[自然科学]高效液相色谱HLPCppt课件

1、高效液相色谱 high performance liquid chromatography,HPLC中南大学湘雅医学院医学检验系 徐克前一根本原理一定义 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同，进展延续的、无数次的交换和分配而到达分别的过程。 组成： 固定相柱内填料 流动相洗脱剂二固定相stationary phase)和 流动相mobile phase(1)化学键合相硅胶化学官能团键合到硅胶外表 OH OH | |硅胶SiO2 nH2O Si O Si | |键合相反响 R1 | | | | Si OH + XSiR Si OSiR + HX | | | | R2 硅

2、胶 有机硅烷 键合相X: Cl、CH3O、C2H5O等R: 烷C8(C8H17) 、C10(C10H21) 、C18(C18H37)等R1 R2: Z、CH3等(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料octadecylsilyl,ODS万能柱 即C18柱或ODS柱 主要用于反相HPLC中，适用于各种类型的生物分子 (3) 短链烷基键合物 短链烷基c3、 c4等大孔硅胶 键合物 适用于氨基酸、小肽等生物小分子(4)键合到基质上的官能团性质 反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，如 C18 、C8 、C4等 正相柱：填料是非极性的，官能团为CN、NH2等 离子交换键合相：阳离子官能团：SO3H、2、流动相

3、 mobilephase 流动相选择原那么： 1.样品易污，且溶解度尽能够大2.化学性质稳定，不损坏柱3.不妨碍检测器检测分析4.粘度低，流动性好5.易于从中回收样品6.无毒或低毒，易于操作7.易于制成高纯度，即色谱纯8.废液易处置，不污染环境二、分别方式 正相HPLC 反相HPLC 离子交换HPLC 凝胶HPLC 亲和HPLC一正相HPLCnormal phase HPLC ,NP- HPLC 固定相：极性吸附剂或极性键合相，如硅胶、Al3O2 流动相：非极性或弱极性溶剂，如己烷、庚烷等 洗脱顺序：非极性、弱极性、极性 运用：石油化工产品、染料、农药、医药、有机酸、有机碱等二反相HPLCre

4、verse phase HPLC ,RP- HPLC 固定相：非极性物质，如C18(ODS)、 C10、C8 、C6 、C4 、C2 流动相：极性溶剂，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等 洗脱顺序：极性、弱极性、非极性 运用：蛋白质、多肽等三离子交换HPLCion-exchange HPLC ,IE- HPLC 原理：用离子交换剂作固定相，根据不同组分在一定pH下，组分电荷性质和数量不同而分别的技术 分类：阳离子交换树脂：合酸性基团： 四凝胶HPLCgel HPLC ,G- HPLC 原理：基于分子大小和外形的差别进展分析的技术 固定相：交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶 流动相：水、乙醇、丙酮等 运用：

5、核酸、蛋白质、酶、多糖等五亲和HPLCaffinity HPLC ,AF- HPLC 原理：利用生物大分子间专注的亲和力进展分别的技术 固定相：基质琼脂糖凝胶等交联配基亲和性 运用：酶、抗体、抗原、受体等三、 HPLC仪器 HPLC仪 普通由输液系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录和数据处置系统及计算机等几部分组成一输液系统：贮液及脱气安装梯度洗脱安装高压输液泵梯度洗脱安装高压输液泵二进样系统：三柱系统：四检测器：与泵、柱组成HPLC的三大关键部件1.紫外吸收检测器2.荧光检测器4.示差折光检测器 表.HLPC常用检测器 检测器 原理 检测下限g/ml 检测范围 紫外检测器 具有紫外吸收性质

6、10-7 荧光检测器 具有荧光物质 10-14 电化学检测器 具有电解活性物质 10-12 示差折光检测器 与流动相折光率不同 10-7 糖类等五不同HPLC产品引见：高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器2 2高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器3 3高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器4 4四、定性和定量定性分析保管值定性：比较未知峰与规范物的保管值搜集未知峰洗脱液定性：物理分析，化学分析，生物学分析联机定性：液质联用液红联用定量分析 分析检测物质的量或浓度与检测器的呼应值峰面积或峰高呈正比 1.规范曲线法：也称外标法或直接比较法。用规范品等体积直接进样，得规范曲线，再用待测样品的峰面积或峰高与其对照 2.内标