第二章2电压钳制和膜片钳制技术2012925

1、Voltage clamp technique 利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐明跨膜电变化机制，必须应用明跨膜电变化机制，必须应用电压钳制技术电压钳制技术。这一技术首先是由这一技术首先是由ColeCole及其同事设计，在经及其同事设计，在经HodgkinHodgkin等人加以改进，用于神经电生理研究，等人加以改进，用于神经电生理研究，弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。 一、细胞膜的生物物理特性(Biophysical propertie

2、s of cell membrane) 细胞膜上以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同细胞膜上以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的特性的蛋白质。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化状态及其形成过程中等都是细胞膜极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质电缆性质(cable properties)(cable properties)的反映。的反映。( (轴浆电阻与膜电阻、轴浆电阻与膜电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用衰减以及在时间上的延缓作用神经的神经的“电缆电缆”性性质

3、质) )。细胞膜的电缆特性从它的等效电路及其时间常细胞膜的电缆特性从它的等效电路及其时间常数和空间常数得到证实。数和空间常数得到证实。 (一) 细胞膜的等效电路 从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为电阻电容器。它具备电阻电容器。它具备细胞浆电阻细胞浆电阻（纵向电阻，（纵向电阻，RoRo），），膜电阻膜电阻（横向电阻，（横向电阻，RmRm），），膜电容膜电容（CmCm）和和膜电位膜电位（EmEm）四方面的电学特性，根据这四）四方面的电学特性，根据这四方面特性即可构成其方面特性即可构成其等效电路等效电路（Equivalent Equivalent Circu

4、itCircuit）。）。outsideinside膜电位等效电路的简化图膜电位等效电路的简化图Cm Cm 膜电容膜电容RmRm 膜电阻膜电阻EmEm 离子平衡电位离子平衡电位Ro Ro 细胞外液的纵向电阻（细胞外液的纵向电阻（/cm/cm） RiRi 轴浆的纵向电阻（轴浆的纵向电阻（/cm/cm）RoCmRmEm+-离子通道等效电路 细胞膜的细胞膜的等效电路等效电路是一个并联的阻容是一个并联的阻容电路，膜活动时既有电压的改变，同时又电路，膜活动时既有电压的改变，同时又有电流的改变。有电流的改变。电位的改变可引起电容器电位的改变可引起电容器的充、放电，也可用于电阻器上的电流流的充、放电，也可用

5、于电阻器上的电流流动。动。通过电容器的电流为通过电容器的电流为IcIc ，通过电阻，通过电阻的电流为的电流为IrIr。1 纵向电阻纵向电阻（Ro、Ri） 由胞浆的性质所决定由胞浆的性质所决定，具有较高的电阻率，具有较高的电阻率，它与直径呈反比关系它与直径呈反比关系（直径大、电阻小，直（直径大、电阻小，直径小，电阻大）。径小，电阻大）。由于它的存在，使生物电由于它的存在，使生物电的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。它是单位长度的电阻，单位是它是单位长度的电阻，单位是/cm /cm ，细胞细胞外间质的容积很大，其单位长度电阻（外间质的容积很大，其单位长度

6、电阻（RoRo）较较RiRi小。小。 2.横向电阻（横向电阻（redial resistance） 即即细胞膜本身具有的膜电阻细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜。细胞膜由双层脂质构成，厚度很薄，但具有很高由双层脂质构成，厚度很薄，但具有很高的电阻，即绝缘性。的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过膜电阻表示离子通过膜的有限能力。膜的有限能力。 膜电阻反映了离子是否膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（容易通透膜的情况。膜电阻（RmRm）的大小）的大小反映了膜结构电学方面的差异。反映了膜结构电学方面的差异。2.横向电阻（横向电阻（redial resistance） 膜电位、膜电流膜电位、膜电流

7、和和膜电阻膜电阻的关系遵循的关系遵循欧姆定律欧姆定律： Em = Im . RmEm = Im . Rm I = V/R I = V/R 膜电阻越大，对电流的导通能力越小。膜电阻越大，对电流的导通能力越小。 膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（阻（RmRm）的倒数）的倒数膜电导膜电导（G G，g g）。）。I = g VI = g V（膜电位（膜电位恒定的情况下，膜电导越大，膜电流也越大。恒定的情况下，膜电导越大，膜电流也越大。 不同的离子有不同的电导不同的离子有不同的电导。 电导的单位是电导的单位是Siemens( S ).Siemens(

8、 S ).3.膜电容膜电容（capacity） 表示膜的绝缘及储存电荷的性质表示膜的绝缘及储存电荷的性质。任何一任何一种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排在一起，称为电容器。在一起，称为电容器。细胞外液及细胞内液均细胞外液及细胞内液均为含电解质的溶液，可看作为两个导体；细胞为含电解质的溶液，可看作为两个导体；细胞膜是含脂质的膜，可视作为绝缘体。细胞外液膜是含脂质的膜，可视作为绝缘体。细胞外液- -细胞膜细胞膜- -细胞内液三者组成了电容。细胞内液三者组成了电容。3.膜电容膜电容（capacity） 电容大小与细胞体积和细胞膜表面积有关。电容大小与细胞

9、体积和细胞膜表面积有关。膜电容和膜面积呈正比，与膜的厚度呈反比。膜电容和膜面积呈正比，与膜的厚度呈反比。 电容的单位是法拉第（电容的单位是法拉第（F F）。）。 膜电容的测量可用于膜电容的测量可用于细胞膜表面积细胞膜表面积的测定，的测定，对推算某种对推算某种离子通道在单位膜面积上的密度离子通道在单位膜面积上的密度有有一定帮助。一定帮助。4 膜电位膜电位 （membrane potential） 当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流动时，就相当于在电容器上充电或放电而产生电动时，就相当于在电容器上充电或放电而产生电位差，即跨膜电位。位差，即跨膜电位。膜电位

10、的高低决定于跨膜电膜电位的高低决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高低与膜两侧的电荷成正比化学梯度；膜电位的高低与膜两侧的电荷成正比。 在膜两側离子浓度不变的情况下，膜电位则在膜两側离子浓度不变的情况下，膜电位则取决于膜电导的改变（离子通透性的改变）。反取决于膜电导的改变（离子通透性的改变）。反过来，膜电导的大小又受到膜电位的控制（离子过来，膜电导的大小又受到膜电位的控制（离子通透性的电压依赖性）。通透性的电压依赖性）。5 膜电流膜电流（membrane current） 任何电流都是电容电流（任何电流都是电容电流（IcIc）和电阻）和电阻电流（电流（IrIr）两种形式通过细胞膜，）两种形式通过细胞

11、膜，前者导前者导致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携带流经细胞膜的。带流经细胞膜的。 I m = Ic + IrI m = Ic + Ir5 膜电流膜电流（membrane current） 电位的变化引起膜电容的充电或放电，电位的变化引起膜电容的充电或放电，而电流的变化则表现在膜电阻上的电流流而电流的变化则表现在膜电阻上的电流流动。动。IcIc只在膜电位发生变化的一瞬间出现，只在膜电位发生变化的一瞬间出现，若将膜电位固定在一定水平，记录到的仅若将膜电位固定在一定水平，记录到的仅为为IiIi（IrIr），这是电压钳制技术的电学基），这是电压钳制技术的电学基础

12、之一。础之一。(二) 细胞膜的时间常数细胞膜的时间常数（time constant） 时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，用一时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改变的（缓慢）程度。也就是变的（缓慢）程度。也就是膜电位通过膜电阻和膜膜电位通过膜电阻和膜电容充电到电容充电到63%63%或放电到或放电到37 %37 %所需的时间。所需的时间。 = Rm = Rm Cm Cm = = 膜的时间常数膜的时间常数 (ms(ms）;Rm;Rm= =膜电阻（膜电阻（kk） Cm=Cm=膜电容（膜电容（FF）的大小与

13、膜的电学性质有关，与膜的形状无关。的大小与膜的电学性质有关，与膜的形状无关。 (三) 细胞膜的空间常数细胞膜的空间常数（space constant）空间常数，是度量电压的空间衰减，即标志电压依距离而衰减的程度的一个常数。即:膜电位通过膜电阻和纵向电阻所组成的分流电路随距离的增大而按指数曲线规律衰减的速度.或表示膜电位按指数曲线规律衰减到37%所需要的距离。细胞直径越大，空间常数越大。 (一)、定义定义 利用负反馈原理将膜电位在空间和时间上固定利用负反馈原理将膜电位在空间和时间上固定于某一恒定的测定值，以研究动作电位产生过程中于某一恒定的测定值，以研究动作电位产生过程中的离子通透性与膜电位之间

14、的依从关系的技术。的离子通透性与膜电位之间的依从关系的技术。 电压钳制术是利用负反馈电路，在一定时间内电压钳制术是利用负反馈电路，在一定时间内将跨膜电位（将跨膜电位（TransmembraneTransmembrane Potential Potential， V Vm m），），保持在某个选定的电位水平，此电位称为保持在某个选定的电位水平，此电位称为保持电位保持电位（Holding potentialHolding potential，V Vh h），或者使保持电位突然），或者使保持电位突然变到某个特定的幅值的方波电位，称为变到某个特定的幅值的方波电位，称为钳制电位钳制电位（Clamping

15、 potentialClamping potential）或）或指令电位指令电位（Command Command potentialpotential，VcVc）。 (二)电压钳方法 电容器电流 Ic=d（CmV）/dt电阻器上电流 IR流过膜的电流总量 Idv / dt = 0 所有的电流将都是流过膜电阻的，这种电流将能反映离子的流动。 电压源（SG）使膜电位固定在特定的水平，并以放大器（AV）记录，该放大器与一个反馈放大器（AFB）连接，这一反馈电流通过膜，正好抵消因加电压而引起的离子电流，通过电流监视器测量电流。（三）电压钳技术的优缺点： 很容易将膜电容电流与离子电流分开；很容易将膜电容

16、电流与离子电流分开； 可将膜电流分成不同的成分一可将膜电流分成不同的成分一I INaNa、I IK K、 Ica Ica 等（在灌流液中加入或去除某种离子）等（在灌流液中加入或去除某种离子） 能精确反映由离子通道的开放和关闭，引起能精确反映由离子通道的开放和关闭，引起的膜电导的改变，能把离子通透性变化的时间关的膜电导的改变，能把离子通透性变化的时间关系加以描述。系加以描述。 能分析离子通透性变化与膜电位的关系，在能分析离子通透性变化与膜电位的关系，在研究电压调节通道的行为方面有很大价值。研究电压调节通道的行为方面有很大价值。 1 1 优点优点 必须在细胞内插入两个电极，对细胞必须在细胞内插入两

17、个电极，对细胞损伤很大；损伤很大； 对体积小的细胞，实验难以实现；对体积小的细胞，实验难以实现； 对形态复杂的细胞，很维保持细胞膜对形态复杂的细胞，很维保持细胞膜各处电位一致；各处电位一致； 只研究一个细胞上众多通道的综合活只研究一个细胞上众多通道的综合活动规律，无法反映单个通道活动的特点动规律，无法反映单个通道活动的特点。 2 缺点缺点 :蛙坐骨神经元单个蛙坐骨神经元单个Ranvier结的电压钳记录结的电压钳记录（四）几种电压钳方法 双微电极法双微电极法 单蔗糖间隙（单蔗糖间隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 双蔗糖间隙（双蔗糖间隙（Doub

18、le Sucrose GapDouble Sucrose Gap）法）法 双微电极法双微电极法 单蔗糖间隙（单蔗糖间隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 双蔗糖间隙（双蔗糖间隙（Double Sucrose GapDouble Sucrose Gap）法）法 图1-2 心肌双微电极 电压钳法示意图Em ：膜电位； Ec：控制电位； Vo：钳制电位； I：输出电流双微电极法双微电极法 单蔗糖间隙（单蔗糖间隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 双蔗糖间隙（双蔗糖间隙（Double Sucrose Gap

19、Double Sucrose Gap）法）法 图1-3 单蔗糖间隙法原理图 图1-4 双蔗糖间隙法原理图 Em ：膜电位； Ec：控制电位； Em ：膜电位； Ec：控制电位； Vc：钳制电位； I：输出电流 Vc：钳制电位； I：输出电流电极接触细胞电极接触细胞负压吸引形成负压吸引形成形膜囊泡形膜囊泡提起电极，囊泡与细胞脱离提起电极，囊泡与细胞脱离ABCD第三节第三节 膜片钳制技术膜片钳制技术 膜片钳制技术膜片钳制技术（patch clamp technique)patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳

20、制的一项电生理技术。电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到记到的最小电流可达到pApA级级(10(10-12-12 A) A)。泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学 研 究研 究 室室Institute of myocardium electrophysiology of LZMC. 膜片钳技术的基本概念膜片钳技术的

21、基本概念膜片钳技术膜片钳技术：一种通过微一种通过微电极与细胞膜之间形成紧电极与细胞膜之间形成紧密接触的方法，采用密接触的方法，采用电压电压钳或电流钳技术对生物膜钳或电流钳技术对生物膜上离子通道上离子通道的电活动（尤的电活动（尤其是对单通道）进行记录其是对单通道）进行记录的微电极技术。的微电极技术。Cell微电极微电极一一 基本原理基本原理 膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽

22、微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达高达10-10010-100千欧（即千欧（即G=10G=109 9）。只有在这）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为15M，如果Rseal高达10G（1010）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在IV转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(R

23、f)的电压降而被检测出。 膜片钳与电压钳的区别 膜电位钳制的方法不同；膜电位钳制的方法不同； 电位固定的细胞面积不同；电位固定的细胞面积不同； 研究的离子通道数目不同；研究的离子通道数目不同； (1)测量部分： (2)串联电阻补偿部分： (3)电容补偿部分： (4)指令信号控制部分： (5)电源部分：膜片钳放大器主要组成:电极电流监视器、灵敏度开关、滤波器开关、方式选择开关 。用于校正全细胞记录时，由于电极和细胞内之间的通路电阻所造成的膜电位误差 。用来补偿电压突然改变 时引起的电容电流 。将一定的电压加入到刺激信号中，形成一指令信号的保持电压。进行电压钳制时，它决定膜电位值，作电流钳制时，则

24、决定电流值 。贴附式贴附式全细胞记录模式全细胞记录模式负压吸负压吸内面向外式内面向外式外面向外式外面向外式拉拉细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞拉并暴露于空气中拉并暴露于空气中四种经典记录模式四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode)Institute of myocardium electrophysiology of LZMC. 膜片钳技术的基本记录模式膜片钳技术的基本记录模式四种基本记录模式形成示意图四种基本记录模式形成示意图泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学 研 究研 究 室室 细胞贴附式膜片（细胞贴

25、附式膜片（cell-attached patch） 优点优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。 缺点缺点： 不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。 于细胞牢固贴附于微管电极的尖由端而得名。它可用于记于细胞牢固贴附于微管电极的尖由端而得名。它

26、可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。研究通道的活动。 细胞细胞电极电极细胞膜细胞膜胞外液胞外液胞内液内面向外式膜片 (inside-out patch) 细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。 特点特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等

27、直接较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。形成。应用：应用：可研究胞内信使物质可研究胞内信使物质cAMPcAMP、cGMPcGMP、CaCa2+2+，三磷酸肌，三磷酸肌醇（醇（IPIP3 3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第调节。这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第

28、二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。 电极脂质双分子层的脂质双分子层的内内面面向浴液面面向浴液 外面向外式膜片(outside out patch) 细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。优点：优点： 缺点：缺点： 应用：应用： 可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。 实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。 可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等

29、对受体型的离子通道研究。 Patch-pipette脂质双分子层的脂质双分子层的外外面面向浴液面面向浴液全细胞记录构型 (whole cell recording) 记录的电流属于宏观电流（macroscopical current），是整个细胞离子通道活动形成的总和电流。若采用膜片钳放大器内的电流钳模式，还可以记录细胞的静息电位和动作电位。 特点：特点： 电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快，因而容易控制细胞内液的成分；记录的是许多通道的综合电流，需改变内部介质以分离电流；适合于对小细胞的电压钳位，对直径大于30m的细胞很难实现钳制；该方法使电生理研究的重点从无脊椎动物大细胞中解脱出来，而向人

30、类和哺乳类细胞发展。细胞细胞电极电极细胞膜细胞膜 膜片钳制技术记录方式膜片钳制技术记录方式 穿孔膜片记录技术（perforated patch recording technique） HomHom和和MartyMarty于于19881988年首次建立了一种对年首次建立了一种对传统全细胞记录法改进的方法，该方法是基传统全细胞记录法改进的方法，该方法是基于某些抗生素如于某些抗生素如制霉菌素制霉菌素（NystatinNystatin），），两两性霉素性霉素B B（AmphotericinAmphotericin B B）等具有在生物）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，将这类抗生素膜上形成通透性

31、孔道的特性，将这类抗生素充灌在电极液中，在形成高阻封接后，可使充灌在电极液中，在形成高阻封接后，可使电极液与细胞内液在电学上相通，因而称作电极液与细胞内液在电学上相通，因而称作穿孔膜片记录技术。穿孔膜片记录技术。 穿孔膜片及穿孔囊泡记录模式穿孔膜片及穿孔囊泡记录模式（Perforated patch and perforated vesicle mode）制霉菌素制霉菌素形成的孔道形成的孔道电极电极受体受体离子通道离子通道提起电极提起电极胞浆胞浆穿孔囊泡穿孔囊泡(外面向外式外面向外式) 穿孔膜片穿孔膜片(缓慢全细胞式缓慢全细胞式)技术点的优缺点优点：与全细胞记录相比，该技术相比有如下优点 由抗

32、生素形成的孔道对于等于或大于葡萄糖的分子均不能通过。因此，在全细胞记录时可避免对胞内重要物质的渗析影响，通道电流衰减现象显著减慢，那些对细胞内通讯及通道调控具有重要作用的第二信使物质仍可正常运行。 因抗生素形成的孔道对多价离子不通透，故胞内的这些离子的浓度就不受电极液的影响。因此可在全细胞电流记录的同时用Ca2+染料测定胞内游离的Ca2+水平 对细胞的损伤作用明显小于微电极细胞内记录及膜片钳全细胞记录，记录时间可持续3小时。 高阻封接不易被破坏，而全细胞记录的负压脉动式抽吸和电压脉冲易致高阻封接破坏。电极串联电阻较低，膜电容更易补偿。缺点： 无法使电极液中的大分子与胞内物质交换。因此研究大分子

33、物质对胞内机制的作用就不能进行。 由于电极液与胞内液之间存在Donnan平衡，因此电极液内必须有与细胞内相同浓度的不通透阴离子和Cl-，否则将导致Cl-流出或流入细胞，使阴离子和水重新平衡，最终导致细胞体液变化。 穿孔所需时间较全细胞法长。 浓度钳（concentration clamp） 用改变灌流液的方法来改变细胞内液或外用改变灌流液的方法来改变细胞内液或外液中某种化学成分和浓度。人工地控制膜内液中某种化学成分和浓度。人工地控制膜内或膜外的溶液成分，并在瞬间阶梯式地改变或膜外的溶液成分，并在瞬间阶梯式地改变某种化学物质的浓度，这种技术就是某种化学物质的浓度，这种技术就是浓度钳浓度钳，也称为

34、也称为化学钳化学钳（chemical clamipchemical clamip）, ,或称或称浓浓度跳变度跳变(concentration jump)(concentration jump)。 人工脂膜的膜电流记录人工脂膜的膜电流记录 把构成细胞膜的脂质分子散布于水表面时，很容易形成亲水端向下脂质单分子层，将单分子层背靠背地折叠起来，就形成类似细胞膜结构的人工脂质双层。纯的脂质双层几乎是绝缘的，但是将含有通道蛋白的脂质小泡融入人工脂膜或将水溶性通道蛋白直接插入人工脂质双层，便可利用膜片钳技术记录到单通道电流。 三三 膜片钳记录的基本步骤膜片钳记录的基本步骤 （一）、液体配制（一）、液体配制

35、主要根据研究通道的不同，所用细胞的主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，基本原则是保持不同，配制相应的液体，基本原则是保持2 2个个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。 （二）、标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，单独或联合使用，有些组织还要加用其它酶，如弹性纤维酶等。v 豚鼠心室肌细胞急性酶分离方法 v 肠系膜动脉平滑肌细胞分离 （三）、微管电极的制

36、备（三）、微管电极的制备 一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在12m之间，抛光与涂布液体硅酮树酯后，充灌电极液。1 1、微管电极拉制、微管电极拉制 2 2、电极热抛光、电极热抛光 3 3、缘树脂涂抹、缘树脂涂抹 4 4、电极液充灌、电极液充灌 （四）、高阻抗封接形成（四）、高阻抗封接形成 1在恒温条件下，将细胞贴壁良好的载玻片移入有浴液的浴槽中。浴槽不能太深，以尽量减少电极进入浴液的深度，从而减少浮游电容；2倒置相差显微镜下选择立体感强、活性好的细胞进行实验；3使用新拉制的微管电极，用细塑料管以反充灌方式灌电极液入电极尖端，若含有气泡，可手持微电极使其尖端朝下，用手指敲弹几下管壁即可排除，然

37、后再将微电极安装在探头上。4 4 当微管电极在微推进器帮助下进入浴液时，当微管电极在微推进器帮助下进入浴液时，用注射器向电极施加一正压（用注射器向电极施加一正压（12cm12cmH H2 2O O），），以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放大器上大器上pipette offsetpipette offset旋钮，将电极电压补偿旋钮，将电极电压补偿到零。同时由膜片钳放大器向微管电极发放到零。同时由膜片钳放大器向微管电极发放电压为电压为5mV5mV、波宽、波宽40ms40ms的方波脉冲信号，用于的方波脉冲信号，用于观察封接过程；观察封接过程；5 5微推进

38、器将微管电极送入到即将接触细胞时，撤微推进器将微管电极送入到即将接触细胞时，撤去正压，并继续向选定的细胞表面推进，当电极尖去正压，并继续向选定的细胞表面推进，当电极尖端轻触到细胞表面时其应答电流变小，这时只要给端轻触到细胞表面时其应答电流变小，这时只要给微管电极尖端管腔内施加一负压（微管电极尖端管腔内施加一负压（1020cm H1020cm H2 2O O），），若在计算机屏幕上看到应变电流突然下降至零，电若在计算机屏幕上看到应变电流突然下降至零，电流噪声随之减少，则提示微管电极尖端与细胞形成流噪声随之减少，则提示微管电极尖端与细胞形成近似电绝缘，其阻抗约近似电绝缘，其阻抗约10100G101

39、00G，说明，说明高阻抗封接高阻抗封接（gigagiga seal seal）形成，这时的膜片为细胞贴附式膜片。）形成，这时的膜片为细胞贴附式膜片。在此基础上，根据不同的实验要求，再制成不同类在此基础上，根据不同的实验要求，再制成不同类型的膜片构型。型的膜片构型。保证高阻封接要点：保证高阻封接要点： 电极电阻适当；电极电阻适当； 电极尖端清洁；电极尖端清洁； 负压抽吸系统密闭；负压抽吸系统密闭； 电极与细胞相贴适度；电极与细胞相贴适度； 细胞膜清洁，活性好。细胞膜清洁，活性好。 膜片钳记录系统示意图膜片钳记录系统示意图灌流槽In bathPushed against cellMore pres

40、sure against cellSealGo whole cell（五）、数据采集与分析（五）、数据采集与分析 实验中通道电流信号经膜片钳放大器放大后再经实验中通道电流信号经膜片钳放大器放大后再经1212位位A/DA/D、D/AD/A转换器输入计算机用于电流信号采集，转换器输入计算机用于电流信号采集，系统连接如下图所示：系统连接如下图所示： 分析的内容分析的内容 1 1、宏观电流的分析、宏观电流的分析 宏观电流（宏观电流（macroscopicalmacroscopical current current）是指）是指膜上许多通道同时开放形成的离子电流膜上许多通道同时开放形成的离子电流，是，是

41、由许多单通道电流总和形成的。应用电压钳由许多单通道电流总和形成的。应用电压钳技术在单细胞或多细胞标本上记录的电流和技术在单细胞或多细胞标本上记录的电流和膜片钳全细胞模式记录的电流都属宏观电流。膜片钳全细胞模式记录的电流都属宏观电流。（1 1）、通道的药理学特性）、通道的药理学特性 通道的药理学特性是通道分类的重要依据，许通道的药理学特性是通道分类的重要依据，许多通道具有多通道具有特异性阻滞剂特异性阻滞剂和和激动剂激动剂（或开放剂）。（或开放剂）。TTXTTX钠通道特异性阻滞剂，钠通道特异性阻滞剂，TEATEA钾通道特异性阻滞剂，钾通道特异性阻滞剂，CromakilinCromakilinATP

42、ATP敏感钾通道特异性开放剂敏感钾通道特异性开放剂 利用它们可以区分膜电流的成分，有助于确利用它们可以区分膜电流的成分，有助于确认通道的种类。认通道的种类。 （2 2）、通道的门控特性）、通道的门控特性 通道的通道的门控性门控性主要是指主要是指电压门控通道的激活与失电压门控通道的激活与失活对电压和时间的依赖性。活对电压和时间的依赖性。典型的电压门控通道的典型的电压门控通道的活动包括激活过程和失活过程。活动包括激活过程和失活过程。钠通道门控的H-H模型 （3 3）、通道的电流）、通道的电流电压关系电压关系 通道的电流通道的电流电压关系（电压关系（current-voltage current-v

43、oltage relationship, relationship, 简称简称I-VI-V曲线曲线）是反映离子通道）是反映离子通道动力学性质的重要参数动力学性质的重要参数, ,可分析通道的激活过程、可分析通道的激活过程、反转电位、整流特性和离子选择性等。反转电位、整流特性和离子选择性等。 要获得要获得I-VI-V曲线，需要给予连续变化的阶跃曲线，需要给予连续变化的阶跃式脉冲电压。式脉冲电压。、通道整流特性的分析、通道整流特性的分析 通道通道I-VI-V关系曲线与横坐标的交点是该通道电关系曲线与横坐标的交点是该通道电流的流的反转电位反转电位V Vrevrev或称或称零电流电位零电流电位。通道的整

44、流特。通道的整流特性则是指通道电流对膜电位的依赖性，通常可用性则是指通道电流对膜电位的依赖性，通常可用I-I-V V关系予以判断。关系予以判断。通道的电流电压关系曲线 l 整流（Rectification） 电流和电压的关系不满足欧姆定律的直线关系。原因是离子通道的开放导致膜电阻迅速降低。整流现象是许多离子通道的特点。有整流有整流无整流无整流V=IRcV=IRv离子通道不开放时离子通道不开放时膜的被动反应膜的被动反应离子通道开放时离子通道开放时膜的主动反应膜的主动反应v 外向整流外向整流随膜电位的去极化，随膜电位的去极化，I-V曲线明显向曲线明显向Y轴（电流轴）轴（电流轴）靠近靠近。如。如IK

45、电流。电流。v 内向整流内向整流随膜电位的去极化，随膜电位的去极化，I-V曲线明显向曲线明显向X轴（电压轴）轴（电压轴）靠近靠近。如烟碱电流。如烟碱电流。 IK电流的外向整流电流的外向整流烟碱电流的内向整流烟碱电流的内向整流去极化方向去极化方向去极化方向去极化方向、通道离子选择性的分析、通道离子选择性的分析 如果通道的离子选择性很高，只能或主要如果通道的离子选择性很高，只能或主要通过一种离子，则通过一种离子，则V Vrevrev应等于或接近该离子的应等于或接近该离子的平衡电位。平衡电位。如果通道通过多种离子，则可利用如果通道通过多种离子，则可利用改变膜两侧某种离子浓度差以后的改变膜两侧某种离子

46、浓度差以后的V Vrevrev变化来变化来判断膜电流中是否的该离子成分。例如判断膜电流中是否的该离子成分。例如I If f通道通道的的I-VI-V曲线随曲线随NaNa。的增高而右移，。的增高而右移，V Vrevrev相应变相应变正，说明正，说明I If f通道对钠离子有通透性。通道对钠离子有通透性。2 2、单通道电流的分析、单通道电流的分析（1 1）、通道门控动力学的分析）、通道门控动力学的分析 典型的单通道电流（典型的单通道电流（single channel currentsingle channel current）呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。呈一种振幅相同而持续时间不等的脉

47、冲样变化。它有两个电导水平，即它有两个电导水平，即0 0和和1 1，分别对应关闭和开，分别对应关闭和开放状态。放状态。 A：豚鼠心室肌内向整流钾通道的单通道电流； B：同一膜片上通道开放（上）和关闭（下）时间频数分布直方图。 （2 2）、单通道电导的测定）、单通道电导的测定 在几个不同的钳制电位下记录膜片上单在几个不同的钳制电位下记录膜片上单通道电流，右图为得到单通道的通道电流，右图为得到单通道的I-VI-V曲线，曲曲线，曲线斜率即单通道电导。线斜率即单通道电导。 蛙骨骼肌细胞贴附式膜片的记录 A：不同钳制电位下记录的N2型乙酰胆碱受体阳离子通道电流，左侧数字为膜电位（mV）。B：单通道电流的

48、IV关系，膜电导32pS。l I-V曲线（曲线（Current-voltage curve）电流电流-电压关系曲线。可反映通道的如下动力学参数：电压关系曲线。可反映通道的如下动力学参数：v 激活过程激活过程v 阈电位阈电位v 反转电位反转电位v 整流特性整流特性 I(nA)Ca2+o =5.0mM-8-6-4-2-100-80-60-40-20020 2.5mM 5.0mM 7.5mMVh= -90mVDVm(mV)50ms1nA -60mV0mVCABCa2+o =7.5mMCa2+o =2.5mM（六）、主要仪器设备（六）、主要仪器设备 超净工作台（超净工作台（YJ-1450YJ-1450

49、，苏州净化设备公司，苏州净化设备公司， ChinaChina） 二氧化碳孵箱（二氧化碳孵箱（1815Tc1815Tc，SHEL-LABSHEL-LAB，U.S.AU.S.A）数字式超级恒渐浴槽（数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT HSS-1 CHENDU INSTRUMENT ChinaChina） 微管电极拉制器（微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE JapanPP-83 NARISHIGE Japan） 微管电极抛光仪（微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE JapanME-83 NAEISHIFE Japan） 电子刺激器（电子刺激器（S

50、EN-2030, NIHON KOHDEN, JapanSEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） 膜片钳放大器（膜片钳放大器（AXOPATCH 200B AxonAXOPATCH 200B AxonInstruments Instruments U.S.AU.S.A） 倒置相差显微镜（倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS GermanyAXIOVERT 135 ZEISS Germany） 计算机（计算机（P 800P 800） A/D A/D、D/AD/A转换器（转换器（DIGIDATA-1200 AxonDIGIDATA-1200 AxonInstrum

51、ents U.S.AInstruments U.S.A） pClamp pClamp软件（软件（7.07.0）AxonAxonInstruments U.S.A )Instruments U.S.A ) 喷墨打印机喷墨打印机(HP DESKJET 500 U.S.A ) (HP DESKJET 500 U.S.A ) ( (七七) )、注意事项、注意事项（1）电极尖端抛光：未抛光的玻璃微电极尖端较粗糙，容易损伤细胞膜，玻璃微电极尖端抛光后的口径大小要适宜。抛光后玻璃微电极阻抗应在4-7M之间，随着细胞直径增大或减小，电极阻抗相应减小或增大。(2)装玻璃微电极时，手不要接触银丝电极，银丝电极接通

52、膜片钳放大器，能检测0.06pA电流，若手上带电荷（静电）将可能击穿微电极放大器而造成很大损失。（3 3）动手操作要慢：）动手操作要慢：由于该操作大多在镜下由于该操作大多在镜下进行，放大倍数约进行，放大倍数约400400左右，因此操作幅度过左右，因此操作幅度过大易造成扎伤、扎死细胞，甚至将电极尖端折大易造成扎伤、扎死细胞，甚至将电极尖端折断。断。 （4 4）挑选状态好的细胞作为记录对象：）挑选状态好的细胞作为记录对象：细胞细胞状态不好，不易封接成功或维持较长的时间而状态不好，不易封接成功或维持较长的时间而浪费时间和实验材料，一般首选圆而亮且色泽浪费时间和实验材料，一般首选圆而亮且色泽好的细胞。

53、好的细胞。（5 5）实验台和所有实验仪器要良好接地）实验台和所有实验仪器要良好接地。（6 6）实验操作台尽可能振动可用减振台）实验操作台尽可能振动可用减振台或网或网球置于实验操作台台板下以及将操作台和屏蔽球置于实验操作台台板下以及将操作台和屏蔽分开，以减缓外界的振动。分开，以减缓外界的振动。Institute of myocardium electrophysiology of LZMC. 膜片钳技术发展特点膜片钳技术发展特点1. 记录方式有很大变化：记录方式有很大变化：穿孔膜片钳技术穿孔膜片钳技术(perforated patch (perforated patch clamp); clam

54、p); 巨膜片钳记录方式巨膜片钳记录方式(giant membrane patch); (giant membrane patch); 松散封接记松散封接记录方式录方式(loose patch clamp)(loose patch clamp)等。等。2. 应用技术不断涌现：应用技术不断涌现：微电极内灌注技术；双膜片钳技术法；膜微电极内灌注技术；双膜片钳技术法；膜片探针技术；膜电容测定法；在体膜片钳记录技术；脑片膜片钳记片探针技术；膜电容测定法；在体膜片钳记录技术；脑片膜片钳记录技术；全自动膜片钳技术等等。录技术；全自动膜片钳技术等等。泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学泸 州 医 学

55、院 心 肌 电 生 理 学 研 究研 究 室室Institute of myocardium electrophysiology of LZMC. 膜片钳技术发展特点膜片钳技术发展特点3. 使用的标本种类繁多：使用的标本种类繁多：从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳蜗毛细胞、胃肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳蜗毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等；壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等；从急性分离从急性分离细胞和培养细胞发展到组织片乃至整体动物细胞和培养细胞发展到组织

56、片乃至整体动物；从蜗牛、青蛙发展到大；从蜗牛、青蛙发展到大鼠、人细胞等；鼠、人细胞等；从动物细胞发展到细菌、真菌及植物细胞从动物细胞发展到细菌、真菌及植物细胞。此外膜片。此外膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层、脂质体等人工标本。钳技术还广泛地应用到平面双分子层、脂质体等人工标本。4. 研究对象已经不局限于离子通道：研究对象已经不局限于离子通道：从对离子通道的研究发展到从对离子通道的研究发展到离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学 研 究研

57、究 室室Institute of myocardium electrophysiology of LZMC. 膜片钳技术发展特点膜片钳技术发展特点5. 膜片钳电极已经不单单是传统意义上的电信号记录电极：膜片钳电极已经不单单是传统意义上的电信号记录电极：它它还作为其他研究方法的工作使用，如用于进行单细胞还作为其他研究方法的工作使用，如用于进行单细胞PCRPCR技术时的细技术时的细胞内容物抽吸工具。胞内容物抽吸工具。6. 应用范围日益广泛：应用范围日益广泛：膜片钳技术已经渗透到生物学领域的许多膜片钳技术已经渗透到生物学领域的许多学科中，如分子生物学、药理学、免疫学等等，成为生物学研究的学科中，如分

58、子生物学、药理学、免疫学等等，成为生物学研究的一种主要技术手段，与其他生物学技术的结合应用已经成为膜片钳一种主要技术手段，与其他生物学技术的结合应用已经成为膜片钳技术的主要发展趋势。技术的主要发展趋势。 2121世纪生命科学的两个革命！世纪生命科学的两个革命！泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学泸 州 医 学 院 心 肌 电 生 理 学 研 究研 究 室室 膜片钳技术被称为研究离子通道膜片钳技术被称为研究离子通道的的“金标准金标准”。 膜片钳技术发展至膜片钳技术发展至今，主要用于两个领域：一是今，主要用于两个领域：一是科学科学研究研究；二是；二是新药研发新药研发。对于科学研。对于科学研究

59、而言，膜片钳技术已经成为现代细究而言，膜片钳技术已经成为现代细胞电生理学的常规方法，它不仅可以胞电生理学的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务。直接或间接为临床医学研究服务。目目前膜片钳技术广泛应用于医学（神经前膜片钳技术广泛应用于医学（神经（脑）科学、心血管科学、药理学、（脑）科学、心血管科学、药理学、中医药学等）、植物细胞生理学、运中医药学等）、植物细胞生理学、运动生理学、昆虫毒理学以及海洋鱼类动生理学、昆虫毒理学以及海洋鱼类神经生理学等多学科领域研究。神经生理学等多学科领域研究。 一膜片钳在神经科学中的应用一膜片

60、钳在神经科学中的应用 应用膜片钳技术可以研究神经信号的产生和传导。由于中枢神经系统应用膜片钳技术可以研究神经信号的产生和传导。由于中枢神经系统的脆弱性和难以接近性，研究脑的网络特性及其复杂的调控功能是十分困的脆弱性和难以接近性，研究脑的网络特性及其复杂的调控功能是十分困难的。在具有简单网络系统的离体脑片上应用膜片钳技术，为这一方面的难的。在具有简单网络系统的离体脑片上应用膜片钳技术，为这一方面的深入研究开辟了一个崭新的领域。目前将膜片钳技术应用到神经系统的研深入研究开辟了一个崭新的领域。目前将膜片钳技术应用到神经系统的研究是不少的。但究是不少的。但主要侧重主要侧重于于用膜片钳技术用膜片钳技术