两两相等，称为二极性。只有组成两两相等，称为二极性。只有组成AaAa时，才能时，才能出现正常的锁状联合，形成双出现正常的锁状联合，形成双核菌丝体，核菌丝体，最后最后发育成子实体。如果各担孢子萌发的单核菌丝发育成子实体。如果各担孢子萌发的单核菌丝，让其自己配对，让其自己配对，可育率有可育率有5050（表（表1 1），黑），黑木耳、渭菇等属于二极性菌类。木耳、渭菇等属于二极性菌类。表表1 1 二极性组合的可育情况二极性组合的可育情况 孢子性

8、别 A A a a A A a a 十表示两者可育十表示两者可育 表示两者不可育，表示两者不可育，可育率有可育率有50。 四极性四极性 大部分食用菌的性别是由二大部分食用菌的性别是由二对独立分离的遗传因子（对独立分离的遗传因子（AaAa和和 BbBb）所控）所控制的。四个担孢子的性基因，制的。四个担孢子的性基因， 分别是分别是ABAB、AbAb、aBaB、abab四种类型，近似四种性别，称为四四种类型，近似四种性别，称为四极性。极性。 属于四极性初生菌丝，只有属于四极性初生菌丝，只有AaBbAaBb的组的组合才是可育的，可育率合才是可育的，可育率2525（表（表2 2），香菇、），香菇、朴菇、

9、平菇、银耳、毛木耳等即属四极性菌朴菇、平菇、银耳、毛木耳等即属四极性菌类类表表2 2 四极性组合的可育情况四极性组合的可育情况 孢子性别 AB Ab aB ab AB 00Ab 00aB 0000ab 000000十表示两者可育十表示两者可育 表示两者不可育表示两者不可育无论是同宗结合或异宗结合，都是细胞质的结无论是同宗结合或异宗结合，都是细胞质的结合，细胞核并不结合，只是紧靠地排列成对。合，细胞核并不结合，只是紧靠地排列成对。这些偶对细胞核继续不断地分裂，形成大量的这些偶对细胞核继续不断地分裂，形成大量的新细胞，使菌丝体迅速地生长发育。新细胞，使菌丝体迅速地生长发育。 二二 食用菌的生活史食

10、用菌的生活史生活史的概念生活史的概念 所谓生活史，是指生物一生所经历的生长发育和繁殖阶段所谓生活史，是指生物一生所经历的生长发育和繁殖阶段的生活周期的生活周期(全过程全过程)。 食用菌的生活史是指食用菌的生活史是指从孢子到孢子从孢子到孢子的整个生长发育过程。的整个生长发育过程。 多数食用菌的生活史是：多数食用菌的生活史是： 担孢子担孢子 担孢子萌发担孢子萌发 初生菌丝（单核菌丝）初生菌丝（单核菌丝） 两两条可亲和的初生菌丝融合条可亲和的初生菌丝融合 次生菌丝（双核菌丝）次生菌丝（双核菌丝） 子实体原基子实体原基 子实体子实体 担孢子担孢子食用菌中伞菌类的典型生活史食用菌中伞菌类的典型生活史 食

11、用菌中多数伞菌类的典型生活史由以下几个阶段组成食用菌中多数伞菌类的典型生活史由以下几个阶段组成：u担孢子萌发，生活史开始：担孢子萌发，生活史开始：u单核菌丝（初生菌丝）开始发育。单核菌丝（初生菌丝）开始发育。u两条可亲和的单核菌丝两条可亲和的单核菌丝通过融合进行质配，形成双核通过融合进行质配，形成双核菌丝体。菌丝体。多数食用菌的双核菌丝具有锁状联合。双核菌多数食用菌的双核菌丝具有锁状联合。双核菌丝能够独立地、无限地繁殖，有些种的双核菌丝能产生丝能够独立地、无限地繁殖，有些种的双核菌丝能产生粉孢子、厚垣孢子等无性孢子。粉孢子、厚垣孢子等无性孢子。u在适宜的环境条件下，双核菌丝发育成结实性在适宜的

12、环境条件下，双核菌丝发育成结实性菌丝菌丝( (三生菌丝三生菌丝) )并组织化，产生子实体。如冬并组织化，产生子实体。如冬虫夏草、茯苓等。虫夏草、茯苓等。u子实体菌褶表面或菌管内壁的双核菌丝的顶端子实体菌褶表面或菌管内壁的双核菌丝的顶端细胞发育成担子，进入有性生殖阶段。细胞发育成担子，进入有性生殖阶段。 8.8.u来自两个亲本的一对交配型不同的单倍体核在担来自两个亲本的一对交配型不同的单倍体核在担子中融合，进行核配，形成一个双倍体核；子中融合，进行核配，形成一个双倍体核；u双倍体核进行减数分裂，结果产生四个单倍体核双倍体核进行减数分裂，结果产生四个单倍体核；u担子顶端生担子顶端生4个小梗，小梗顶

13、端膨大成幼担子，个小梗，小梗顶端膨大成幼担子，各个单倍体核分别移至担子小梗的顶端，形成担各个单倍体核分别移至担子小梗的顶端，形成担孢子。至此，完成了一个完整的生活史。孢子。至此，完成了一个完整的生活史。 核融合核融合Nuclear fusion减数分裂减数分裂meiosis 担孢子梗担孢子梗sterigmataBasidiospores担孢子担孢子Basidium（担子）（担子）三、有性繁殖过程中细胞核的变化三、有性繁殖过程中细胞核的变化一是质配后开始的异核双核阶段，即异核双核期。一是质配后开始的异核双核阶段，即异核双核期。具有产生子实体的能力，是大部分食用菌的主要存具有产生子实体的能力，是大

14、部分食用菌的主要存在形式；在形式；二是核配后开始的短暂的双倍核期；二是核配后开始的短暂的双倍核期；三是核配马上进行减数分裂，每个细胞中都有三是核配马上进行减数分裂，每个细胞中都有4 4个单倍体核，称为单核期，此期亦短暂。个单倍体核，称为单核期，此期亦短暂。 四、食用菌中几种有代表性的生活史类型四、食用菌中几种有代表性的生活史类型 各种食用菌的生活史，由于控制有性过程的基因不同而各种食用菌的生活史，由于控制有性过程的基因不同而有差异，下面举几个有代表性的食用菌生活史类型。有差异，下面举几个有代表性的食用菌生活史类型。草菇的生活史：初级同宗结合草菇的生活史：初级同宗结合 双孢蘑菇的生活史：次级同宗

15、结合双孢蘑菇的生活史：次级同宗结合黑木耳的生活史：异宗结合，单因子控制，二极性黑木耳的生活史：异宗结合，单因子控制，二极性香菇的生活史：四极性异宗结合，双因子控制、香菇的生活史：四极性异宗结合，双因子控制、四极性四极性 银耳的生活史：异宗结合，双因子控制，四极性银耳的生活史：异宗结合，双因子控制，四极性 第三节第三节 食用菌的育种技术食用菌的育种技术 食用菌栽培是一系列复杂操作的工作程序，食用菌栽培是一系列复杂操作的工作程序，包括种菇选择、母种选育与保存、菌种制备、出菇包括种菇选择、母种选育与保存、菌种制备、出菇管理及市场销售等，每个程序都有至关重要的细节管理及市场销售等，每个程序都有至关重要

16、的细节操作。但操作。但育种是这些工作中首要的一项工作育种是这些工作中首要的一项工作，没有，没有优良的菌种，不管其他工作程序准备及管理得多么优良的菌种，不管其他工作程序准备及管理得多么好，都会造成减产或失败。好，都会造成减产或失败。一、引种与选择育种一、引种与选择育种 （一）引种（一）引种 引种应遵照以下原则和程序进行：引种应遵照以下原则和程序进行：了解供种单位了解供种单位了解品种了解品种了解拟引进品种的生物学特性和栽培要点了解拟引进品种的生物学特性和栽培要点先试种再扩大先试种再扩大品种配套品种配套（二）选择育种（二）选择育种 选择育种是最古老、最简便、应用最广的选种选择育种是最古老、最简便、应

17、用最广的选种方法。它是先分离和收集各地的有关菌株，然后方法。它是先分离和收集各地的有关菌株，然后通过生产试验比较各菌株的生产性能，选留最优通过生产试验比较各菌株的生产性能，选留最优者。不断淘汰劣等菌株，选留优秀菌株，就能使者。不断淘汰劣等菌株，选留优秀菌株，就能使生产丰收，质量稳定。生产丰收，质量稳定。具体步骤如下：具体步骤如下：1 1、资源的收集与采集、资源的收集与采集 不同菌株采集地点的地理条件应有明显的差不同菌株采集地点的地理条件应有明显的差别，采集野生标本时，还应注意两个采集点之间别，采集野生标本时，还应注意两个采集点之间尽量远一些，同时采集不同地形、坡度、坡向的尽量远一些，同时采集不

18、同地形、坡度、坡向的野生标本。野生标本。2 2、生理性状测定、生理性状测定 u菌株撷颃性试验菌株撷颃性试验u同工酶谱和酶活性测定同工酶谱和酶活性测定 u菌丝生长速度测定菌丝生长速度测定3 3、菌株出菇性能比较试验、菌株出菇性能比较试验 比较各菌株的优劣，详细记录各菌株的产量、菇形、温比较各菌株的优劣，详细记录各菌株的产量、菇形、温性、干鲜比、始菇期、菇潮间隔、形态等。为了试验的准性、干鲜比、始菇期、菇潮间隔、形态等。为了试验的准确性，要保证菌种的质量，培养基配方，接种，管理措施确性，要保证菌种的质量，培养基配方，接种，管理措施等可能影响结果的因素，尽可能使之一致。试验还应按生等可能影响结果的因

19、素，尽可能使之一致。试验还应按生物统计原理进行安排。物统计原理进行安排。4、扩大栽培试验、扩大栽培试验 上述的品种评比结果仅是个阶段性的成果，还上述的品种评比结果仅是个阶段性的成果，还应和当地的当家菌株同时进行栽培，证实它是更优应和当地的当家菌株同时进行栽培，证实它是更优良的菌株。良的菌株。5、示范推广试验、示范推广试验 经扩大试验后，将选出的优良品种放到有代经扩大试验后，将选出的优良品种放到有代表性的试验点进行示范性生产，待试验结果进一表性的试验点进行示范性生产，待试验结果进一步确定之后，再由点到面推广。步确定之后，再由点到面推广。二、诱变育种二、诱变育种 诱变育种是利用物理或化学因子处理食

20、用诱变育种是利用物理或化学因子处理食用菌的细胞群，促使其细胞中的遗传物质的分子菌的细胞群，促使其细胞中的遗传物质的分子结构发生改变，从而引起其遗传性变异，然后结构发生改变，从而引起其遗传性变异，然后从变异的细胞中筛选出少数具有优良新性状变从变异的细胞中筛选出少数具有优良新性状变异的菌株。异的菌株。（一）基因突变（一）基因突变 突变：是指遗传物质发生了稳定的可遗传的变化。突变：是指遗传物质发生了稳定的可遗传的变化。 包括染色体畸变和基因突变两大类。包括染色体畸变和基因突变两大类。 基因突变的类型基因突变的类型 按突变体表型特征的不同，将突变分为按突变体表型特征的不同，将突变分为4 4个类型：个类

21、型：形态突变型形态突变型 发生细胞形态、菌落形态或子实体改变。发生细胞形态、菌落形态或子实体改变。生化突变型生化突变型 没有形态改变而生化特性发生改变。没有形态改变而生化特性发生改变。致死突变型致死突变型 由于基因突变而造成个体死亡或生由于基因突变而造成个体死亡或生 活力下降的突变型。活力下降的突变型。条件致死突变型条件致死突变型 某些条件下成活，而另外条件下致死。某些条件下成活，而另外条件下致死。u按突变所引起的遗传信息的改变可将突变分为按突变所引起的遗传信息的改变可将突变分为3 3类：类： 错义突变错义突变 突变造成一个不同氨基酸的置换。突变造成一个不同氨基酸的置换。 同义突变同义突变 碱

22、基突变后编码的氨基酸与野生型氨碱基突变后编码的氨基酸与野生型氨 基酸相同。基酸相同。 无义突变无义突变 碱基突变后形成终止密码子，使蛋白质合成碱基突变后形成终止密码子，使蛋白质合成提前终止。提前终止。u按遗传物质结构改变，可分：碱基置换、移码、按遗传物质结构改变，可分：碱基置换、移码、DNADNA片片段插入和缺失。段插入和缺失。 碱基置换碱基置换：是指：是指DNADNA中核苷酸的一个碱基被另一个碱中核苷酸的一个碱基被另一个碱基所取代。有颠倒和转换两种。颠倒是一个嘌呤被一基所取代。有颠倒和转换两种。颠倒是一个嘌呤被一个嘧啶或一个嘧啶被一个嘌呤取代，而转换是一个嘌个嘧啶或一个嘧啶被一个嘌呤取代，而

23、转换是一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶取代。呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶取代。 A:T T:A A T C:G G:C C G 对角线对角线= =转换转换 纵横线纵横线= =颠倒颠倒 p基因突变的分子基础基因突变的分子基础 移码移码: :由于在由于在DNADNA分子的编码区插入或缺失非分子的编码区插入或缺失非3 3的整的整数倍个核苷酸而导致的阅读框架的位移。因为遗数倍个核苷酸而导致的阅读框架的位移。因为遗传是按传是按3 3个碱基为一组依次排列而成的，当在起始个碱基为一组依次排列而成的，当在起始密码子后加入非密码子后加入非3 3的整数倍个核苷酸后，整个氨基的整数倍个核苷酸后，整

24、个氨基酸序列就会打乱。酸序列就会打乱。 缺失或重复缺失或重复: 大片段的缺失或重复是基因突变的大片段的缺失或重复是基因突变的主要原因之一。主要原因之一。 p 遗传育种上常用的几种突变体遗传育种上常用的几种突变体 u营养缺陷突变体营养缺陷突变体 由于代谢障碍而成为必须添加某由于代谢障碍而成为必须添加某种物质才能生长的突变体。种物质才能生长的突变体。u温度敏感突变体温度敏感突变体 可在某一温度下生长而在另一温可在某一温度下生长而在另一温度下不生长的突变体。度下不生长的突变体。u抗性突变体抗性突变体 对某种药物具有一定抵抗能力的突变对某种药物具有一定抵抗能力的突变体。体。 p 基因突变的规律基因突变

25、的规律 u随机性：从时间、个体、位点和所产生随机性：从时间、个体、位点和所产生的表型变化等方面都有明显的随机性的表型变化等方面都有明显的随机性u独立性：基因突变是独立发生的，与另独立性：基因突变是独立发生的，与另一个基因的突变之间互不相关。一个基因的突变之间互不相关。u稳定性：突变性基因和野生型基因一样，具有稳定性：突变性基因和野生型基因一样，具有稳定的结构，也是可遗传的。稳定的结构，也是可遗传的。u可逆性：野生型基因可突变为突变性基因，同可逆性：野生型基因可突变为突变性基因，同样突变性基因可突变为野生型基因。一般把前样突变性基因可突变为野生型基因。一般把前者称为正向突变，后者称为回复突变。者

26、称为正向突变，后者称为回复突变。u稀有性：是指在正常情况下，突变率是很低的稀有性：是指在正常情况下，突变率是很低的。（二）诱变因素（二）诱变因素p碱基的类似物，常用的有碱基的类似物，常用的有5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（BUBU）p碱基化学修饰物碱基化学修饰物u亚硝酸引起的氧化脱氨反应亚硝酸引起的氧化脱氨反应u羟胺的致突变作用羟胺的致突变作用u烷化剂的致突变作用，常见的有烷化剂的致突变作用，常见的有EMSEMS、NTGNTG、EESEES和和芥子气芥子气诱变因素分物理因素和化学因素两大类诱变因素分物理因素和化学因素两大类化学因素：化学因素：p嵌合剂和移码突变嵌合剂和移码突变 常用的嵌合剂有吖啶橙

27、、二氨基吖啶和吖啶黄常用的嵌合剂有吖啶橙、二氨基吖啶和吖啶黄素等。素等。p物理因素：辐射诱变物理因素：辐射诱变u紫外线（紫外线（UVUV）、X X射线、射线、射线、射线、射线射线、射线、中子射线、超声波、激光射线、中子射线、超声波、激光u卫星和宇宙飞船搭载，利用超真空、超低卫星和宇宙飞船搭载，利用超真空、超低重力的作用，进行诱变育种。重力的作用，进行诱变育种。（四）诱变育种的基本方法（四）诱变育种的基本方法 1 1、制备菌悬液（孢子）、制备菌悬液（孢子） 细胞诱变处理最好是单核的。处理时最好使细胞诱变处理最好是单核的。处理时最好使细胞处于悬浮状态，悬液浓度应控制在细胞处于悬浮状态，悬液浓度应控

28、制在10106 6个个/mL/mL，一般用物理因子处理悬液用生理盐水配制，一般用物理因子处理悬液用生理盐水配制，用化学诱变处理则用缓冲溶液配制。，用化学诱变处理则用缓冲溶液配制。2 2、诱变剂的选择、诱变剂的选择 3 3、诱变的处理、诱变的处理 育种工作中常用杀菌率来表示各种诱变剂的相对剂育种工作中常用杀菌率来表示各种诱变剂的相对剂量。诱变率随剂量的增高而增高，但并不是越高越好。量。诱变率随剂量的增高而增高，但并不是越高越好。u物理诱变物理诱变 实验室普遍使用的是紫外线。步骤如下：在诱变实验室普遍使用的是紫外线。步骤如下：在诱变箱中装箱中装15W15W的紫外灯管的紫外灯管 先预热先预热20mi

29、n 20min 将将5mL5mL孢子孢子悬浮液移入直径悬浮液移入直径6cm6cm的培养皿或的培养皿或10-12mL10-12mL孢子悬浮液移孢子悬浮液移入直径入直径9cm9cm的培养皿中的培养皿中 打开盖在距离紫外灯管打开盖在距离紫外灯管30cm30cm处照射处照射0.5-5min 0.5-5min 处理后可直接稀释涂平板处理后可直接稀释涂平板增殖培养时必须用黑纸包住三角瓶。增殖培养时必须用黑纸包住三角瓶。 u化学诱变化学诱变 现以应用较多的化学诱变剂甲基磺酸乙酯（现以应用较多的化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMSEMS）为例，简要介绍其使用方法。处理食用菌孢子时，其为例，简要介绍其使用方法。处理食

30、用菌孢子时，其浓度一般为浓度一般为0.1-0.4mol/L0.1-0.4mol/L，下面以，下面以0.15mol/L0.15mol/L为例：为例：将食用菌孢子悬浮在将食用菌孢子悬浮在0.1mol/L0.1mol/L，PH7.0PH7.0的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液中，孢子浓度为中，孢子浓度为10106 6个个/mL/mL。9cm9cm孢子悬浮液中加入浓度为孢子悬浮液中加入浓度为0.15mol/L0.15mol/L甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯溶液溶液1mL1mL，摇匀后保温，摇匀后保温3-63-6小时，也可适当延长或缩短时小时，也可适当延长或缩短时间。间。离心、洗涤，稀释涂平皿或加入基培养过夜后再涂

31、平离心、洗涤，稀释涂平皿或加入基培养过夜后再涂平板。板。4 4、挑选突变株挑选突变株诱变后的孢子培养长出菌落后应及时挑选菌落。同宗诱变后的孢子培养长出菌落后应及时挑选菌落。同宗结合的菌株选择发育健全的单个菌落。异宗结合的选择两结合的菌株选择发育健全的单个菌落。异宗结合的选择两个可亲和的单核菌落配对。最后进行栽培实验，比较生产个可亲和的单核菌落配对。最后进行栽培实验，比较生产性能。性能。选出的菌株中，发生突变的仅占少数。而产生显著选出的菌株中，发生突变的仅占少数。而产生显著 高高产优质正向突变的菌株更是极少数。因此，诱变育种中，产优质正向突变的菌株更是极少数。因此，诱变育种中，初筛的菌株不可过少

32、，通常选择初筛的菌株不可过少，通常选择100-1000100-1000个菌株，并设置个菌株，并设置重复，以确保实验的可靠性。重复，以确保实验的可靠性。三、杂交育种三、杂交育种 杂交育种是培育菌种的有效手段。杂交育种是培育菌种的有效手段。杂交是通过杂交是通过2 2个或几个亲株的染色体片个或几个亲株的染色体片段的交换或重行组合而获得新性状的。段的交换或重行组合而获得新性状的。进行杂交时，亲代必需有标记。通过杂进行杂交时，亲代必需有标记。通过杂交亲代的选择，就能得到融合亲代优点交亲代的选择，就能得到融合亲代优点而除去亲代缺点的优良菌种而除去亲代缺点的优良菌种, ,使生产水使生产水平大幅度地提高。平大

33、幅度地提高。 按其性状大致可以分为三类按其性状大致可以分为三类: :杂种营养体发育比较旺的营养型杂种营养体发育比较旺的营养型杂种生殖器官比较旺的生殖型杂种生殖器官比较旺的生殖型对外界不良环境条件适应能力较强的适应型对外界不良环境条件适应能力较强的适应型l1.1.亲本的选择亲本的选择双亲本都要有突出的优点双亲本都要有突出的优点 亲本之间要有较大的遗传差异亲本之间要有较大的遗传差异 杂交亲本应具有较好的配合力杂交亲本应具有较好的配合力l2.2.杂交的方式主要有两种方式：杂交的方式主要有两种方式：单核菌丝和单核菌丝交配单核菌丝和单核菌丝交配 单核菌丝和双核菌丝交配单核菌丝和双核菌丝交配（一）杂交育种

34、的基本原则一）杂交育种的基本原则l3.3.杂交子的选择杂交子的选择异宗结合的食用菌异宗结合的食用菌 ：亲本的性别本身即可作为标记。：亲本的性别本身即可作为标记。一般来说，只要杂交的两个亲本确实是单孢分离物，那么一般来说，只要杂交的两个亲本确实是单孢分离物，那么杂交后凡出现双核菌丝的组合，并能正常结实，就证明两杂交后凡出现双核菌丝的组合，并能正常结实，就证明两亲本是能杂交的。亲本是能杂交的。同宗结合的食用菌：由于自交可孕，这就增加了选择同宗结合的食用菌：由于自交可孕，这就增加了选择杂交子的难度。一般而言，次级同宗结合的每个担子着生杂交子的难度。一般而言，次级同宗结合的每个担子着生2 2个担孢子（

35、占个担孢子（占81.5%81.5%），而着生），而着生4 4个担孢子（占个担孢子（占1.2%1.2%），），它们是自交不孕的，这就为杂交育种提供了可能。其余同它们是自交不孕的，这就为杂交育种提供了可能。其余同宗结合的要对亲本加以特殊标记，常用的遗传标记为营养宗结合的要对亲本加以特殊标记，常用的遗传标记为营养缺陷型和抗药性。缺陷型和抗药性。（二）杂交育种的方法（二）杂交育种的方法杂交育种的一般程序为：杂交育种的一般程序为：选择亲本选择亲本 单孢分离单孢分离 杂交配对杂交配对 转管繁殖转管繁殖 初筛初筛 复筛复筛 试验试验 示范推广。示范推广。1.1.单孢分离单孢分离 玻片稀释分离法玻片稀释分离法

36、平板稀释分离法平板稀释分离法显微操作器分离法显微操作器分离法l单单单杂交单杂交 在培养皿的平板培养基上接入两个杂交亲本的距离为在培养皿的平板培养基上接入两个杂交亲本的距离为2.5-3cm,2.5-3cm,适温培养后，当两单孢菌丝接触后，如出现双核适温培养后，当两单孢菌丝接触后，如出现双核菌丝，即可挑取少量双核菌丝至斜面培养基上培养。菌丝，即可挑取少量双核菌丝至斜面培养基上培养。2. 2. 杂交杂交l单单双杂交双杂交 以香菇为例，在平板培养基上接种一小块单核菌丝以香菇为例，在平板培养基上接种一小块单核菌丝体，体，2525培养培养1010天后，在单核菌落边缘天后，在单核菌落边缘1cm1cm处接种一

37、小处接种一小块双核菌丝体，继续培养，当单双核菌落交接时，挑取块双核菌丝体，继续培养，当单双核菌落交接时，挑取小块菌落镜检，如发现双核化，即可挑取少量菌丝至斜小块菌落镜检，如发现双核化，即可挑取少量菌丝至斜面培养基上培养。（单核菌丝与双核菌丝其中的一个核面培养基上培养。（单核菌丝与双核菌丝其中的一个核融合）融合）四极性的异宗结合的食用菌，由于自交不育，经四极性的异宗结合的食用菌，由于自交不育，经配对后，凡出现双核菌丝的组合，并能正常结实配对后，凡出现双核菌丝的组合，并能正常结实者，即证明杂交成功。者，即证明杂交成功。次级同宗结合食用菌（如双孢蘑菇），首先经过次级同宗结合食用菌（如双孢蘑菇），首先

38、经过单孢子分离、培养，获取不孕菌丝。随后进行不单孢子分离、培养，获取不孕菌丝。随后进行不孕性菌丝间的配对。孕性菌丝间的配对。4.4.初次筛选初次筛选 经过初步筛选，淘汰大部分表现一般的菌株。经初筛经过初步筛选，淘汰大部分表现一般的菌株。经初筛后再做出菇试验比较，选出优良菌株。后再做出菇试验比较，选出优良菌株。 将可亲和的组合移入新的斜面保存备用。将可亲和的组合移入新的斜面保存备用。3.3.转管繁殖转管繁殖5.5.复筛复筛通过栽培比较，选出少数性能优良的菌株。出菇鉴定通过栽培比较，选出少数性能优良的菌株。出菇鉴定包括如下几个方面：包括如下几个方面：菌丝生长速度；菌丝生长速度；出菇菌块（袋）的表型

39、特征；出菇菌块（袋）的表型特征；子实体表型特征；子实体表型特征；测定其最适生长温度、湿度等；测定其最适生长温度、湿度等；计算子实体的产量。计算子实体的产量。 6.6.小面积栽培试验小面积栽培试验： 将复筛菌株置于不同地域的栽培区进行栽培，以将复筛菌株置于不同地域的栽培区进行栽培，以考察其适应性与性状的稳定性，并做相关的详细考察其适应性与性状的稳定性，并做相关的详细记录。记录。7.7.大面各示范推广：大面各示范推广：逐步扩大栽培面积，进行示范性的推广，将种性优逐步扩大栽培面积，进行示范性的推广，将种性优良、优质高产的菌株逐渐定为当家菌株。良、优质高产的菌株逐渐定为当家菌株。8.8.为确定保留下来

40、的杂交新品种正式定名，并申为确定保留下来的杂交新品种正式定名，并申请有关部门批准。请有关部门批准。四、生物技术在食用菌良种选育中的应用四、生物技术在食用菌良种选育中的应用（一）原生质体融合技术一）原生质体融合技术p 原理原理u细胞壁是保护细胞质和各种细胞器的一层细胞壁是保护细胞质和各种细胞器的一层坚实外壁，能有效防止外源基因的侵染。坚实外壁，能有效防止外源基因的侵染。同一种类的个体，细胞壁可以自融，使其同一种类的个体，细胞壁可以自融，使其原生质和细胞核进行内部交换，从而引起原生质和细胞核进行内部交换，从而引起种内近亲遗传性的变异。种内近亲遗传性的变异。u原生质体融合技术的目的，就是要拆除这道天

41、然原生质体融合技术的目的，就是要拆除这道天然屏障，进行种内、种间等远缘杂交，达到较大基屏障，进行种内、种间等远缘杂交，达到较大基因重组的目的。因重组的目的。u通过原生质体融合，可以使遗传性状不同的两个通过原生质体融合，可以使遗传性状不同的两个细胞融合，从而导致两套基因组之间的接触、交细胞融合，从而导致两套基因组之间的接触、交换而进行重组。然后就可以筛选出遗传性状变异换而进行重组。然后就可以筛选出遗传性状变异的后代。的后代。p 原生质体融合育种原生质体融合育种的特点的特点 u重组频率较高。重组频率较高。 由于没有细胞壁的障碍，而且在融合时又加入了由于没有细胞壁的障碍，而且在融合时又加入了融合促进

42、剂融合促进剂-PEG-PEG或用电融合仪助融，因此，原生或用电融合仪助融，因此，原生质体间的重组频率高于其他杂交方法。质体间的重组频率高于其他杂交方法。u受结合型的限制较小。受结合型的限制较小。 两亲株中任何一株都可起受体与供体的作用，因两亲株中任何一株都可起受体与供体的作用，因此有利于不同种属间的杂交。此有利于不同种属间的杂交。u遗传物质传递更为完整。遗传物质传递更为完整。 原生质体融合是两亲株的细胞质和细胞核原生质体融合是两亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，既有质配也有进行类似合二为一的过程，既有质配也有核配，比其他形式对遗传物质的传递更为核配，比其他形式对遗传物质的传递更为完整

43、。完整。u重组体种类多。重组体种类多。 两个亲本的整套基因之间发生相互接触，两个亲本的整套基因之间发生相互接触，有机会发生多次交换，所以可以产生各种有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体各样的基因组合而得到多种类型的重组体。u有助于外源基因的转化。有助于外源基因的转化。 由于原生质体已失去了细胞壁，因此它较由于原生质体已失去了细胞壁，因此它较完整的细胞更易进行遗传转化。完整的细胞更易进行遗传转化。p原生质体融合育种的一般程序和方法原生质体融合育种的一般程序和方法 u 原生质体分离原生质体分离 主要步骤包括菌丝培养、酶解、洗涤并纯化原生主要步骤包括菌丝培养、酶解

44、、洗涤并纯化原生质体等。菌丝体的生理状况、酶和酶解条件以及质体等。菌丝体的生理状况、酶和酶解条件以及渗透压稳定剂等都影响原生质体的制备。渗透压稳定剂等都影响原生质体的制备。 菌丝体的生理状况菌丝体的生理状况 一般情况下，处于线性生长期前期的菌丝体最适一般情况下，处于线性生长期前期的菌丝体最适宜制备原生质体。液体培养的菌丝体适宜制备原宜制备原生质体。液体培养的菌丝体适宜制备原生质体，产量和稳定性较为理想。生质体，产量和稳定性较为理想。l 酶及酶解条件酶及酶解条件 目前，用于原生质体制备的商品化的酶主要有纤维素目前，用于原生质体制备的商品化的酶主要有纤维素酶、酶、- -葡聚糖酶等多种酶类。其中较重

45、要的有几丁葡聚糖酶等多种酶类。其中较重要的有几丁质酶、质酶、-1-1，3-3-葡聚糖酶等。葡聚糖酶等。酶浓度、种类及组合方式等都影响原生质体的产量。酶浓度、种类及组合方式等都影响原生质体的产量。对于酶的粗制品，一般使用浓度为对于酶的粗制品，一般使用浓度为15-20mg/mL,15-20mg/mL,较纯较纯的酶则相应降低使用浓度。其他酶解条件如温度、时的酶则相应降低使用浓度。其他酶解条件如温度、时间、间、PHPH等也影响原生质形成。多数食用菌酶解温度为等也影响原生质形成。多数食用菌酶解温度为28-3028-30，最佳，最佳PHPH为为4.5-6.54.5-6.5，酶解时间一般为，酶解时间一般为2

46、-6h2-6h，有些科学家则认为控制在有些科学家则认为控制在1-1.51-1.5最佳。最佳。l渗透压稳定剂渗透压稳定剂 无机盐、糖类和糖醇类都可作为渗透压稳定剂无机盐、糖类和糖醇类都可作为渗透压稳定剂，常用浓度为，常用浓度为0.4-1.2mol/L0.4-1.2mol/L。几丁质是细胞壁的。几丁质是细胞壁的主要成分，故几丁质酶的作用比主要成分，故几丁质酶的作用比- -葡聚糖酶更为重葡聚糖酶更为重要。几种常用无机盐渗透压稳定剂系统中，几丁要。几种常用无机盐渗透压稳定剂系统中，几丁质酶活性的顺序为：质酶活性的顺序为：NONO3 3- -,Cl,Cl- -SOSO4 42-2-POPO4 43-3-

47、和和NaNa+ +,K,K+ +CaCa2+2+,Mg,Mg2+2+. .。即单价阴离子和单价阳离子能。即单价阴离子和单价阳离子能提高几丁质酶的活性，提高几丁质酶的活性，2 2价和价和3 3价离子都明显抑制价离子都明显抑制几丁质酶的活性。几丁质酶的活性。 u原生质体融合原生质体融合lPEGPEG诱导融合诱导融合 是目前进行原生质体融合的主要方法。具体操作是目前进行原生质体融合的主要方法。具体操作步骤如下：步骤如下： 用用0.6-0.7mol/L0.6-0.7mol/L甘露糖醇将纯化的原生质甘露糖醇将纯化的原生质体制成浓度为体制成浓度为10106 6/mL/mL悬浮液悬浮液 将两亲本的原生质按将

48、两亲本的原生质按1:11:1混合混合 取取1mL1mL混合液与混合液与1mL50%PEG1mL50%PEG（相对分子量为（相对分子量为4000-60004000-6000）混匀）混匀 28-3028-30下静置下静置30 min 30 min 加加2 2 mL PH 9-10mL PH 9-10甘氨酸缓冲液（含甘氨酸缓冲液（含100mmol/LCaCl100mmol/LCaCl2 2） 稀稀释释 充分混匀后在充分混匀后在28-3028-30下静置下静置20 min 20 min 1000r/min1000r/min离心离心5 min5 min，小心弃去上清液，小心弃去上清液 沉淀物沉淀物用再生

49、培养基洗涤用再生培养基洗涤2 2次次 最后用再生培养基调成最后用再生培养基调成10104 4- -10105 5/mL/mL的浓度进行培养。的浓度进行培养。l 电融合电融合 主要由两个步骤构成：首先是施加低主要由两个步骤构成：首先是施加低强度非均匀交流电场，使细胞膜发生极强度非均匀交流电场，使细胞膜发生极化形成偶极子，之后向高强度方向运动化形成偶极子，之后向高强度方向运动，整个过程叫双向电泳。然后施加直流，整个过程叫双向电泳。然后施加直流脉冲，诱导细胞的融合。脉冲，诱导细胞的融合。u原生质体再生原生质体再生 是指原生质体重新长出细胞壁，再经细胞分裂是指原生质体重新长出细胞壁，再经细胞分裂回复到

50、菌丝状态的复杂过程。但由于原生质体本回复到菌丝状态的复杂过程。但由于原生质体本身的生理状况及再生培养条件等一系列内外因素身的生理状况及再生培养条件等一系列内外因素，都可能产生大量无核的失去再生能力的亚原生，都可能产生大量无核的失去再生能力的亚原生质体，有时亚原生质体比例甚至高达质体，有时亚原生质体比例甚至高达50%50%以上。再以上。再生培养基的成分对原生质体影响较大，据报道，生培养基的成分对原生质体影响较大，据报道，改善再生条件，可提高再生频率。改善再生条件，可提高再生频率。 两个不同亲本的原生质体融合后，会形成两个不同亲本的原生质体融合后，会形成同源融合子、异源融合子以及大量未经融合的同源

51、融合子、异源融合子以及大量未经融合的亲本原生质体，如何从这一庞大的混合群体中亲本原生质体，如何从这一庞大的混合群体中准确、迅速选出异源融合子，对融合亲本进行准确、迅速选出异源融合子，对融合亲本进行标记是选择和鉴定异源融合子的必要手段。有标记是选择和鉴定异源融合子的必要手段。有营养缺陷标记、抗药性标记、荧光染色标记、营养缺陷标记、抗药性标记、荧光染色标记、灭活标记、同工酶标记、灭活标记、同工酶标记、RFLPRFLP标记及标记及RAPDRAPD标记标记等方法。等方法。u 亲本的标记亲本的标记u 融合子的鉴定融合子的鉴定 食用菌原生质体的融合子是处于质配阶段的异核体，它食用菌原生质体的融合子是处于质

52、配阶段的异核体，它可能结实也可能不结实。鉴定融合子时最好可能结实也可能不结实。鉴定融合子时最好 用几种方法互相验证。用几种方法互相验证。l菌落形态菌落形态 食用菌原生质体的异源融合子与亲本菌株在相同条件下食用菌原生质体的异源融合子与亲本菌株在相同条件下培养，其菌丝粗细、生长速度、菌落形态以及色素分泌培养，其菌丝粗细、生长速度、菌落形态以及色素分泌等均可能与亲本不同，可仔细观察比较。等均可能与亲本不同，可仔细观察比较。l拮抗反应拮抗反应 l 出菇试验出菇试验 比较子实体的形态、大小、颜色、产量和结实时间等特比较子实体的形态、大小、颜色、产量和结实时间等特征。征。l 四分体分析四分体分析 若融合子

53、产生担孢子，对孢子进行遗传分析是一种非常若融合子产生担孢子，对孢子进行遗传分析是一种非常可靠的方法。融合子形成的子实体能产生成可靠的方法。融合子形成的子实体能产生成4 4种类型的担种类型的担孢子。其中两种为亲本型，另外两种为重组型。在重组孢子。其中两种为亲本型，另外两种为重组型。在重组型中，一种为基因互补产生的野生型，另一种为具有双型中，一种为基因互补产生的野生型，另一种为具有双亲标记的双重营养缺陷型或双重抗药性菌株。亲标记的双重营养缺陷型或双重抗药性菌株。lDNADNA技术鉴定技术鉴定 如如RFLPRFLP能直接反映能直接反映DNADNA结构的差异结构的差异，RAPDRAPD技术可应用一系列

54、引物对整技术可应用一系列引物对整个基因组个基因组DNADNA进行多态性检测。进行多态性检测。是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。的性状。目的性强，可减少后期工作，易有大突破。目的性强，可减少后期工作，易有大突破。（二）基因工程简介（二）基因工程简介基因工程的基本概念基因工程的基本概念u基因分离基因分离 分别提取供体细胞的分别提取供体细胞的DNADNA及作为载体的质粒或及作为

55、载体的质粒或噬菌体。噬菌体。u基因的酶切基因的酶切 在供体在供体DNADNA中，加入专一性很强的限制性内切中，加入专一性很强的限制性内切酶，从而获得带有特定基因，并露出酶，从而获得带有特定基因，并露出“粘性粘性末端末端”的的DNADNA单链片段。对于载体的细菌质粒单链片段。对于载体的细菌质粒，也加入同样的限制性内切酶，使质粒环切，也加入同样的限制性内切酶，使质粒环切断，同样也露出粘性末端。断，同样也露出粘性末端。它的主要步骤可以概括为：它的主要步骤可以概括为：u体外重组体外重组 把供体细胞的把供体细胞的DNADNA片段与质粒片段与质粒DNADNA片段放在试管片段放在试管中，在较低的温度（中，在

56、较低的温度（5-65-6）下混合（所谓）下混合（所谓“退退火火”）u载体传递载体传递 通过载体把受体的遗传基因导入受体细胞内，通过载体把受体的遗传基因导入受体细胞内，一般可利用质粒的转化而进入受体细胞内。或一般可利用质粒的转化而进入受体细胞内。或利用噬菌体作为载体导入寄主（大肠杆菌及其利用噬菌体作为载体导入寄主（大肠杆菌及其噬菌体）。噬菌体）。u复制、表达复制、表达 在受体细胞中，杂种质粒能通过自我复制而增殖。并使在受体细胞中，杂种质粒能通过自我复制而增殖。并使受体细胞表达出供体所提供的某种目的基因的遗传性状受体细胞表达出供体所提供的某种目的基因的遗传性状。u筛选、繁殖筛选、繁殖 重组后的杂种

57、质粒是否能够按照原定的工程设计正常繁重组后的杂种质粒是否能够按照原定的工程设计正常繁殖和表达等问题尚须检验，以便能在大量个体中筛选出殖和表达等问题尚须检验，以便能在大量个体中筛选出具有优良性状态个体，然后才可以加以繁殖和利用。具有优良性状态个体，然后才可以加以繁殖和利用。同宗结合同宗结合异宗结合异宗结合选择育种技术选择育种技术杂交育种技术杂交育种技术诱变育种技术诱变育种技术 原生质体融合技术原生质体融合技术 基本概念第一节 物理消毒灭菌法第二节 化学消毒灭菌法食用菌栽培中消毒灭菌基本概念杀死一切微生物，包括芽孢。灭菌分为杀菌：菌体尚存溶菌：菌体消失消毒：只杀死病源菌，未伤及芽孢防腐：暂时抑制微

58、生物生长除菌：用冲洗、过滤等法，除去微生物是保证生产成功的重要手段 第一节 物理消毒灭菌法一、热力灭菌二、紫外线灭菌一、热力灭菌（一）原理高温使菌体蛋白质、核酸、酶等凝固或变性失活。（二）方法 湿热灭菌 干热灭菌（一）干热灭菌热源火焰及热空气特点简便、快速、范围有限方法小的金属、玻璃器皿酒精灯烧烘箱烤大的玻璃、金属器皿器皿包装1601702h干燥箱使用注意70以下开箱取物勿超180随用随开包 （二）湿热灭菌特点范围广、温度低、效果好、时间短热蒸气或热水热源方法高压蒸汽灭菌常压蒸汽灭菌巴 氏 消 毒蛋白质凝固点与其含水量的关系蛋白质含水量(%)凝固温度()50251860567480809014

59、5160170热蒸气穿透力大蛋白质凝固点随其含水量的增加而降低因为干热灭菌与湿热灭菌穿透力的比较加热方式传导介质温度()加热时间（h）透过布层温度（）结果20层40层100层干热空气130140 486 7270以下灭菌不完全湿热饱和蒸汽 105.3 3101 10l 10l灭菌完全1.高压蒸气灭菌概念利用高压产生的高蒸汽温度杀灭微生物的方法 原理水沸点随热蒸汽压力的增加而升高密闭锅蒸气多压力高沸点高步骤：装锅加热排气升压保压灭菌降压出锅关键：排净冷空气注意灭菌时间和压力因物而异升降压力要稳灭菌时间从保压时算起压力降至“0”才能开盖使用排气纯蒸气压力与温度的关系1kg/cm2=0.098Mpa

60、(兆帕）=98Kpa（千帕）2.常压蒸汽灭菌 概念利用常压产生的100蒸汽温度进行灭菌的方法 特点设备简，成本低，灭温低，时间长用法一次性灭菌（100 ，10余h)尽快达到100 达到100 时开始计时灭菌中勿降温，勿干锅灭菌池3.巴氏消毒概念利用低于100的温度杀灭有害微生物的方法 培养料堆积发酵料温6070杀死有害微生物方法二、紫外线灭菌概念 利用电子射过水银气体 产生的紫外线而杀菌的方法 杀菌机理直接：使蛋白质、酶等变性失活间接：空气中产生臭氧或过氧化氢使用有效距离：1.52.0m理想波长：265nm30w紫外灯照30min避光30min便携式透力很弱定期更换灯管只起辅助作用伤眼睛和皮肤