-利用生物合成原理寻找微生物新药（精品）

1、第三章 利用生物合成原理寻找微生物新药根据微生物药物的生物合成原理发现微生物新药的方法和途径通过非基因定向改变、基因定向改变，以及组合生物催化的技术，或是改变原有微生物药物的生物合成途径，或是对原有的微生物药物或先导化合物和中间体进行生物催化，以发现微生物新药 .产生菌前体物质(1) 诱变处理化学修饰天然产物衍生物天然产物天然中间物天然产物衍生物 阻断或非阻断菌株定向与杂交生物转化与 组合生物转化 微生物或酶转化天然产物类似物杂合工程菌突变生物合成组合生物合成(2) 基因操作天然产物类似物(1)(2)天然产物类似物定向与杂交生物合成化学修饰微生物药物生物合成与微生物新药发现的根本途径 通过非基

2、因定向改变的方法包括：定向生物合成、杂交生物合成、突变生物合成，以及生物转化与组合生物转化；基因定向改变，即为组合生物合成。 第一节生物合成途径的非基因定向改变与微生物新药的发现一、非遗传操作的定向生物合成与微生物新药的发现已有的研究说明，在抗生素等次级代谢产物生物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的代谢产物在其发酵液中积累；但由于生物合成酶的底物专一性较低宽泛性，其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中添加一些结构类似物作为前体物质，可以产生含有与这种结构类似的新衍生物；这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之为非遗传操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。 前体pr

3、ecursor即在微生物培养过程中，外源添加的某一化学物质，通过微生物的代谢，能够将其整体地或局部地整合到某一特定的次级代谢产物的分子中去的化合物，如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等。非遗传操作的定向生物合成这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质，使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种前体的产物的方法，即为非遗传操作的定向生物合成。其根本原理是由于参与这些反响的生物合成酶的底物专一性较差，而能使外源添加的某些前体物质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。 定向生物合成与微生物新药的发现次级代谢产物合成酶的特点：是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。参与催

4、化反响的酶的底物专一性比初级代谢合成酶要差。应用实例应用非遗传操作定向生物合成的方法能够制备获得许多新的抗生素，其中目前已进行工业化生产的有：青霉素G和V；培罗霉素；四环素和金霉素等。 青霉素定向生物合成序号侧 链 R学 名俗 名1对羟基苄青霉素青霉素X2苄青霉素青霉素G3戊烯2青霉素青霉素F4戊青霉素青霉素二氢F5庚青霉素青霉素K6丙烯巯甲基青霉素青霉素O7苯氧甲基青霉素青霉素V84氨基4羧基丁基青霉素青霉素N青霉素和6APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称青霉素分子的化学结构6APA的化学结构各种天然青霉素具有的侧链和名称培罗霉素定向生物合成.培罗霉素定向生物合成可结合进入BLM的末端

5、胺基局部的非天然胺基化合物.* PEP的末端胺基四环类抗生素的定向生物合成R5R6R76去甲基四环素HHH(1)7氯6去甲基四环素HHCl(2)四环素HCH3H(3)5羟基四环素（土霉素）OHCH3H(4)7氯四环素（金霉素）HCH3Cl(5)微生物发酵产生的一些四环素类抗生素四环类抗生素的定向生物合成 在生产金霉素时需添加氯化物作为前体，而当生产四环素时，那么必须要在发酵培养基中添加氯离子抑制剂，如溴化物或M-促进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四环素产物。 另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程中添加适量的甲基化反响抑制剂如磺胺嘧啶钠，能够获得去甲基金霉素。 非基因改变定向生物合成的研究进展

6、 尽管近年来基因改变的定向生物合成开展很快，但利用非遗传操作定向生物合成原理寻找新的生理活性物质的研究还在不少实验室继续进行，特别是对一些肽类如环孢菌素A、aureobasidins及糖肽类如替考拉宁产生菌的定向生物合成研究取得了很大的进展。二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成与微生物新药的发现 杂交生物合成hybrid biosynthesis似乎可以理解为是一种“强化的非遗传定向生物合成，如在苦霉素产生菌发酵过程中添加聚乙酰途径中-酮酯酰基合成酶抑制剂线兰菌素(cerulenin)，使其失去合成苦霉素大环内酯苷元(picronolide)的能力而只能合成糖基。同时在发酵过程中添加泰乐菌素大环

7、内酯苷元(protylonolide)，使其与苦霉素生产菌产生的糖基结合，得到一种被称之为M4365G1的杂合抗生素(hybrid antibiotic)。 杂交生物合成与微生物新药的发现葡萄糖1CH3COOH6CH3CH2COOH2CH3COOH5CH3CH2COHCH3CH2CH2COOHS.fradia KA427 NO.261ProtylonolidePicronolideDesosaminePicromycin DDesosaminyl Protylonolide（M4365G1） 在浅蓝菌素存在下，用苦味霉素产生菌（S.sp.AM4900） 与protylonolide 杂交生物合

8、成M4365G杂交生物合成产物工业化的可能性 尽管通过杂交生物合成能够得到一些新的抗生素，但由于所添加的浅蓝菌素本身就是一种昂贵的抗生素，再那么所添加的苷元的结构受到限制，所以这种方法似乎没有很大的实际意义。 三、非定向诱变的突变生物合成与微生物新药的发现突变生物合成mutational biosynthesis：突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理等因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产物的能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养阻断突变株时添加某种外源物质，参与生物合成以获得新的次级代谢产物的过程。另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产生新的次级代谢产物。突变生物合成原理阻断突变株的类型

9、营养缺陷型突变株： 由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突变，而使菌体不能生长，导致不能合成次级代谢产物。因此，这类突变株也可以称为初级代谢阻断突变株。独需型突变株： 这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变，而使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变生物合成所需要的突变株。双重阻断突变株： 即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上，也发生在编码次级代谢酶的基因上。突变生物合成与微生物新药发现.野生型产生菌独需型突变株AB正常途径某抗生素阻断变株A阻断变株BAB+BA+ABABA，B为某一抗生素分子结构的两个部分AB为发酵液培养时阻断变株的代谢产物BA为发酵培

10、养时添加的的结构类似物ABAB即为新的杂合抗生素利用独需型突变株合成产生新抗生素的根本原理AB突变生物合成的根本流程.出发菌株的选择诱变处理阻断突变株筛选琼脂块法选择有生理活力的突变株无生理活力的突变株摇瓶复筛有生理活力的突变株无生理活力的突变株区段合成产物，连接酶等生化特性的研究有区段合成产物、无连接酶等活性的突变株有区段产物A有连接酶等活性的突变株有区段产物B有连接酶等活性的突变株发酵培养添加结构类似物A或B样品收集TLC、HPLC检测及制备结构检测突变生物合成产生的新抗生素.菌种抗生素特殊营养增补物新抗生素伊尼奥小单孢菌西梭霉素DOS链霉胺等突变霉素1等绛红小单孢菌庆大霉素DOS链霉胺等

11、2羟基GM等红霉素链霉菌红霉素Erythronolide8，8 deoxyoleanolie未鉴别弗氏链霉菌新霉素DOS链霉胍等杂交霉素A，B加利利链霉菌阿克拉霉素阿克拉酮紫红霉酮等11羟基阿克拉霉素A灰色链霉菌链霉素紫红霉酮等2脱氧链霉胍streptomutin A卡那霉素链霉菌卡那霉素DOS1N甲基DOS等1N甲基GM等雪白链霉菌新生霉素氨基香豆氨基香豆素同系物未鉴明核糖苷链霉菌核糖霉素DOS1N甲基DOS等1N甲基RSMC等普拉特链霉菌普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5Omycaminosyl narbonolide龟裂链霉菌巴龙霉素DOS链霉胍杂交霉素C巴龙链霉菌

12、尼可霉素尿嘧啶嘧啶尼可霉素Z等唐德链霉菌红霉素生物合成途径.丙酰CoA丙酰SACP甲基丙二酰CoA甲基丙二酰SACP丙酰丙酰SACP聚酮体途径6脱氧红霉内脂B红霉内脂BTDPL碳霉糖 葡萄糖TDPD葡萄糖3O碳霉糖基红霉内脂TDP脱氧氨基己糖 红霉素D红霉素C红霉素A红霉素E红霉素B缩合酶突变株产生的新蒽环类抗生素.RR1R2道若霉素（原株产生）OCH3COCH3OH亚德里亚霉素（变株产生）OCH3COCH2OHOH13双氢道若霉素（变株产生）OCH3CHOHCH3OH13双氢洋红霉素OHCOCH3OH11去氧道若霉素（变株产生）OCH3COCH2OHH11去氧亚德里亚霉素（变株产生）OCH3

13、CH2CH3HBaumycinA*（原株产生）OCH3CH2COCH3OHFeudomycin A（变株产生）OCH3CH2CH3OHFeudomycin BOCH3CH2COCH3OH突变株产生的一些新的次级代谢产物.原菌种原抗生素突变株产生的新抗生素普拉特链霉菌普拉特霉素demycarosyl普拉特霉素9dehydromycarosyle普拉特霉素波赛链霉菌紫产色链霉菌柔红霉素烬灰红菌素阿霉素烬灰红菌素X波赛链霉菌baumycinoxaunomycin棘孢小单孢菌庆大霉素小诺霉素生金链霉菌四环素去甲基四环素生金链霉菌金霉素去甲基金霉素龟裂链霉菌土霉素去甲基土霉素吸水链霉菌carriomyc

14、incarromycinA我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素.2H2SO4庆大霉素和小诺霉素的化学结构抗生素R1R2分子式硫酸庆大霉素C1CH3NHCH3C21H43N5O72H2SO4硫酸庆大霉素C1aHNH2C19H39N5O72H2SO4硫酸庆大霉素C2CH3NH2C20H41N5O72H2SO4小诺霉素HNHCH3C20H41N5O72H2SO4四、原生质体融合与微生物新药的发现微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗溶液的条件下混合，并参加物理的如电融合或化学的(如聚乙二醇)或生物的如仙台病毒助融条件，使双亲株的原生质发生相互凝

15、集，通过细胞质融合，核融合，此后发生基因组间的交换，重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物细胞壁，获得重组子的过程。利用微生物原生质融合寻找新抗生素的根本原理是来源于两种产生不同抗生素的产生菌的融合子，有可能将它们的局部生物合成基因整合在一起而产生新的杂合抗生素；另一个原理是由于抗生素产生菌中存在着沉默基因，当这些沉默基因受到外源物质刺激后，有可能被激活而产生结构与亲株完全不同的新的抗生素。 应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲哚佐霉素indloizomycin：其亲株为链霉素产生菌灰色霉菌和天神霉素istamycin产生菌天神链霉菌S. tenjimariensis。第二节生物合成途径的基

16、因定向改变与微生物新药的发现组合生物合成Combinatorial biosynthesis 是一种通过对天然产物生物合成途径中的基因进行中断、置换及重组等操作，改变原来抗生素产生菌或其他天然产物产生菌生物合成代谢产物的途径，产生具有新颖结构的“非天然的天然杂合产物unnatural natural hybrid compounds的技术或方法。 组合生物合成的潜能 potential重组、组合、互补、替换 R=可利用的基因 n=基因的等位形式化合物数Rn R=4, n=4 Compounds=44=256组合生物合成的原理 生物合成酶基因的结构和组成 生物合成酶基因的特异性及底物宽容性 生物

17、合成酶基因之间的相互作用 生物合成途径的研究根底一、具有聚酮体生物合成途径的微生物药物产生菌的组合生物合成 一些具有聚酮体生物合成polyketide synthases，PKSs途径的“天然产物，如红霉素、阿维菌素、泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司和利福霉素等可采用组合生物合成。 具PKS途径的抗生素药物类别 化 合 物 大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素抗肿瘤抗生素 柔红霉素，阿克拉霉素、enediynes 抗寄生虫药 avermectin，nemadectin 免疫抑制剂 FK506, rapamycin 抗真菌药 两性霉素，制霉菌素

18、心血管药物 lovastatin,，compactin兽药莫能星（monensin），泰乐菌素 (tylosin)，盐霉素1、红霉素产生菌的组合生物合成 通过操作PKS的模块中单个基因的组合生物合成； 在非天然产物产生菌中过量表达组合生物合成产物； 通过操作PKS模块之间连接的组合生物合成 ； 通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成。红霉素产生菌的组合生物合成的可能性参与红霉素生物合成的PKSs，或6脱氧红霉内酯合成酶6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS有6个模块组成，每个模块负责合成聚酮体中的一局部。由于各模块之间的协调性，以及每个模块延伸单位的选择、功能和

19、立体化学性质的催化结构域，因此，就有可能通过对PKSs结构域或模块的操作获得具有新颖结构的化合物。由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂和具有众多的立体异构体，因而，难以用常规的化学方法来获得。 红霉素的生物合成途径 PKS中的每一个模块的组成酮基合成酶ketosynthase，KS酰基转移酶acyl transferase，AT酰基载体蛋白acyl carrier protein，ACP-酮基修饰酶：包括酮基复原酶ketoreductase，KR、脱氢酶dehydrogenase，DH和烯酰复原酶enoylreductase，ERDEBS含有编码三个独立的多肽亚单位的6个模块大多数典型的聚

20、酮体合成途径的产物包括对PKS产物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及通过细胞色素P450进行氧化。图中所示的LD为装载域loading domains，TE为硫酯酶esterases。 1通过操作PKS的模块中单个基因的组合生物合成 一是用利福霉素PKS模块2中的DH/ER/KR结构域取代红霉素PKS模块2中的KR；二是将模块5中的KR缺失；三是用利福霉素模块2中的丙二酰特异性AT取代模块6中的甲基丙二酰特异性的AT，将得到一个发生三重突变的PKS产物。 2在非天然产物产生菌中过量表达组合生物合成产物 将 开发成能够表达PKS产物需要解决的问题主要有三个方面：一是能够功能性表达巨大的蛋白

21、330kDa；二是PKS亚单位的ACP结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化；三是聚酮体途径中的前体物质，特别是2S甲基丙二酰CoA在中不存在。 Pfeifer等的工作包括：运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶NRPS基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶phosphopantetheinyl transferase基因sfp，以对PKS亚单位的ACP结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化；过量表达中的丙酰CoA合成酶基因prpE，扰乱丙酰CoA代谢途径，以及过量表达来自的丙酰CoA羧化酶基因pcc，使丙酰CoA转化为2S甲基丙二酰CoA 3通过操作PKS模块之间连接的组合生物合成 通过对DEBS模块在

22、和体外的表达研究，发现在PKS装配过程中那些短的模块内和多肽内的“连接件是至关重要的成分。研究发现在相继非共价连接的模块中，其氨基和羧基末端存在有多肽内连接件，这种连接件与单个多肽内的模块之间的连接件不同。因此，使用一种适宜的连接件就有可能允许杂合的模块之间进行功能性连接。 a：已经鉴定了不同的模块内和多肽内的连接件，并由此指导合成模块之间的聚酮体中间体，这里需要适宜的氨基和羧基末端连接配对，以产生功能性连接模块；b：在构建功能性互补体时，可以使用编码来源于不同微生物多个模块的全亚基；如下图：来源于苦霉素picromycin的PKSPikAI和PikAII，与来源于竹桃霉素oleandomyc

23、in的PKSOleA3相结合。 4通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成对已经发现的由自然界中植物、真菌和细菌产生的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析发现，连接在苷元上的糖基的结构大多为6-脱氧己糖6-deoxyhexoses, 6DOHs。据统计，这些具有生理活性的糖苷类化合物的结构上含有70多种不同的6-脱氧己糖。6-脱氧己糖的种类具有生理活性的化合物产生菌*D-Desosamine红霉素竹桃霉素苦霉素巨大霉素Sacc.erythraeaS.antibioticusS.VenezuelaeM.megalomiceaD-Olivose光辉霉素乌达霉素Landomycin S.argillac

24、eusS.fradiaeS.cyanogenusD-Oliose光辉霉素S.argillaceusD-Mycarose光辉霉素S.argillaceusD-Mycaminose泰乐星S.fradiaeD-Mycinose泰乐星S.fradiaeD-Mycosamine制霉菌素S.nourseiL-Dihydrostreptose链霉素S.griseusL-Oleandrose竹桃霉素阿弗米丁S.antibioticusS.avermitillisL-Mycarose红霉素巨大霉素泰乐星Sacc.erythraeaM.megalomiceaS.fradiaeL-Noviose新生霉素S.sphe

25、roidesL-Rhodinose乌达霉素LandomycinGranaticin S.fradiaeS.cyanogenusS.violaceoruberL-Daunosamine柔红霉素S.peucetiusL-NogaloseNogalamycin S.nogalaterL-Megosamine*巨大霉素M.megalomiceaL-Rhodosamine阿克拉霉素S.galilaeusL-EpivancosamineChloroeremomycin A.orientalis2-Deoxy-L-fucose阿克拉霉素S.galilaeus由放线菌产生的具有不同生理活性的糖苷化合物的结构特

26、性具有单糖残基的化合物：乌达霉素A、柔红霉素、urdamycin A和rebeccamycin；具有双糖残基的化合物：光辉霉素mithramycin；具有三糖残基的化合物：乌达霉素Aurdamycin A和光辉霉素前者同时具有单糖和三糖残基，后者同时具有双糖和三糖残基；以O-糖苷键连接的化合物：红霉素A、光辉霉素、柔红霉素和乌达霉素A；以C-糖苷键连接的化合物：乌达霉素A；以N-糖苷键连接的化合物：rebeccamycin。由放线菌产生的具有不同生理活性的糖苷化合物的化学结构 a通过将竹桃霉素产生菌中齐墩果糖基转移酶基因在不同的中的表达，得到了3O鼠李糖基红霉素和6dEB衍生物，以及一个des

27、osaminylated tylactone；b改造来源于刺孢霉素calicheamicin产生菌的基因，可以得到一个新的脱氧氨基糖，并将其附着在产生的苷元上； c在产生菌中构建desosamine的途径，然后导入通过遗传操作的DEBS，可以得到具有新颖结构的desosaminylated大环内酯类文库。 将竹桃霉素产生菌抗生链霉菌中编码竹桃霉素oleandrose糖基转移酶的基因oleGII，该酶负责将相应的糖基转移到8，8a-脱氧竹桃内酯8，8a-deoxyoleandolide的4位羟基上，整合到红霉素产生菌eryBV缺失突变株中，eryBV基因编码的糖基转移酶负责将L-mycarose

28、糖基转移到6-脱氧红霉内酯6-deoxyerythronolide甙元的相同位置，并进行表达，结果得到了将天然糖基L-rhamnose转移到6-脱氧红霉内酯4位的新红霉素衍生物，其具有抗菌活性， 将泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌中编码mycaminose糖基转移酶基因tylM2整合到红霉素产生菌三缺失突变株SGT2，分别缺失聚酮体合成酶基因、mycarose和desosamine糖基转移酶基因，但仍然具有合成L-mycarose和D-desosamine的能力，并使之表达，同时在培养过程中外源参加16-元环的泰乐酮tylactone，结果得到一种新的泰乐星衍生物5-O-desosaminyl-tyl

29、actone，如图所示。说明泰乐菌素产生菌中的转移酶TylM2能够识别和转移不同的氨基糖。这两个例子同时也说明抗生素糖基转移酶具有较宽的底物专一性。5通过表达杂合基因方法的组合生物合成 第一个例子是应用有些大环内酯类抗生素3位或糖基4位的羟基酰化酶基因，使某些大环内酯类抗生素在相应的位置酰化：1异戊酰螺旋霉素来自碳霉素的4异戊酰辅酶A转移酶的carE基因 ；2丙酰螺旋霉素来自麦迪霉素的4丙酰化酶的mpt基因；3乙酰泰乐菌素等来自碳霉素的3O乙酰转移酶的acyA基因。 引入外源酶基因产生杂合抗生素丙酰螺旋霉素基因工程菌构建图必特螺旋霉素的结构R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3

30、 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH32、蒽环类抗生素产生菌的 组合生物合成略 蒽环类抗生素是一类临床上非常重要的抗肿瘤抗生素，它们同样是PKS生物合成途径，因此，通过以下集中组合生物合成的方法，可以得到一系列“非天然的天然杂合化合物。1通过破坏靶基因的组合生物合成 通过基因框内的诱变或缺失，或插入抗生素耐药基因盒的方法，可以将所选择的靶基因特异性地钝化； 尽管靶基因的破坏可以得到新的化合物，但会出现错误的结果，这是因为一方面由于极性效应影响下游基因的表达，另一方面受到由于外源DNA片断的插入造成的反义RNA合成影响上游基因。 1通过破坏靶基因的组合生物合成

31、在光神霉素mithramycin产生菌中，破坏编码葡萄糖1磷酸胸苷5三磷酸胸苷转移酶的基因mtmD后，获得了两个四环类的光神霉素衍生物：premithramycinone和4脱甲基premithramycinone衍生物； Premithramycinone的抗肿瘤生物活性与光神霉素相似，且有趣的是其化学结构与来源于黑曲霉的神经肽受体抑制剂BMS非常相似，如下图。 通过基因破坏后得到的两个光神霉素衍生物和BMS-192548 2通过表达杂合基因方法的组合生物合成 来源于的urdE基因，编码一种氧化酶，其可能涉及到将1分子氧引入到乌达霉素结构中； 在控制启动子ermE的条件下，将其在丁省霉素C产

32、生菌中表达，产生一种新的杂合化合物，6羟基丁省霉素C，如下图。 通过将乌达霉素产生菌的urdE基因在丁省霉素C产生菌 中表达，得到一种杂合产物6羟基丁省霉素C2通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 另外一个实例是，将柔红霉素产生菌中编码11-aklavinone-羟化酶的基因dnrF，在阿克拉霉素产生菌中表达，结果得到了一种新的杂合化合物，11羟基阿克拉霉素A，如下图。 这种羟基化的产物，其对白血病细胞和黑色素瘤细胞的生物活性比阿克拉霉素要强。 杂合化合物11羟基阿克拉霉素A的组合生物合成 2通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 通过这种组合生物合成的方法，已经获得了数个杂合糖苷化的丁省霉素，

33、如用含有一个完整埃罗霉素elloramycin基因簇具有产生8去甲基丁省霉素C的能力的黏粒转化乌达霉素产生菌或光神霉素产生菌，可以得到四种新的糖苷化合物：齐墩果糖基、鼠李糖基、mycarosyl丁省霉素C和双齐墩果糖基丁省霉素C，如下图。 有趣的是，这些脱氧糖在乌达霉素和光神霉素苷元上的附着位置，与在埃罗霉素的附着位置不同。说明，这些聚酮体的糖基转移酶具有底物宽泛性。 杂合糖苷化丁省霉素的组合生物合成 能够被ElmGT糖基转移酶转移的一些 糖基和elloramycin甙元的结构 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 通过钝化dnmV基因，得到一个柔红霉素和

34、阿霉素产生菌的阻断突变株，dnmV基因编码4酮基复原酶，其与合成这类抗生素结构中的脱氧糖，柔毛霉胺的合成有关。 分别将阿维菌素产生菌中编码合成齐墩果糖的基因avrE，以及红霉素产生菌中编码合成mycarose的基因eryBIV，克隆到dnmV基因阻断突变株中。 由于重组工程菌中的外源基因表达的4-酮基复原酶的特性与柔红霉素产生菌中的4-酮基复原酶不同，前者具有非对映立体催化特性而能够形成L-epidaunosamine表柔毛霉氨。而突变株dnmV生物合成甙元的能力和合成糖基转移酶的能力仍然保持，且由于糖基转移酶的底物专一性较差而不影响将表柔毛霉氨连接在原来的蒽环酮上，从而得到4-表柔红霉素和4

35、-表阿霉素，如下图。表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建二、具有非核糖体生物合成肽类途径的微生物药物产生菌的组合生物合成 具有非核糖体生物合成途径none ribosomal peptide synthases，NRPSs的环肽或糖肽类“天然产物，如万古霉素、博莱霉素、环孢菌素A和埃坡霉素等进行了大量的研究工作，并取得了令人注目的成果。Chloroeremomycin 生物合成 1小分子准备 在酶的催化下生成装配过程中需要的小分子化合物，对于万古霉素族糖肽类抗生素而言包括：非蛋白氨基酸和TDP-L-b-epivancosamine；2装配 上步准备好的氨基酸通过腺苷化反响adenylation

36、转换成为腺苷酸，而后与邻近肽载体蛋白peptide carrier protein, PCP上的巯基形成硫酯thiolation，PCP之间的缩合功能域condensation催化肽键形成。经过几个延伸过程，最后TE域将完成的肽切下。有时过程中还会有差向异构作用(epimerisation)。3装配后修饰 在这步反响中通常进行氧化反响和糖基化，对于有的化合物还存在N端甲基化反响。万古霉素的生物合成 另据研究，天然的万古霉素生物合成共有35步，其先以五种自由的氨基酸单体合成一线形的七肽，然后芳基侧链在交联酶的催化下适时地组合、交联，形成复杂的七肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-ep

37、i-vancosamine在糖基转移酶的作用下连接到七肽骨架上。万古霉素生物合成的五种起始自由氨基酸单体 万古霉素生物合成的逆向合成分析图 在万古霉素家族中发现的糖基 GtfE糖基转移酶识别并将UDP-glucose转移至七肽骨架上 GtfD糖基转移酶识别并将4epivancosamine连接至万古霉素骨架上 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状糖肽类抗生素的组合生物合成主要有4条途经:第一，提供新的氨基酸单体，或者是利用生物合成途经中的酶来催化生成新的我们所需要的氨基酸单体，使合成新的七肽骨架;第二，改变七肽NRPS装配线上的基因，从而到达重新设计生物合成途经的目的;第三，在七肽装配之后

38、，干预修饰酶tailoring作用的步骤，包括N甲基化、酪氨酸的羟化等;第四，利用糖基转移酶将不同结构的糖基与不同苷元连接以及连接不同的个数，从而产生具有不同生理活性的最终产物。因此糖苷化酶可以作为一种制备各种不同糖苷化合物的催化剂，有可能从中找到具有潜在应用价值的新活性物质。2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状Solenberg等从万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌中克隆到了两个糖基转移酶基因gtfE和gtfD，并从chloroeremomycin产生菌中克隆到了3个糖基转移酶基因gtfA、gtfB和gtfC;将gtfB和gtfE在大肠埃希氏菌中表达，研究了其体外活性。结果说明当TDP-葡萄糖

39、存在时，从大肠埃希氏菌中表达的糖基转移酶GtfB和GtfE能够在体外将葡萄糖转移到万古霉素糖苷上，从而得到中间体DVVdesvancosaminyl vancomycin;当底物换为UDP葡萄糖，UDP-D-木糖时，仍然能够转移到万古霉素糖苷上;GtfE也能够将TDP/UDP-葡萄糖转移到无糖基化的化合物A47934和A41030上，而GtfB不能将化合物A47934糖基化，说明GtfE相对于GtfB底物特异性差。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状在Matsushima等建立地无糖基化合物A47934产生菌丰加链霉菌Streptomyces toyocanesis基因转移系统的根底上，

40、Solenberg等还成功地将含有糖基转移酶基因gtfE的质粒导入到丰加链霉菌中，得到了糖基化的A47934衍生物。GtfE和GtfB在体内进行的糖苷化反响 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状Losey等采用化学和酶法合成了很多NDP-葡萄糖的类似物来研究GtfD和GtfE的催化活性。结果说明，GtfE不但能用UDP-葡萄糖类似物，TDP-葡萄糖类似物作为糖基供体，同时还可以采用脱氧葡萄糖类似物以及氨基在2、3、4、或6位的TDP/UDP-葡萄糖类似物作为糖基供体;更值得注意的是，一般来讲GtfD将vancosamine连接至万古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，试验结果说明GtfD还可以将4

41、-epi-vancosamine连接至GtfE以不同的糖基供体为底物所催化生成的衍生物上糖基化位点在2-脱氧的除外。这样产生的带有两个氨基糖的万古霉素衍生物就提供了一种新的结构，以便于继续进行类似于oritavancin的烷基化从而提高生物活性。2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状Chen等从chloroeremomycin 的生物合成基因簇中克隆到了L-epivancosamine的合成基因，在大肠埃希氏菌中表达，并成功地在体外重建了从TDP-4-酮基-6-脱氧D-葡萄糖经过C-2脱氧合作用(deoxygenation)、C-3胺化(amination)、甲基化(methylation)、C-4酮基复原、C-5表构异化等步骤得到了TDP-L epivancosami