阿尔茨海默病发病机理、诊断及治疗的实验研究

1、阿尔茨海默病发病机理、诊断及治疗的实验研究 华中科技大学 博士学位论文 阿尔茨海默病发病机理诊断及治疗的实验研究 姓名吴军 申请学位级别博士 专业神经病学 指导教师张苏明 2021-04 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 阿尔茨海默病发病机理诊断及治疗的实验研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院 博士研究生吴 军 博士生导师张苏明 摘 要 研究背景 阿尔茨海默病Alzheimers diseaseAD 是一种中枢神经系统退行性疾病主 要表现为记忆和认知功能障碍行为及人格异常改变随着年龄增长发病率逐年攀升 21 世纪人口老龄化问题突显AD 将成为威胁老年人生活质量并导致死亡的最严

2、重疾 病之一这给患者家庭及社会带来了极大的痛苦和沉重的负担但时至今日其发 病机制仍不十分清楚诊断手段严重滞后特效的治疗方法更是无从谈起因此明 确其发病机理探索早期高效诊断方法寻找有明显疗效药物已成为当前和将来应对 AD 的三个环节其重要性不言而喻其紧迫性迫在眉睫 目的 1 探讨-淀粉样蛋白 -amyloid A 致神经组织和 BV2 小胶质细胞产生炎 性反响的机制 2 探讨脂氧素A lipoxin A LXA 抑制-淀粉样蛋白 -amyloid A 所致 4 4 4 炎性反响的机制及其用于治疗阿尔茨海默病 Alzheimers diseaseAD 的前景 3 通过靶向纳米造影剂结合核磁共振成像

3、对AD 脑内的老年斑班病灶进行 活体显像以明确AD 的诊断 方法 1 用A 刺激小鼠小胶质细胞系BV2 cells 和C57BL6 小鼠颅内神经组 1-42 2 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 织或用吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 PDTC 预处理后再给予A 刺激 1-42 然后取相应的标本分别检测IL- 1和TNFa 蛋白及mRNA核因子NF-B p65 及其抑制蛋白IkBa 的表达并对细胞中的NF-B p65免疫荧光定位 2 用A 刺激小鼠小胶质细胞系BV2 cells 和C57BL6 小鼠颅内神经组 1-42 织或用LXA 预处理后再给予A 刺激然后取相应的标本分别检 4 1-4

4、2 测IL- 1和TNFa 蛋白及mRNA核因子NF-B p65 及其抑制蛋白IkBa 的表达并对细胞中的NF-B p65免疫荧光定位 3 制备对AD脑内老年斑具有特异靶向性结合能力的磁性材料对活体AD 模型鼠脑内的老年斑进行磁共振强化比照显像无创诊断AD并进行组 织学验证 结果 1 A 作用于BV2小胶质细胞后胞浆内IkBa 表达下降胞核内NF-B p65 1-42 表达明显增加IL- 1和TNFa 蛋白及mRNA表达增加给予PDTC后以 上改变均被抑制PDTC 的抑制效果呈剂量依赖性 2 A 作用于BV2小胶质细胞后胞浆内IkBa 表达下降胞核内NF-B p65 1-42 表达明显增加IL

5、- 1和TNFa 蛋白及mRNA表达增加给予LXA 后以 4 上改变均被抑制LXA 的抑制效果呈剂量依赖性 4 3 在活体内靶向磁性纳米材料能够透过血脑屏障与AD模型鼠脑内的老年 斑特异性结合进而老年斑进行磁共振强化比照显像与组织学标记方 法互相进行验证结果比较理想的 结 论 1 A可通过激活小鼠皮层和海马组织及BV2小胶质细胞NF-B信号通路促 进IL- 1和TNFa mRNA转录增加IL- 1和TNFa 的表达 2 LXA 拮抗A的致炎作用是通过抑制IkBa 的降解减少NF-B核内移抑 4 制IL- 1和TNFa mRNA合成减少IL- 1和TNFa表达并且抑制作用呈剂 量依赖性 3 利用

6、纳米技术制造的磁性材料能够与AD 鼠脑内的老年斑病灶特异性靶 3 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 向结合并在磁共振成像下显像是一种非常有应用前景的诊断新技术 创新点 1 通过体外和在体研究从细胞和组织层面完整揭了示A对神经组织和细 胞的致炎作用和机制 2 首次从细胞和组织两个层面揭示了脂氧素对A所致的炎症的拮抗作用 探讨了其中的抗炎机制和信号通路显示出脂氧素用于治疗AD具有广阔 前景 3 自主研发了新的与AD 鼠脑内老年斑病灶靶向结合在高场强磁共振成 像的纳米造影剂为将来临床诊断AD打下了坚实的根底意义重大影 响深远 关键词阿尔茨海默病-淀粉样蛋白炎症白细胞介素- 1肿瘤坏死因

7、子a NF-B 脂氧素A 核磁共振MRI 超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO 4 4 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 The experimental study on the pathogenesis diagnosis and treatment of Alzheimers disease Department of Neurology Tongji Hospital Medical College HuaZhong University of Science and Technology PHD Candidate Wu Jun Supervisor Zhang Sumin

8、g ABSTRACT Background Alzheimer Disease AD is a progressive neurodegenerative disorder whose incidences increase with age The increasing number of aged people confronted with the medical challenges thrown up by this disease the heavy burden and the financial cost of the disease is unbearable for fam

9、ilies and for society The most frequent manifestations of the disease are memory disorders relating to recent facts There is then a slow evolution of the symptoms such as aphasia apraxia and agnosia The disease is also accompanied by the cognitive disorders Till now the pathogenesis of the disease i

10、s unclear and there are also no effective diagnosis or treatment methods So all the studies should serve the purpose of clarifying its pathogenesis improving methods for early diagnosis and measures and providing the best possible treatment for those suffering from AD Objective 1 To observe the effe

11、cts and explore the molecular mechanisms of the inflammation induced by -amyloid A in microglia MG and in mice 2 To observe the beneficial outcome of anti- inflammatory effects of LXA4 in the inflammation induced by A explore the underlying mechanisms of it and reveal potential therapeutic effect of

12、 LXA on AD 4 3 Detection of amyloid plaque in AD transgenic mice with specific nano magnetic biomarkers using magnetic resonance microimaging 5 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Methods 1 The tissue of cortex and hippocampus of mice and cultured BV2 cells were exposed to A with or without Pyrrolidinedithiocar

13、bamate ammonium 1-42 PDTC then Enzyme linked immunosorbent assay ELISA for interleukin- 1 IL- 1 and tumor necrosis factor a TNFa Quantitative real time polymerase chain reaction RT-PCR for IL- 1 and TNF-a mRNA western blot analyses of IBa and NF-B p65 Immunofluorescence analysis of nuclear transloca

14、tion of protein NF-B p65 2 The tissue of cortex and hippocampus of mice and cultured BV2 cells were exposed to A with or without LXA then Enzyme link ed immunosorbent 1-42 4 assay ELISA for interleukin- 1 IL- 1 and tumor necrosis factor a TNFa Quantitative real time polymerase chain reaction RT-PCR

15、for IL- 1 and TNFa mRNA western blot analyses of IBa and NF-B p65 Immunofluorescence analysis of nuclear translocation of protein NF-B p65 3 To synthesis a specifically targeted nano- iron contrast agent to label the amyloid plaques in the AD brain in vivo and then injecte it into the APPPS1 mice an

16、d detected using magnetic resonance microimaging MRI and the analysis the correlation between results and the histological stainings in the end Results 1 The protein and mRNA expressions of IL- 1 and TNFa the degradation of IBa and translocation of NF-B p65 subunit into the nucleus were all inhibite

17、d by PDTC and the inhibitory effects were dose dependently elevated 2 LXA4 down-regulated the protein expression of IL- 1 and TNFa attenuated the gene expressions of IL- 1 and TNFa inhibited the degradation of IBa inhibited translocation of NF-B p65 subunit into the nucleus in A-stimulated BV2 cells

18、 and the inhibitory effects were dose dependently elevated 3 Plaques could be detected in 6-month-old APPPS1 mice in vivo by MRI after 6 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 injection of the targeted nano- iron contrast agent Histological stainings and MRI images have been precisely and spatially registered over

19、 a circumscribed area of the cortex Conclusion 1 IL- 1 and TNFa were induced by A via the NF-B signal pathway in BV2 microglial cells 2 LXA4 inhibits the production of IL- 1 and TNFa stimulated by A via the NF-B signal pathway 3 This specifically targeted nano- iron contrast agent can label the amyl

20、oid plaques in the AD brain APPPS1 mice in vivo and can be detected by MRI Innovation points 1 This study reveals the proinflammatory role of -amyloid in microglial cells and in mie and also and reveal the mechanisms in vitro and in vivo 2 This study reveals unprecedented findings on this topic of t

21、he role of LXA in 4 suppressing the inflammation induced by A in vitro and in vivo and the underlying mechanisms were discussed This study also reveals potential therapeutic effect of LXA on AD Therefore the administration of LXA to 4 4 control the development of AD would be promising 3 To synthesis

22、 a specifically targeted nano- iron contrast agent to label the amyloid plaques in the brain of APPPS1 mice in vivo successfully and then enable the amyloid plaques be detected using MRI Key Word Alzheimers disease -amyloid inflammation NF-B interleukin- 1 tumor necrosis factora lipoxin A amyloid pl

23、aque magnetic resonance imaging 4 ultrasmall superparamagnetic iron oxide 7 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 英文缩略词表 英文缩写 英文全称 中文译名 AD Alzheimer disease 阿尔茨海默病 A Beta-Amyloid protein -淀粉样蛋白 APP Amyloid Precursor Protein 淀粉样蛋白前体物质 MG microglia 小胶质细胞 IL- 1 interleukin- 1 白介素- 1 TNFa tumor necrosis factor-a 肿瘤坏死

24、因子-a PDTC Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 NF-B Nuclear factor-B 核因子B LXA4 lipoxin A4 脂氧素A4 PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲盐水 SPIO Superparamagnetic iron oxide 超顺磁性氧化铁颗粒 USPIO Ultrasmall Superparamagnetic iron oxide 超小型超顺磁性氧化铁颗粒 MRI Magnetic Resonance image 核磁共振成像 FITC Fluorescein

25、 isothiocyanate 荧光素异硫氰酸酯 PET positron emission tomography 正电子断层扫描 1 独创性声明 本人郑重声明本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的总结尽我所知除文中已经标明引用的内容外本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出奉献的个人和集体均已在文 中以明确方式标明本人完全意识到本人将承当本声明引起的一切法律后果 学位论文作者签名 日期 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保存使用学位论文的规定即学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版

26、允许论文被查阅和借阅本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或局部内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密 在_年解密后适用本授权书 本论文属于 不保密 请在以上方框内打v 学位论文作者签名 指导教师签名 日期 年 月 日 日期 年 月 日 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 前 言 阿尔茨海默病Alzheimers disease AD 是一种中枢神经系统退行性疾病德 国医生Alios Alzheimer 在1906 年首次描述了其病理特征AD 起病隐匿进展缓慢 病程绵长典型的病理改变有神经元丧失淀粉样蛋白斑块和神经纤维缠结形成及

27、脑 血管淀粉样变性等临床上主要表现为记忆和认知功能障碍行为及人格异常改变 在美国AD 已成为仅次于心血管病癌症和脑卒中的第四大死亡杀手世界卫生组 织最新统计全世界每7 秒钟就会增加一个AD 患者目前发病人数高达2500 万 我国是人口大国 AD 患者约有700 余万绝对数量已居世界首位并且发病率还在 逐年攀升21 世纪人口老龄化问题突显特别是我国仅 65 岁以上老年人口就达 15 亿AD 已成为威胁老年人生活质量并导致死亡的最严重疾病之一并给患者家庭 及社会带来极大痛苦和沉重负担但时至今日其发病机制仍不明确诊断手段严重 滞后特效的治疗方法更是无从谈起因此明确其发病机理探索早期高效诊断方 法寻找

28、有明显疗效药物已成为当前和将来应对AD 的三个关键环节其紧迫性可以 说迫在眉睫其重要性不言而喻 AD 从发现至今已经有整整一个多世纪了其发病机制争议不断A毒性学说 胆碱能损伤学说Tau 蛋白异常修饰学说神经细胞凋亡学说免疫异常学说基因 突变学说钙代谢紊乱学说铝中毒学说自由基损伤学说以及兴奋性氨基酸学说等 等真是众说纷纭近年来越来越多来自人类和动物模型的证据显示炎症在AD 发 病过程中扮演着非常重要的作用大量尸检资料发现AD 病人脑内存在炎性病理改变 一些学者认为AD 的病理改变就是炎症累积损伤的结果并且在炎症的开展过程中 A 的神经毒作用和小胶质细胞 microgliaMG 扮演的角色举足轻重

29、小胶质细胞相 当于中枢神经系统的巨噬细胞大约占大脑细胞总数的12它以未活化的和活化两 种状态两存在A 作用并激活小胶质细胞活化的小胶质细胞及其产生的多种炎性 产物介导了对神经组织病理损伤的过程它活化时产生的白细胞介素- 1 IL- 1进 一步促进小胶质细胞或星形胶质细胞表达大量其它细胞因子诱导淀粉样前体蛋白 APP 补体氧自由基一氧化氮前列腺素等生成增加这些分子再通过作用 于胶质细胞或神经元产生更多的炎性分子这种交互作用造成炎性产物水平持续升 8 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 高对神经损伤变性生长与及各种死亡机制产生广泛的影响IL- 1 过度表达时 造成营养障碍型轴突无意义生

30、长导致淀粉样斑块形成同时IL- 1还诱发神经元表 达APP 乙酰胆碱酯酶及其他斑块相关蛋白加重AD 的病理改变恶化病情同样 小胶质细胞被A 激活后产生TNF TNF 与神经营养素竞争激活相似的信号转 导系统导致神经元的老化同时 TNF 增强强N- 甲基-D-天冬氨酸 NMDA 受体介 导的神经毒性对神经元细胞产生毒性作用随着越来越多炎症证据的出现炎症学 说越来越得到众多学者和专家的认可当然炎症学说还要经历大量实验的验证和时间 考验这也是本课题的初衷和出发点 伴随着AD 炎症学说逐渐处于重要位置对AD 的抗炎治疗的研究应运而生在 一些临床研究中发现单独给予AD 患者某种非甾体抗炎药 NSAIDs

31、 病症有所改善 这让AD 的抗炎治疗出现了一线曙光但另一些研究却发现病症没有改善实验结果 存争议和相互矛盾有待于进一步深入研究另外长期服用非甾体抗炎药存在一定 的副作用因此寻找疗效确切毒副作用小抑制A 所致炎性反响的药物对AD 的 治疗具有重要意义最近报道利用人工合成的稳定脂氧素化学结构类似物在治疗肠 道呼吸道炎性疾病皮肤炎症银屑病等的有关研究中表现出较好的抗炎效果 脂氧素是在炎症病理过程中产生的花生四烯酸代谢产物生成后在局部组织发挥作 用然后被单核细胞的脱氢酶作用而迅速失活不参与各种生理功能的维持不干扰机 体的正常活动而且还能抑制炎症的进一步恶化促进炎症及时消退但至今尚未见脂 氧素用于抑制A

32、 所致炎性反响及治疗AD 的报道因此本课题将其作为研究的重要 内容以期有所发现和突破 目前AD 的诊断手段严重滞后多年来临床确诊只有依靠脑组织活检或者尸检 大大限制了对于这种疾病的防治临床上急需寻找一种能早期无创诊断AD 的新方法 纳米技术和分子影像学的开展让我们看到了希望特别是二者交叉结合形成了纳米分 子影像学其核心内容就是增强探针特异性识别靶目标的能力进而提高显像的效果 这是当今研究的热点之一目前已将磁性纳米材料成熟应用于临床磁共振成像 MRI 诊断之中常使用的磁共振增强比照剂有二乙二胺五醋酸钆 Gd-DTPA 和超顺磁性氧 化铁SPION Gd-DTPA 是磁共振血管成像的主要增强比照剂

33、但存在体内消除速 9 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 度过快分布没有组织特异性要求磁共振快速完成扫描等缺点超顺磁性氧化铁颗 粒 Superparamagnetic iron oxide SPIO 超顺磁性优良体内组织特异性高平安性好 具有Gd-DTPA 无法比较的优势本研究通过对自主研制合成的磁性纳米材料超小型 超顺磁性氧化铁颗粒 Ultrasmall Superparamagnetic iron oxide USPIO 进行外表修饰和 优化使其具有与AD 脑内老年斑的特异性结合的靶向性改变老年斑局部的磁共振 信号在磁共振下特异成像 本课题第一局部从细胞和动物两个水平进行研究观

34、察A 体外和体内致炎效果 并对其机制进行探讨以期揭示AD 的炎性反响机制为AD 的治疗奠定根底和提供 依据第二局部从细胞和动物两个水平观察脂氧素A lipoxin A LXA 对-淀粉样 4 4 4 蛋白所致炎性反响的抑制效果并通过对细胞内信号通路的研究对其抗炎机制进行 探讨以及展望将用于其治疗阿尔茨海默病的前景第三局部利用自主研发的对 AD 脑内老年斑具有特异靶向性结合能力的磁性材料对活体AD 模型鼠脑内的老年斑进 行磁共振强化比照显像无创诊断AD为将来临床诊断AD 打下了坚实的根底意 义重大影响深远 10 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 第一局部 -淀粉样蛋白对神经组织和B

35、V2 小胶质细胞致炎机 制的研究 中文摘要 目的 探讨 -淀粉样蛋白 -amyloidA 刺激神经组织和 BV2 小胶质细胞产生炎性 反响的效果和机制 方法 1体外培养小鼠小胶质细胞系BV2 cells 用A 孵育或用吡咯烷二硫代 1-42 氨基甲酸盐 PDTC 预孵育30 分钟再参加A 孵育2 C57BL6 小鼠侧脑 1-42 室注射A 或提前侧脑室注射PDTC 30 分钟后再侧脑室注射A 对 1-42 1-42 皮层和海马组织及 BV2 小胶质细胞酶联免疫吸附法 ELISA 检测 IL- 1 和 TNFa 表达实时荧光定量反转录聚合酶链反响法 RTPCR 检测 IL- 1 和 TNFamR

36、NA 表达免疫印迹法Western blot 检测核因子NF-B p65 细胞 胞核中及其抑制蛋白IkBa 在胞浆中的表达并对细胞中的NF-B p65 免疫荧 光定位 结果 A 刺激后ELISA 检测显示IL- 1和TNFa 表达增加RT-PCR 检测显示IL- 1 1-42 和TNFa mRNA 表达增加western blot 显示胞浆内IkBa 表达下降胞核内 NF-B p65 表达增加给予NF-B 信号通路特异阻断剂PDTC 预处理的细胞A 刺激所导致的胞浆IkBa 下降胞核内NF-B p65 增加IL- 1和TNFa 及其 mRNA 表达增加均被抑制且抑制效果呈剂量依赖性 结论 A

37、可通过激活小鼠皮层和海马组织及 BV2 小胶质细胞NF-B 信号通路促进 IL- 1和TNFa mRNA 转录增加IL- 1和TNFa 的表达 关键词 炎症-淀粉样蛋白白细胞介素1肿瘤坏死因子a 核转录因子NF-B 11 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Part Study on the molecular mechanisms of the inflammation induced by -amyloid in vitro and in vivo Abstract Objective The study is to explore the molecular mechanis

38、ms of the inflammation induced by -amyloid A in the tissue of cortex and hippocampus of mice and BV2 cells a mouse microglial cell line Methods The tissue of cortex and hippocampus of mice and cultured BV2 cells were exposed to A with or without Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium 1-42 PDTC then Enz

39、yme linked immunosorbent assay ELISA for interleukin- 1 IL- 1 and tumor necrosis factor a TNFa Quantitative real time polymerase chain reaction RT-PCR for IL- 1 and TNF-a mRNA western blot analyses of IBa and NF-B p65 Immunofluorescence analysis of nuclear translocation of protein NF-B p65 Results P

40、DTC inhibited the protein expression of IL- 1 TNFa IL- 1 and TNFa mRNA inhibited the decreasion of IBa in the cytoplasm and also inhibited elevation of NF-B p65 in the nucleus in A-stimulated BV2 cells and the inhibitory effects were dose dependently elevated Conclusion Our findings suggest that the

41、 IL- 1 TNFa protein and mRNA were induced by A via the NF-B signal pathway in the tissue of cortex and hippocampus of mice and BV2 microglial cells Key Words inflammation -amyloid PDTC proinflammatory cytokines NF-B 12 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 阿尔茨海默病Alzheimers diseaseAD 是一种中枢神经系统退行性疾病主要 表现为记忆和认知功能障碍行

42、为及人格异常改变随着人口老龄化进程的加快AD 将成为威胁老年人的生活质量并导致死亡的最严重疾病之一虽然已经发现了AD 特 征性病理改变如神经元丧失淀粉样蛋白斑块和神经纤维缠结形成及脑血管淀粉样 变性等但病因和发病机制仍不清楚近百年来人们对其不断进行研究探索可至今 仍处于为难境地正是由于对其病因和发病机理认识的局限性导致临床没有特效的 治疗手段所以对 AD 病因和发病机制的深入研究势在必行近年来的研究发现在 1-2 AD 发病的病理过程中炎症 inflammation 起着非常重要的作用 并且在炎性反响 中A的作用举足轻重A激活小胶质细胞产生诸如IL- 1 和TNFa 等炎性因子这 3-5 些炎

43、症因子对包括神经元在内的各种神经细胞造成伤害甚至引起其凋亡 而且这 些炎症因子可以引起胶质细胞的进一步激活产生更多的炎症因子形成恶性循环 本研究探讨了A对小鼠皮层和海马组织及BV2 小胶质细胞的致炎作用及作用的细胞 内信号转导机制 实验材料和方法 1 实验材料 11 细胞和实验鼠 小鼠小胶质细胞系BV2 cells 购自中国医学科学院根底医学研究所细胞中心 C57BL6 小鼠体重20-25g由华中科技大学附属同济医院实验动物中心提供 12 细胞培养试剂 DMEMF12 培养基Hyclone 公司 胎牛血清Gibco 公司 025胰蛋白酶Hyclone 公司 DMSO Sigma 公司 13 试

44、剂 NF-B p65 抗体Cell Signaling 公司 13 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 IBa 抗体Abcam 公司 goat anti-rabbit IgG-PE Santa Cruz 公司 goat anti rabbit IgG HL HRP Thermo Fisher Scientific 公司 A Anaspec 公司 1-42 Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium PDTC Sigma 公司 14 Real-time PCR 所需试剂 TRIZOL invitrogen 公司 ReverTra Ace qPCR RT K

45、it TOYOBO 公司 SYBR Green realtime PCR master mix-plus TOYOBO 公司 15 实验仪器 37细胞培养箱Thermo 公司 倒置荧光显微镜Olympus 公司 超净细胞工作台 苏州安泰空气技术 台式离心机 德国Sigma 公司 超纯水机Millipore 公司 移液枪Eppendorf 公司 50ml 细胞培养瓶IWAKI 公司 75ml 细胞培养瓶CORNING 公司 100mm 细胞培养皿IWAKI 公司 15ml 细胞离心管IWAKI 公司 15ml 细胞冻存管CORNING 公司 恒温水浴箱北京医疗设备厂 恒温摇床山海智城分析仪器制造

46、 超低温冰箱日本SANYO 公司 脑立体定位仪Tujunga 公司 16 试剂处理 丙泊酚 PROPOFOL 溶液的配制原浓度10mgml实验时用生理盐水稀释五倍 14 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 将A 其溶于双蒸水使其终浓度为01mM 37孵化5 天分装备用 1-42 17 其它 注射器眼科镊手术剪刀脱脂棉骨蜡电子天平电子秤体温恒温板10l 平头微量加样器上海济成分析仪器 2 实验内容和分组 实验分为细胞和在体两局部 21 细胞实验 com 药物及试剂处理 A 的配制实验时在细胞培养液中将A 稀释至5 M 1-42 1-42 PDTC 的配制实验时在细胞培养液中稀释至25

47、 M5 M10 M 和20 M com 细胞培养 小鼠BV-2 小胶质细胞系购自中国医学科学院根底医学研究所细胞中心参加含 10胎牛血清 FBS GibcoBRL Life Technologies CA 100 Uml 青霉素和100Uml 链霉素的DMEMF12 培养液中放入375 CO2 饱和湿度孵育箱内培养将BV2 4 细胞经025 胰酶消化后用DMEMF12 含10FBS 将其调整为510 L 的细 胞悬液细胞生长至80 融合去除培养液参加无血清DMEMF12 培养48 小时 使细胞生长处于静息状态然后分组进行相应预处理 com 细胞分组 实验分为两个内容 com1培养细胞分成4 组

48、每组重复6 次 1 对照组仅用培养液 2 PDTC 组 在培养液中参加PDTC 5M 3 A组 在培养液中参加A 5M 1-42 4 PDTC 加A组 PDTC 5M 预处理30min 后给予A 5M 孵育 1-42 com2培养细胞分成5 组每组重复6 次分别用PDTC 预处理30min 后再参加 给予A 5M 孵育 1-42 1 PDTC 0M 组 15 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 PDTC 25M 组 3 PDTC 5M 组 4 PDTC 10M 组 5 PDTC 20M 组 22 动物实验 com 药物及试剂处理 A 的配制实验时取50g 溶于5- 10l 生理

49、盐水后注入侧脑室 1-42 PDTC 的配制实验时分别取5g50g 溶于5- 10l 生理盐水后注入侧脑室 com 动物分组 1 对照组 10l 生理盐水注入侧脑室 2 PDTC 组 PDTC5g 加10l 生理盐水注入侧脑室 3 A 组 50g 加10l 生理盐水注入侧脑室 1-42 4 PDTC 干预组 分2 组 分别用不同剂量PDTC 5g50g 加5l 生理盐水注入侧 脑室30 分后A 50g 加5l 生理盐水注入侧脑室 1-42 com 立体定位固定操作过程及步骤 1 选取健康小鼠电子秤测量体重25g-30g 之间为准 2 以丙泊酚溶液按10g- 15gKg 体重的剂量尾静脉缓慢注射

50、丙泊酚30gg 麻醉 3 以脱脂棉球浸于生理盐水中备用 4 约 10 分钟后小鼠充分麻醉观察其瞳孔颜色呈浅红色为宜颅顶部备皮暴露 皮肤 5 沿正中矢状线剪开皮肤暴露皮下组织和筋膜并小心别离直至达骨膜暴露清晰的 矢状缝人字缝冠状缝 6 10 分钟后待手术视野枯燥以黑色墨水笔轻点前囟矢状缝与冠状缝交汇点及 后囟矢状缝与人字缝交汇点静置枯燥 7 上耳夹于小鼠外耳道外下方凹陷处两侧对称地夹紧固定 8 用小鼠脑立体定位仪固定正中矢状线平行于定位仪长轴两侧对称不活动用 体温恒温板控制体温在37左右 16 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 9 调整头部使前囟略高于后囟约01cm 10 以前囟为

51、基准点读取游标卡尺在下述部位分别颅骨钻孔在前囟点右侧移 10mm后移05mm颅骨腹背侧15mm向下3mm 左右即进入右侧侧脑室 11 连续注射7 天第8 天处死动物取大脑皮层和海马组织进行检测 3 检测方法 31 酶联免疫吸附法 Enzyme linked immunosorbent assay ELISA 测定 IL-1 和 TNFa 细胞A 5 M 孵育体外培养的BV2 细胞 12 小时或用PDTC 预孵育30 1-42 分钟再参加A 孵育12 小时后收集培养上清液 1-42 动物C57BL6 小鼠侧脑室注射A 或提前侧脑室注射PDTC 30 分钟后再 1-42 侧脑室注射A 连续注射7

52、天第8 天取小鼠皮层和海马组织剪碎匀浆离心 1-42 取上清液 ELISA按照试剂盒说明书的要求检测IL- 1和TNFa 酶标仪450 nm 测A 值绘 制标准曲线根据标准曲线计算IL- 1和TNFa 32 实时荧光定量PCR Quantitative real time polymerase chain reaction RT-PCR 检测IL-1和TNFa mRNA 细胞A 5 M 孵育体外培养的BV2 细胞 6 小时或用PDTC 预孵育30 分 1-42 钟再参加A 孵育6 小时后收集细胞 1-42 动物C57BL6 小鼠侧脑室注射A 或提前侧脑室注射PDTC 30 分钟后再 1-42

53、侧脑室注射A 连续注射7 天第8 天取小鼠皮层和海马组织 1-42 RT-PCR按说明书提取 BV2 细胞的总 RNA然后进行逆转录反响反响体积 25l 其中 1l 总RNA1l M-MLV 4 l M-MLV RT 5 buffer20 U of Rnasin1 l Random primer 10 pmoll 1 l of dNTP mix 10 mM and DEPC 水将其混合37孵 育50 分70孵育15 分获得的cDNA -20 保存RT-PCR 操作按LightCycler DNA 的SYBR Green I 的使用说明经过1 分钟95的初始变性后变性9515 秒复性 5815

54、秒延伸7245 秒共40 个循环引物序列如下 -actin 正义链 5 -CCGTGAAAAGATGACCCAG-3 17 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 -actin 反义链 5 -TAGCCACGCTCGGTCAGG-3 IL- 1 正义链 5 -TTTGAAGTTGACGGACCCC-3 IL- 1 反义链 5 -GTGCTGCTGCGAGATTTGA-3 TNFa 正义链 5 -CGGGCAGGTCTACTTTGGAG-3 TNFa 反义链 5 -CAGGTCACTGTCCCAGCATC-3 PCR 数据分析采用Ct 法 33 免疫印迹法 Westem blot 检测N

55、F-B p65 和IkBa 细胞A 5M 孵育体外培养的BV2 细胞4 小时或用PDTC 预孵育30 分 1-42 钟再参加A 孵育4 小时后收集细胞 1-42 动物C57BL6 小鼠侧脑室注射A 或提前侧脑室注射PDTC 30 分钟后再 1-42 侧脑室注射A 连续注射7 天第8 天取小鼠皮层和海马组织 1-42 Westem blot 裂解液提取胞浆蛋白和核蛋白BCA 法测定蛋白质浓度 蛋白上样 量40 g在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳 再转到NC 膜上室温下20脱脂牛奶封闭1 小时然后使用兔抗鼠多克隆抗体IBa 或NF-B p65 或-actin 及LamineB1 4 孵育过 夜后辣根

56、过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体室温孵育15 小时参加ECL 溶液1 分 钟X 光片曝光 34 免疫荧光 Immunofluorescence 定位p65 A 5M 孵育体外培养的BV2 细胞4 小时后用90酒精滴加冰醋酸4 1-42 固定15minPBS 洗3 分钟3 次3双氧水封闭分钟PBS 洗3 分钟3 次参加NF-B p65 抗体11000 4 度过夜室温复温20 分钟PBS 洗5 分钟3 次参加goat anti-rabbit IgG-PE 1200 37孵育60min PBS 洗5 分钟3 次DAPI 染核3 分钟水洗 荧光封片剂封片拍照 4 统计学方法 x 应用SPSS110

57、统计分析软件进行统计学处理实验结果以 s 表示每个实验 至少重复3 次组间比较采用单因素方差分析P 005 有统计学意义 18 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 实验结果 1 酶联免疫吸附法 ELISA 测定IL-1和TNFa 11 BV2 细胞 A 处理BV2 细胞12小时后IL- 1和TNFa 蛋白表达水平明显上调给予PDTC 1-42 预处理细胞30 分钟后再加A 处理BV2 细胞那么发现PDTC 抑制A所引起的 1-42 IL- 1和TNFa 蛋白上调 图1 A B 其抑制作用呈剂量依赖性剂量越大作用越强 图1 C D P 005 P 001 图1 ELISA 显示A 明

58、显上调IL- 1和TNFa 蛋白表达水平PDTC 抑制A所引起 的IL- 1和TNFa 蛋白表达的上调 图1 A B 其抑制作用呈剂量依赖性剂量越大 作用越强 图1 C D 19 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Fig 1 ELISA assay for IL- 1 and TNFa protein after BV2 cells were treated with or without A in the absence or presence of PDTC for 12 h A markedly enhanced the gene expression of IL- 1 a

59、nd TNFa PDTC alone did not affect gene expression PDTC significantly inhibited the protein expressions of IL- 1and TNFa induced by A Fig 1 A B and the effects were dose dependent as the dose increased the effects enhanced Fig 1 C D Data are presented as meansSD P 005 P 001 compared with A group 12 动

60、物 连续给予侧脑室注射A 7 天然后取小鼠皮层和海马组织检测IL- 1和TNFa 1-42 蛋白表达水平明显上调提前侧脑室注射PDTC 30 分钟后再注射A 连续7 天 1-42 那么发现 PDTC 抑制 A 所引起的 IL- 1 和 TNFa 蛋白上调 图 2 A B P 005 P 001 图2 ELISA 显示A 明显上调IL- 1和TNFa 蛋白表达水平PDTC 抑制A所引起 的IL- 1和TNFa 蛋白表达的上调 图2 A B Fig 2 ELISA assay for IL- 1and TNFa protein after the tissue of cortex and hipp