博士研究生课程-后基因组学的主要研究技术

1、后基因组学主要研究技术后基因组学主要研究技术 后基因组主要研究技术包括：后基因组主要研究技术包括： 生物信息学技术；生物信息学技术； 生物芯片技术；生物芯片技术； 转基因和基因敲除技术；转基因和基因敲除技术； RNA RNA 干扰技术；干扰技术； 抑制性消减杂交、基因表达谱分析、抑制性消减杂交、基因表达谱分析、RNARNA测序测序（转录组学）；（转录组学）； 2-D2-D电泳、生物质谱技术、核磁共振、电泳、生物质谱技术、核磁共振、 PCAPCA技术技术（蛋白质组学、糖组学、代谢组学）；（蛋白质组学、糖组学、代谢组学）； 免疫共沉淀、酵母双杂交、噬菌体展示、免疫共沉淀、酵母双杂交、噬菌体展示、

2、SPRSPR等等技术（相互作用组学）。技术（相互作用组学）。一、一、生物芯片的概念生物芯片的概念 生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）是指采用光导原位合成或）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将微量点样等方法，将大量生物大分子大量生物大分子比如核酸片比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维组成密集二维分子排列分子排列，然后与已标记的待测生物样品中，然后与已标记的待测生物

3、样品中靶分靶分子杂交子杂交，通过特定的仪器通过特定的仪器（如激光共聚焦扫描或（如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（电荷偶联摄影像机（CCDCCD）对杂交信号的强度进）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地行快速、并行、高效地检测分析检测分析，从而判断样品，从而判断样品中中靶分子的数量靶分子的数量。由于常用玻片。由于常用玻片/ /硅片作为固相硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术术，所以称之为生物芯片技术 。生物芯片生物芯片计算机芯片计算机芯片二、生物芯片技术产生背景二、生物芯片技术产生背景 2020世纪世纪90

4、90年代初开始实施的年代初开始实施的人类基因组计划人类基因组计划（HGPHGP）取得）取得了人们当初意料不到的巨大进展。目前已经测定了了人们当初意料不到的巨大进展。目前已经测定了1010多多种微生物以及高等动植物的全基因组序列，海量的基因种微生物以及高等动植物的全基因组序列，海量的基因序列数据正在以前所未有的速度膨胀。序列数据正在以前所未有的速度膨胀。 一个现实的科学问题摆到了人们面前：一个现实的科学问题摆到了人们面前： 如何研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能？如何研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能？ 如何有效利用如此海量的基因信息揭示人类生老病死的如何有效利用如此海量的基因信息揭

5、示人类生老病死的一般规律，并为人类最终战胜各种病魔提供有效武器？一般规律，并为人类最终战胜各种病魔提供有效武器？ 于是，一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术于是，一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术生物芯片技术生物芯片技术，随着人类基因组研究的进展应运而生了。，随着人类基因组研究的进展应运而生了。三、生物芯片分类三、生物芯片分类生物芯片生物芯片DNA芯片蛋白质蛋白质芯芯片片芯片芯片实实验验室室 基因芯片（基因芯片（Genechip)Genechip)。基因芯片是。基因芯片是最重要最重要的一种的一种生物芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上，生物芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上，然

6、后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸核酸分分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量的基因，使人们准确高效地破译遗传密码。量的基因，使人们准确高效地破译遗传密码。 蛋白芯片（蛋白芯

7、片（ProteinchipProteinchip）。蛋白质芯片是）。蛋白质芯片是可以在一个非常小的几何尺度的表面积上，可以在一个非常小的几何尺度的表面积上，集成多种集成多种蛋白质活性分子蛋白质活性分子（配基）。仅用（配基）。仅用微量的生物（生理）的采样即可以同时检微量的生物（生理）的采样即可以同时检测和研究测和研究不同的分子、生物分子之间的相不同的分子、生物分子之间的相互作用以及基因功能互作用以及基因功能的表达，获得各种条的表达，获得各种条件下件下蛋白质组蛋白质组的条件变化，从而可以获得的条件变化，从而可以获得生命活动的规律。生命活动的规律。 芯片实验室（芯片实验室（Lab-on-a-chip

8、Lab-on-a-chip）。芯片实验）。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应以及检测分析的整个样品制备、生化反应以及检测分析的整个过程过程集约化形成微型分析系统集约化形成微型分析系统。现在已有。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。例如可以将样品制备和生物芯片。例如可

9、以将样品制备和PCRPCR扩增扩增反应同时在一块小小的芯片上完成。反应同时在一块小小的芯片上完成。 四、基因芯片制作与应用四、基因芯片制作与应用美国美国AFFYMETRIXAFFYMETRIX公司的一些产品公司的一些产品19891989年的第一张芯片，年的第一张芯片，构建在显微镜镜片上构建在显微镜镜片上20022002年的全人类基因组芯片，年的全人类基因组芯片，包含包含3300033000多个基因位点多个基因位点一）基因芯片发展历史一）基因芯片发展历史试样处理点阵固定反应或杂交反应或杂交芯片制作芯片制作标记标记洗涤洗涤检测扫描光刻合成光刻合成微量点样微量点样喷墨喷墨纯化、标记纯化、标记光化学检

10、测光化学检测电化学检测电化学检测计算处理计算处理二）基因芯片的特点 高度集约高度集约 大通量平行分析大通量平行分析 高灵敏度高灵敏度 样品需要量小样品需要量小 技术操作简单技术操作简单 自动化程度高自动化程度高 应用范围广应用范围广 成本相对较低成本相对较低 微板型微板型集成电路型集成电路型玻片玻片型型三）基因芯片的制备三）基因芯片的制备固相介质：有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、固相介质：有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、 塑料等。塑料等。靶片段：靶片段：DNADNA、寡核苷酸、寡核苷酸、RNARNA等。等。探探 针：针：mRNAmRNA， 或是以或是以mRNAmRNA为模板合成的为模板合成的c

11、DNAcDNA。标记物：常采用荧光剂，如标记物：常采用荧光剂，如Cy3Cy3、Cy5Cy5，同位素、，同位素、 地高辛等。地高辛等。示例：原位喷印合成基因芯片示例：原位喷印合成基因芯片 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。片上特定位置。 接触式和非接触式直接点样

12、芯片接触式和非接触式直接点样芯片直接打印时针头与芯片接触直接打印时针头与芯片接触喷印时针头与芯片保持一定距离喷印时针头与芯片保持一定距离 四）基因芯片的主要应用四）基因芯片的主要应用v单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPSNP）的鉴定）的鉴定v基因表达分析基因表达分析v寻找新基因寻找新基因v大规模大规模 DNA DNA 测序测序v疾病的诊断与治疗疾病的诊断与治疗v个体化医疗个体化医疗 v药物筛选及毒理学研究药物筛选及毒理学研究1、单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPSNP）的鉴定）的鉴定 CheeChee等（等（ScienceScience，19961996，274274：61061061

13、3613）应用）应用包含包含135000135000种探针（种探针（25 mer25 mer）的基因芯片，检测）的基因芯片，检测了了16.6kb16.6kb的人类线粒体基因组中的的人类线粒体基因组中的SNPSNP位点，从位点，从1010个样品中，检测出多达个样品中，检测出多达505505个个SNPSNP标志位点。标志位点。Science 25 October 1996: Vol. 274. no. 5287, pp. 610 - 614Title：Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays Authors: Mark C

14、hee, Robert Yang, Earl Hubbell, Anthony Berno, Xiaohua C. Huang, David Stern, Jim Winkler, David J. Lockhart, Macdonald S. Morris, Stephen P. A. Fodor Abstract: Rapid access to genetic information is central to the revolution taking place in molecular genetics. The simultaneous analysis of the entir

15、e human mitochondrial genome is described here. DNA arrays containing up to 135,000 probes complementary to the 16.6-kilobase human mitochondrial genome were generated by light-directed chemical synthesis. A two-color labeling scheme was developed that allows simultaneous comparison of a polymorphic

16、 target to a reference DNA or RNA. Complete hybridization patterns were revealed in a matter of minutes. Sequence polymorphisms were detected with single-base resolution and unprecedented efficiency. The methods described are generic and can be used to address a variety of questions in molecular gen

17、etics including gene expression, genetic linkage, and genetic variability. 2、基因表达分析基因表达分析 用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。检测出成千上万个基因的表达情况。 将成千上万个我们克隆到的将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定特异性靶基因固定在在一块芯上，对来源于不同个体、不同组织、不同一块芯上，对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包

18、括不同诱导不同治疗手段）病变、不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的下细胞内的mRNAmRNA或逆转录所得的或逆转录所得的cDNAcDNA进行检测，进行检测，从而对这些基因表达的从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性发育阶段特异性、分化阶段特异性进行综合评定进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。与判断，极大加快这些基因功能的确立。 SchenaSchena等采用拟南芥基因组内共等采用拟南芥基因组内共4545个基因个基因的的cDNAcDNA微阵列（其中微阵列（其中1414个为完全序列，个为完全序列，3131个为个为ES

19、TEST），检测该植物的根、叶组织内这），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和根和叶组织中存在叶组织中存在2626个基因的表达差异个基因的表达差异，而参，而参与叶绿素合成的与叶绿素合成的CAB1CAB1基因在叶组织较根组基因在叶组织较根组织表达高织表达高500500倍。倍。3、寻找新的基因示例：肿瘤相关新基因的发现4、大规模DNA测序 基因芯片利用固定探针与样品进行分子基因芯片利用固定探针与样品

20、进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。诱人的前景。 Mark cheeMark chee等用含等用含135000135000个寡核苷酸探针个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为的阵列测定了全长为16.6kb16.6kb的人线粒体的人线粒体基因组序列，准确率达基因组序列，准确率达99%99%。5 5、疾病的诊断与治疗、疾病的诊断与治疗 从正常人的基因组中分离出从正常人的基因组中分离出DNADNA与与DNADNA芯片杂交就可以得出芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出标准图谱

21、。从病人的基因组中分离出DNADNA与与DNADNA芯片杂交就芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的得出病变的DNADNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。现代化诊断新技术。 例如例如AffymetrixAffymetrix公司，把公司，把p53p53基因全长序列和已知突变的基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成探针集成在芯片上，制成p53p53基因芯

22、片，将在癌症早期诊基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌断中发挥作用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。具有商业化价值的应用。 目前主要涉及的疾病目前主要涉及的疾病癌症、癌症、心血管疾病、心血管疾病、血液病、血液病、遗传性疾病、遗传性疾病、神经系统疾病、神经系统疾病、部分感染性疾病、部分感染性疾病、免疫反应相关性疾病免疫反应相关性疾病毒物

23、引起的损伤等。毒物引起的损伤等。6、个体化治疗 临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异（单大。这主要是由于病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性），导致对药物产生不同的反应。核苷酸多态性），导致对药物产生不同的反应。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。开处方，就可对病人实施个体优

24、化治疗。 在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。的，用药也应因人而异。 例如乙肝有较多亚型，例如乙肝有较多亚型，HBVHBV基因的多个位点如基因的多个位点如S S、P P及及C C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。如将这些基用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。如将这些基因突变部位的全部序列构建为因突变部位的全部序列构建为DNADNA芯片，则可快芯片，则可快速地检测病人是这一个

25、或那一个或多个基因发生速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。有很大的意义。 7 7、药物筛选及毒理学研究、药物筛选及毒理学研究 在基因功能研究基础上，特别是确立了与在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变正常组只在某些药物

26、刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（量筛选（high throughout screeninghigh throughout screening），可），可使新药开发获得技术上的突破。使新药开发获得技术上的突破。七）基因芯片的发展方向七）基因芯片的发展方向 减小实验误差，提高精确度，降低成本减小实验误差，提高精确度，降低成本 基因芯片技术的工业化基因芯片技术的工业化 基因芯片的数据处理基因芯片的数据处理 基因芯片和组织芯片、细胞芯片等其他类基因芯片和组织芯片、细胞芯片等其他类型芯片的有机结合型芯片的有机结合八）应用前景及

27、市场展望 前景：前景：生物芯片的成熟和应用一方面将为本生物芯片的成熟和应用一方面将为本世纪的世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测境监测等领域带来一场革命；另一方面生物等领域带来一场革命；另一方面生物芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段，故必将成为未来生物信息学研究中术手段，故必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台。的一个重要信息采集和处理平台

28、。市场展望市场展望 关于生物芯片的市场状况，到关于生物芯片的市场状况，到20012001年，全世界生物芯片年，全世界生物芯片的市场已达的市场已达170170亿美元，用生物芯片进行药理遗传学和药亿美元，用生物芯片进行药理遗传学和药理基因组学研究所涉及的世界药物市场每年约理基因组学研究所涉及的世界药物市场每年约18001800亿美亿美元。在最近的元。在最近的5 5年之内，应用生物芯片的市场销售将达到年之内，应用生物芯片的市场销售将达到200200亿美元左右。亿美元左右。 根据专家统计：全球目前生物芯片工业产值最近根据专家统计：全球目前生物芯片工业产值最近5 5年的市年的市场销售可达到场销售可达到2

29、00200亿美元以上。到亿美元以上。到 20102010年，仅美国用于年，仅美国用于基因组研究的芯片销售额将达基因组研究的芯片销售额将达400400亿美元。这还不包括用亿美元。这还不包括用于疾病预防及诊治及其它领域中的基因芯片，这部分预于疾病预防及诊治及其它领域中的基因芯片，这部分预计比基因组研究用量还要大上百倍。因此，基因芯片及计比基因组研究用量还要大上百倍。因此，基因芯片及相关产品产业将取代微电子芯片产业，成为本世纪最大相关产品产业将取代微电子芯片产业，成为本世纪最大的产业。的产业。 一、转基因技术(Transgenic technology)19821982年，英国的年，英国的自然自然杂

30、志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中, ,培育出具快速生培育出具快速生长效应的长效应的“转基因超级鼠转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2 23 3倍，体积大一倍。倍，体积大一倍。 转基因技术是指将人工分离和修饰过的基转基因技术是指将人工分离和修饰过的基因或因或DNADNA导入到生物体的细胞基因组中，引导入到生物体的细胞基因组中，引起生物体性状稳定地整合、表达和遗传的起生物体性状稳定地整合

31、、表达和遗传的技术技术. . 依据转移的对象不同可分为动物转基因技依据转移的对象不同可分为动物转基因技术和植物转基因技术。术和植物转基因技术。一）定义一）定义二）动物转基因技术二）动物转基因技术 原核显微注射法原核显微注射法 逆转录病毒载体法逆转录病毒载体法 胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法 精子介导法精子介导法1 1、原核显微注射法原核显微注射法 原核显微注射法又称原核显微注射法又称DNADNA显微注射法，即通过显显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵受精卵，利用外源基因整合到利用外源基因整合到DNADNA中，发育成转基因动物。中，发育

32、成转基因动物。 优点：外源基因的导入整合效率较高，不需要载优点：外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达100kb100kb。它可以直接获得纯系，所以实验周期短。它可以直接获得纯系，所以实验周期短. . 缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。性状改变，重则致死。牙本质涎蛋白转基因小鼠的

33、构建牙本质涎蛋白转基因小鼠的构建( (孙汗堂等，孙汗堂等，20062006）目的目的: :构建小鼠牙本质涎蛋白构建小鼠牙本质涎蛋白(DSP)(DSP)转基因小鼠。转基因小鼠。方法方法: :将将pcDNA3.1pcDNA3.1载体中的载体中的CMVCMV启动子替换为启动子启动子替换为启动子c-actin,c-actin,构建载体构建载体pcDNA3.1-CX,pcDNA3.1-CX,然后将然后将PCRPCR获得的获得的DSPDSP基因编码序列克隆基因编码序列克隆到到pcDNA3.1-CXpcDNA3.1-CX中中, ,构建构建DSPDSP转基因载体转基因载体pcDNA3.1-CX-dsp;pcD

34、NA3.1-CX-dsp;将线性将线性化的载体化的载体DNADNA注射注射到小鼠受精卵的雄到小鼠受精卵的雄原核原核, ,受精卵移植到假孕母受精卵移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后鼠的输卵管。仔鼠出生后, ,用用PCRPCR及及Southern blotSouthern blot检测阳性小鼠。检测阳性小鼠。结果共移植结果共移植717717枚枚注射注射过的受精卵至过的受精卵至2929只受体鼠只受体鼠, ,移卵后产仔移卵后产仔6767只只, ,阳性阳性4 4只。阳性鼠分别传代只。阳性鼠分别传代, ,开始建系。结论通过开始建系。结论通过显微注射显微注射的的方法成功获得了方法成功获得了DSPDSP转基因

35、小鼠。转基因小鼠。 2、逆转录病毒载体法、逆转录病毒载体法 逆转录病毒载体法将目的基因重组到逆转录病毒载体法将目的基因重组到逆转录逆转录病毒病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组基因组DNADNA中去。中去。 优点：无需要重排，可在整合点整合转移基因的优点：无需要重排，可在整合点整合转移基因

36、的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的里，整合有逆转录病毒的DNA DNA 的胚胎率的胚胎率高高。 缺点：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入缺点：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有一定的大小限度；转基因的逆转录病毒的基因有一定的大小限度；转基因的表达问题尚未解决。表达问题尚未解决。逆转录病毒介导法制备转基因鸡的基本过程逆转录病毒介导法制备转基因鸡的基本过程 Nature Biotechnology 20, 396 - 3

37、99 (2002) Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens Alex J. Harvey, Gordon Speksnijder, Larry R. Baugh, Julie A. Morris & Robert Ivarie Abstract: Using a replication-deficient retroviral vector based on the avian leukosis virus (ALV), we inserted into the chicken genome

38、 a transgene encoding a secreted protein, -lactamase, under the control of the ubiquitous cytomegalovirus (CMV) promoter. Biologically active -lactamase was secreted into the serum and egg white of four generations of transgenic chickens. The expression levels were similar in successive generations,

39、 and expression levels in the magnum of the oviduct were constant over at least 16 months in transgenic hens, indicating that the transgene was stable and not subject to silencing. These results support the potential of the hen as a bioreactor for the production of commercially valuable, biologicall

40、y active proteins in egg white. 3 3、胚胎干细胞介导法、胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞导入法是指将基因导入胚胎干细胞，然后将转胚胎干细胞导入法是指将基因导入胚胎干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成成，形成嵌合体嵌合体，直至达到种系嵌合。因此，可以将其作，直至达到种系嵌合。因此，可以将其作为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。即从早期为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。即从早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细

41、胞系. . 特点：特点： 优点：在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择一个优点：在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择一个特殊的基因型，用外源特殊的基因型，用外源DNADNA转染以后，胚胎干细胞可以被转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合外源克隆，继而可以筛选含有整合外源DNADNA的细胞用干细胞融的细胞用干细胞融合，由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。合，由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。 缺点：许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因。缺点：许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因。4 4、精子介导法、精子介导法 精子介导法：将成熟的精子与外源精子介导法：将

42、成熟的精子与外源DNADNA进行预培进行预培养之后，使精子有能力携带外源养之后，使精子有能力携带外源DNADNA进入卵中，进入卵中， 使之受精，并使外源使之受精，并使外源DNADNA整合于染色体中。精子整合于染色体中。精子携带携带DNA DNA 主要是通过三种途径来完成，即将主要是通过三种途径来完成，即将外源外源DNADNA与精子共孵育、电穿孔导入法和脂质体传染与精子共孵育、电穿孔导入法和脂质体传染法法。 该方法简单、方便，依靠生理受精过程，该方法简单、方便，依靠生理受精过程， 免去免去了原核的损伤。了原核的损伤。 土壤农杆菌介导法；土壤农杆菌介导法； 基因枪法；基因枪法； 花粉管通道法；花粉

43、管通道法； 其它方法：脂质体介导法其它方法：脂质体介导法, ,显微注射法，显微注射法，电击法电击法, ,超声波导入法超声波导入法, ,低能离子束介导低能离子束介导法等法等. .三）植物转基因技术三）植物转基因技术1 1、土壤农杆菌介导法、土壤农杆菌介导法 土壤农杆菌介导法利用土壤农杆菌介导法利用根癌农杆菌根癌农杆菌作为载作为载体来导入基因的。体来导入基因的。 该法的主要优点是利用原生质体本身具有该法的主要优点是利用原生质体本身具有摄取外来物质的特异性导入外源目的基因，摄取外来物质的特异性导入外源目的基因，且对细胞的伤害少，可以一次转化许多原且对细胞的伤害少，可以一次转化许多原生质体。生质体。2

44、、基因枪法 它是利用火药的爆炸它是利用火药的爆炸, ,高压放电或高压气体高压放电或高压气体作驱动力将作驱动力将载有外源载有外源DNA DNA 的钨或金等金属的钨或金等金属颗粒颗粒加速，射击真空室中的靶细胞或组织，加速，射击真空室中的靶细胞或组织，从而导入外源基因从而导入外源基因. . 它的最大优点是无宿主的限制它的最大优点是无宿主的限制, , 靶受体材靶受体材料类型广泛料类型广泛，操作简便快速，操作简便快速. .3 3、花粉管通道法、花粉管通道法 该法的特点是不需要经由组织再生，可直该法的特点是不需要经由组织再生，可直接从种子发育得到的转基因植株，从而省接从种子发育得到的转基因植株，从而省去一

45、整套人工组培过程，而且所得到的转去一整套人工组培过程，而且所得到的转基因植株也排除镶嵌体的存在。但是这种基因植株也排除镶嵌体的存在。但是这种方法存在转化频率低，重复性不高。方法存在转化频率低，重复性不高。4 4、其它方法、其它方法 植物转基因方法还有脂质体介导植物转基因方法还有脂质体介导法，显微注射法，电击法，超声法，显微注射法，电击法，超声波导入法，低能离子束介导法等。波导入法，低能离子束介导法等。示例示例（小结）（小结）四）转基因技术的应用四）转基因技术的应用 对基因的结构和功能，组织表达特异性，发育对基因的结构和功能，组织表达特异性，发育过程的特异性表达进行研究；过程的特异性表达进行研究

46、； 应用于动物抗病育种及动物生产；应用于动物抗病育种及动物生产； 建立诊断和治疗人类疾病的动物模型（目前最建立诊断和治疗人类疾病的动物模型（目前最为理想的转基因动物是为理想的转基因动物是猪猪, ,因其在器官大小、因其在器官大小、结构和功能上与人类较为相似），生产药用蛋结构和功能上与人类较为相似），生产药用蛋白，生产可用于人体器官移植的动物器官；白，生产可用于人体器官移植的动物器官； 改良植物品种。改良植物品种。五）转基因的应用存在的问题五）转基因的应用存在的问题 转基因表达水平低；转基因表达水平低； 难以控制转基因在宿主基因组中的行为；难以控制转基因在宿主基因组中的行为； 不了解哪些基因控制多

47、数生理过程，不了不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制；的机制； 制作转基因动物的效率低；制作转基因动物的效率低； 对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。一定的负面作用等。四个主要国家转基因作物种植面积占全球。四个主要国家转基因作物种植面积占全球。美国占，达万公顷，转基因作物产美国占，达万公顷，转基因作物产量也居世界第一，美国种植的的大豆、量也居世界第一，美国种植的的大豆、的棉花和的玉米都是转基因作物。的棉花和的玉米都是转基因作物。阿根廷占，达万公顷。阿根廷占，达万公

48、顷。加拿大占，达万公顷。加拿大占，达万公顷。中国第四位，占，达万公顷。中国第四位，占，达万公顷。欧盟国家欧盟国家总总面积不到万公顷，面积不到万公顷，.左右。左右。 2002年数据二、基因敲除二、基因敲除一）定义一）定义 基因敲除基因敲除(gene knock out)(gene knock out)又称基因打靶又称基因打靶(gene targeting)(gene targeting)是通过外源是通过外源DNADNA与染色体与染色体DNADNA之间的之间的同源重组同源重组, ,精细地精细地定点修饰和改造基因定点修饰和改造基因DNADNA片段的技术片段的技术 “它是在胚胎干细胞技术，转基因技术和

49、它是在胚胎干细胞技术，转基因技术和同源重组技术基础上发展起来的同源重组技术基础上发展起来的, , 具有位点专具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNADNA共共同稳定遗传的特点同稳定遗传的特点, ,目前已成为一种较理想的目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。改造生物遗传物质的实验方法。 20022002年年5 5月月1010日，日，自然自然新闻报道了美国哈佛医学院科学新闻报道了美国哈佛医学院科学家家JeffreyJeffrey SettlemanSettleman已经成功培育了只有正常小鼠已经成功培育了只有正常小鼠2/32/3大小的大小的“

50、迷你基因敲除迷你基因敲除”小鼠。其缺失一个蛋白基因小鼠。其缺失一个蛋白基因Rho-GAPRho-GAP。这。这个基因的作用是关闭细胞内结构和活动的信息流。但是个基因的作用是关闭细胞内结构和活动的信息流。但是Rho-GAPRho-GAP能够控制生长是一个很大的惊喜。能够控制生长是一个很大的惊喜。 二）基因敲除的一般流程二）基因敲除的一般流程 目前，基因敲除主要采用突 变 基 因目前，基因敲除主要采用突 变 基 因(mutated gene)(mutated gene)敲除正常基因以产生定敲除正常基因以产生定位突变位突变(target mutation)(target mutation)。示例示例

51、基因敲除菌的构建基因敲除菌的构建克雷伯氏菌克雷伯氏菌 构建基因敲除载体。构建基因敲除载体。 将基因敲除载体通过一定的方式将基因敲除载体通过一定的方式( (常用电穿孔法常用电穿孔法) ) 导导入同源的胚胎干细胞入同源的胚胎干细胞( embryonic stem cell ,ES ( embryonic stem cell ,ES cell) cell) 中中, ,使外源使外源DNA DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组发生同源重组, , 将基因敲除载体中的将基因敲除载体中的DNA DNA 序列整合到序列整合到内源基因组中从而得以表达。内源基因组中从而得以表

52、达。 筛选发生同源重组的阳性克隆筛选发生同源重组的阳性克隆ESES细胞细胞, , 通过核移植通过核移植法或囊胚腔注射法构建重构胚。再将此重构胚植入假法或囊胚腔注射法构建重构胚。再将此重构胚植入假孕母体内孕母体内, , 使其发育成个体使其发育成个体( (基因敲除动物或嵌合体动基因敲除动物或嵌合体动物物) ) 。 使用囊胚腔注射法构建重构使用囊胚腔注射法构建重构, ,经胚胎移植后获得的个经胚胎移植后获得的个体是嵌合体动物体是嵌合体动物, ,则还需要进行嵌合体动物之间交配获则还需要进行嵌合体动物之间交配获得纯合的基因敲除动物后代。得纯合的基因敲除动物后代。示例示例基因敲除动物的构建基因敲除动物的构建

53、三、基因打靶技术的应用三、基因打靶技术的应用 1在理论研究中的应用在理论研究中的应用 目前目前,已经通过基因打靶技术建立了一已经通过基因打靶技术建立了一些重要基因的转基因小鼠模型些重要基因的转基因小鼠模型,通过对这些通过对这些转基因小鼠表现型进行的研究转基因小鼠表现型进行的研究,深刻揭示了深刻揭示了基因结构与功能的关系。基因结构与功能的关系。 示例示例 klotho (kl) klotho (kl) 基因是基因是MatsumuraMatsumura等在研究自发型等在研究自发型高血压时发现的与高血压时发现的与衰老衰老有关的新基因。有关的新基因。kl kl 基因主基因主要在肾脏和脑表达要在肾脏和脑

54、表达, ,其表达产物有膜结合型和分泌其表达产物有膜结合型和分泌型两种蛋白异构体形式型两种蛋白异构体形式, ,二者可能分别是膜结合受二者可能分别是膜结合受体和体液调节信号蛋白。体和体液调节信号蛋白。 kl kl 基因敲除小鼠过早出现和人类衰老相关的多种基因敲除小鼠过早出现和人类衰老相关的多种行为和病理生理改变行为和病理生理改变, ,如寿命缩短、运动失调、性如寿命缩短、运动失调、性功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、肺气功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、肺气肿、骨质疏松、免疫功能降低等。肿、骨质疏松、免疫功能降低等。 证明证明kl kl 基因是抑制衰老的基因基因是抑制衰老的基因, ,其分泌性

55、蛋白是其分泌性蛋白是抗衰老激素。抗衰老激素。2在人类疾病基因治疗中的应用在人类疾病基因治疗中的应用 人类疾病基因治疗是通过目的基因的表达人类疾病基因治疗是通过目的基因的表达, ,抑制、抑制、替代或补偿缺陷基因替代或补偿缺陷基因, ,从而恢复受累细胞、组织从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能或器官的生理功能, ,达到疾病治疗目的的一种方达到疾病治疗目的的一种方法法, ,其最终是要通过向体细胞或组织器官注射外其最终是要通过向体细胞或组织器官注射外源基因及载体源基因及载体, ,通过外源基因的表达通过外源基因的表达, ,纠正体内缺纠正体内缺陷基因的表达来实现的。陷基因的表达来实现的。通过基因敲除技术

56、建立通过基因敲除技术建立人类疾病的转基因动物模型人类疾病的转基因动物模型, ,对揭示人类疾病的对揭示人类疾病的发病过程、机理及探索治疗途径发病过程、机理及探索治疗途径, ,特别是遗传性特别是遗传性疾病疾病, ,恶性肿瘤等具有十分重要的意义。恶性肿瘤等具有十分重要的意义。 示例 OA1 (OA1 (眼球白化症眼球白化症,ocular albinism) ,ocular albinism) 是一种基因紊乱遗是一种基因紊乱遗传性疾病传性疾病, ,能引起视力严重下降能引起视力严重下降, ,斜视、光恐怖、眼球震颤。斜视、光恐怖、眼球震颤。IncertiIncerti通过敲除法去除小鼠通过敲除法去除小鼠O

57、A1 OA1 基因基因, ,眼科检查显示眼球眼科检查显示眼球底部黑色素不足底部黑色素不足, , 临床症状表现与人的相似临床症状表现与人的相似, ,从而用来研从而用来研究究OA1 OA1 的发病机制。的发病机制。 Witting Witting 等敲除了小鼠等敲除了小鼠LDL(LDL(低密度脂蛋白低密度脂蛋白, low density , low density lipoprotein) lipoprotein) 受体基因与载脂蛋白受体基因与载脂蛋白E(apolipoprotein E) E(apolipoprotein E) 基因基因, ,这两种基因的缺乏会导致人在早期易患心脏病这两种基因的缺

58、乏会导致人在早期易患心脏病, ,血浆血浆中中LDL LDL 和胆固醇的浓度升高。当给基因敲除小鼠饲喂与人和胆固醇的浓度升高。当给基因敲除小鼠饲喂与人的营养水平相似的饲料时的营养水平相似的饲料时, ,该基因敲除小鼠早期心脏病患该基因敲除小鼠早期心脏病患病率明显高于对照组且症状表现与人的相似病率明显高于对照组且症状表现与人的相似, ,适用于心脏适用于心脏病早期发病机制的研究。病早期发病机制的研究。 人类器官移植在人类疾病治疗中起举足轻重的作用人类器官移植在人类疾病治疗中起举足轻重的作用, ,但有两大但有两大问题一直未得到解决问题一直未得到解决: : 一是器官来源一是器官来源, ,目前器官来源主要是

59、尸目前器官来源主要是尸体体, ,受到时间和运输等条件的限制受到时间和运输等条件的限制, ,在有些地方还涉及到宗教在有些地方还涉及到宗教的问题的问题; ;二是器官移植的免疫排斥反应。目前要找到与受体血二是器官移植的免疫排斥反应。目前要找到与受体血清型完全相匹配的器官可能性很小清型完全相匹配的器官可能性很小, ,临床上只能靠药物来抑止临床上只能靠药物来抑止排斥反应。基因敲除动物模型可能会解决这两个难题。排斥反应。基因敲除动物模型可能会解决这两个难题。 Kuwaki Kuwaki 等采用基因敲除法等采用基因敲除法, ,将引起超急性排斥反应的半乳糖将引起超急性排斥反应的半乳糖转移酶基因敲除转移酶基因敲

60、除, ,用此方法培育的动物的器官可以移植到人体用此方法培育的动物的器官可以移植到人体而无排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因敲除猪而无排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因敲除猪, ,且且已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验, ,经经移植后的狒狒存活了移植后的狒狒存活了2 - 6 2 - 6 个月个月( (均值为均值为7878天天) ,) ,且均未出现且均未出现超急性排斥反应的表现。这是目前为止异种心脏移植存活时超急性排斥反应的表现。这是目前为止异种心脏移植存活时间最长的例子。虽然异种心脏移植还有许多问题需要解决间最长的例子