第八章培养基灭菌及发酵设备

1、 第八章第八章 培养基灭菌及培养基灭菌及发酵设备发酵设备一一 培养基灭菌及灭菌设备培养基灭菌及灭菌设备培养基灭菌的目的：保证所选用的培养基没有受到其培养基灭菌的目的：保证所选用的培养基没有受到其它杂菌的污染它杂菌的污染染菌产生的不良后果？染菌产生的不良后果？灭菌的方法有：化学药剂灭菌、射线灭菌、干热灭灭菌的方法有：化学药剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌菌、湿热灭菌、过滤除菌培养基的灭菌方式：培养基的灭菌方式：1.湿热灭菌：湿热灭菌：2.过滤除菌过滤除菌3.微波灭菌微波灭菌1.湿热灭菌法湿热灭菌法是利用是利用水蒸气的热量水蒸气的热量将物品灭菌。将物品灭菌。水蒸气具有穿透能力强，易于

2、传导热量的优点。水蒸气具有穿透能力强，易于传导热量的优点。湿热湿热更容易将微生物细胞中蛋白质的更容易将微生物细胞中蛋白质的氢键氢键打断，使其发生变性打断，使其发生变性凝固。凝固。优点：优点：经济、快速经济、快速不同微生物菌株，所需湿热灭菌的温度和时间不一样。不同微生物菌株，所需湿热灭菌的温度和时间不一样。多数细菌和真菌营养体在多数细菌和真菌营养体在60左右，左右，5-10min死亡；死亡；真菌和酵母菌的孢子，真菌和酵母菌的孢子，80 以上才会死亡；以上才会死亡；嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢在嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢在121 ,12min才能死亡才能死亡常见的湿热灭菌有以下几种：常见的湿热灭菌有以下几种

3、：1）常规加压灭菌法）常规加压灭菌法因无法了解待灭菌培养基中微生物的热致死特性，因无法了解待灭菌培养基中微生物的热致死特性，常假常假设杂菌是嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢设杂菌是嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；灭菌工艺是灭菌工艺是0.1MPa，维持，维持15-30min(灭菌是靠温度）灭菌是靠温度）2）连续灭菌法）连续灭菌法3）巴斯德消毒法）巴斯德消毒法一般一般60-80 ,15s-30min;现在超高温巴斯德灭菌法，现在超高温巴斯德灭菌法，140 ,3-4s，急剧冷却至，急剧冷却至75 4）间歇灭菌法：）间歇灭菌法：80-100 ,15-60min,室温过夜，重复三室温过夜，重复三次次2.过滤除菌法过滤除菌

4、法含有酶、血清、维生素、氨基酸等容易热失活的培养基，含有酶、血清、维生素、氨基酸等容易热失活的培养基，可以采用此法。可以采用此法。过滤介质过滤介质有膜材料：醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、有膜材料：醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚丙烯腈等尼龙、聚丙烯腈等深层过滤材料：石棉板、烧结陶瓷、烧结金属等深层过滤材料：石棉板、烧结陶瓷、烧结金属等过滤器过滤器主要有两类：主要有两类：绝对过滤器绝对过滤器：过滤介质呈膜状，：过滤介质呈膜状，滤孔滤孔比要除去的颗粒直径比要除去的颗粒直径小，理论上可以完全除去微生物。去除机制为小，理论上可以完全除去微生物。去除机制为拦截拦截作用。作用。另一类是另一类是深

5、层过滤器深层过滤器：空隙的直径比要除去颗粒的直径大，：空隙的直径比要除去颗粒的直径大，由毡毛、棉花、石棉和玻璃纤维组成。由毡毛、棉花、石棉和玻璃纤维组成。工作机制是通过工作机制是通过惯性碰撞、扩散和吸附作用惯性碰撞、扩散和吸附作用除菌。除菌。过滤介质有两类：一类是棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和过滤介质有两类：一类是棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭等，要填充在一定的容器中定形；颗粒状活性炭等，要填充在一定的容器中定形；一类是已制成板状或管状，如石棉板和烧结材料等。一类是已制成板状或管状，如石棉板和烧结材料等。实验室常用的滤器实验室常用的滤器孔径孔径是是0.45微米和微米和0.22微米。

6、微米。3.微波灭菌法微波灭菌法主要是利用微波（主要是利用微波（300MHz3000GHz的的电磁波电磁波，是无，是无线电波中一个有限线电波中一个有限频带频带的简称，即的简称，即波长波长在在0.1毫米毫米1米米之间的电磁波）的热效应之间的电磁波）的热效应微生物在微波电磁场的作用下，吸收微波的能量，产生微生物在微波电磁场的作用下，吸收微波的能量，产生热效应，同时微波造成热效应，同时微波造成分子的加速运动分子的加速运动使细胞内部受到使细胞内部受到损害，从而导致微生物死亡。损害，从而导致微生物死亡。特点：加热均匀、热能利用率高，穿透能力强，加热时特点：加热均匀、热能利用率高，穿透能力强，加热时间短。间

7、短。主要内容主要内容一、空罐灭菌一、空罐灭菌二、灭菌有关理论二、灭菌有关理论三、分批灭菌三、分批灭菌四、连续灭菌四、连续灭菌一、空罐灭菌一、空罐灭菌1 1、目的：、目的： 1 1）消除罐内死角，确保下一批发酵的成功）消除罐内死角，确保下一批发酵的成功 2 2）杀灭与罐直接相通的各管路、阀门的微生物）杀灭与罐直接相通的各管路、阀门的微生物 3 3）杀灭上批发酵的活的微生物，减轻环境污染）杀灭上批发酵的活的微生物，减轻环境污染 2、步骤： （热蒸汽法）（热蒸汽法）1）先彻底清洗作用：a a）有利于消除死角）有利于消除死角 b b）免于料受热（尤其是干热的部位）干）免于料受热（尤其是干热的部位）干

8、焦于罐体、管或阀门焦于罐体、管或阀门2）从底部通入蒸汽3）排冷气4）升压 打开各个需灭菌的管路、放气阀等（如打开各个需灭菌的管路、放气阀等（如 接接 种管、取样管、空气进管、流量计等）种管、取样管、空气进管、流量计等）5）保压 通常通常1kg/cm1kg/cm2 2, 30, 3060min60min6) 降温 关闭各放气阀，切断汽源，慢慢放气；关闭各放气阀，切断汽源，慢慢放气； 或自然冷却，或泵循环水加速冷却或自然冷却，或泵循环水加速冷却Notes: a a）确保无死角产生）确保无死角产生 b b）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法 c c）勿激碎视镜）勿激碎视镜二、

9、培养基灭菌的有关理论二、培养基灭菌的有关理论一）加热灭菌原理一）加热灭菌原理1 1、微生物的热阻、微生物的热阻 每一种微生物都有一定的生长温度范围；每一种微生物都有一定的生长温度范围； 当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。 微生物 相对热阻细菌和酵母的营养细胞 1细菌芽孢 3106 霉菌孢子 2-10病毒及噬菌体 1-5某些微生物对湿热的

10、相对热阻（与大肠杆菌比较）不同种类微生物对热的抵抗力不同。不同种类微生物对热的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力称为微生物对热的抵抗力称为热阻（heat resistance）。下面介绍与热阻相关的几个概念1）致死温度（Death temperature）杀死微生物的极限温度称为致死温度。杀死微生物的极限温度称为致死温度。2）热力致死时间 (Thermal Death Time; TDT) 在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物所需的最短时间。所需的最短时间。e.g 伤寒杆菌伤寒杆菌58 30min 变形杆菌变形杆菌55 60min3）D值 -利用一定温度进行

11、加热利用一定温度进行加热, 90%, 90%的活菌被杀死时所的活菌被杀死时所需的时间需的时间(min)(min)即为即为D D值。又称值。又称1/101/10衰减时间。衰减时间。 DD = 10 min0 10 20 30 40 50 60加热时间加热时间 (min)10510410310210106残残 存存 活活 细细 胞胞 数数残存活细胞曲线例： 含有某种细菌的悬液，含菌数为含有某种细菌的悬液，含菌数为10105 5/ml,/ml,在在100100（212212F F）的）的水浴温度中，活菌数降低到水浴温度中，活菌数降低到10104 4/ml/ml时所需的时间为时所需的时间为10min,

12、10min,则该则该菌的菌的D D值即为值即为10min10min。 D D100100 = 10min = 10min 如果加热的温度为如果加热的温度为121121，则常写成，则常写成DrDr4）Z 值 在加热致死时间曲线中，加热时间缩短在加热致死时间曲线中，加热时间缩短90%90%所需所需升高的温度，即为升高的温度，即为Z Z值。值。100 11510010加加 热时热时 间间 （min)加热温度加热温度 （）加热致死时间曲线 ZZ = 152 2、微生物的热死规律、微生物的热死规律对数残留定律对数残留定律 微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。微生物的热死是指微生物的受热失活

13、，但物理性质不变。 微生物虽然是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于微生物虽然是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于蛋白质变性所致。蛋白质变性所致。 在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。对数残留定律的概念： 数学表达式：数学表达式：- dN/d = NN 培养基中活的微生物个数；培养基中活的微生物个数； 时间（时间（s）; 比死亡速率比死亡速率（s-1） (死亡速率常数死亡速率常数)dN/d 微生物的瞬间变化率，即死亡速率微生物的瞬间变化率，即死亡速率 对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物

14、受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。律。 若开始灭菌（ = 0）时，培养基中活的微生物数为N0 = 2.303 logN0/N /- dN/d = NlnN/N0 = - 积分积分2.303logN0/N = or = 2.303 lgN0/N /可见灭菌时间取决于污染程度可见灭菌时间取决于污染程度(N(N0 0) )、灭菌程度、灭菌程度（残留菌数（残留菌数N N）和）和 值值 在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算

15、依据一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。 灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N = N = 0 0，则，则 为为，上式无意义，事实上也不可能。，上式无意义，事实上也不可能。 一般取一般取N = 0.001N = 0.001，即，即10001000次灭菌中有次灭菌中有1 1 次失败。次失败。例： 有一发酵罐内装有一发酵罐内装40m40m3 3培养基，在培养基，在121121温度下进行实罐灭温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每菌。原污染程度为每mlml有有2 210105 5个耐热细菌芽孢，个耐热细菌芽孢， 121121时灭时灭

16、菌速度常数为菌速度常数为1.8min1.8min1 1。求灭菌失败几率为。求灭菌失败几率为0.0010.001时所需的灭时所需的灭菌时间。菌时间。解：解： N0 = 40106 2105 = 8 1012 (个个) N = 0.001; = 1.8 (min1) =2.303 lgN0N=2.3031.8lg(81015)= 20.34 (min)3 3、死亡速率常数、死亡速率常数 （比死亡速率）（比死亡速率） 死亡速率死亡速率 常数常数 是微生物耐热性的一种特征，它随是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。微生物种类和灭菌温度而异。 相同温度下，相同温度下， 值越小，则此微生

17、物越耐热。值越小，则此微生物越耐热。 在在121121，细菌芽孢的，细菌芽孢的 值约为值约为1 1minmin-1 -1, ,而营养细胞的而营养细胞的 值值为为10-1010-101010minmin-1 -1。细菌芽孢名称值 min-1枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌FS5230FS5230硬脂嗜热芽孢杆菌硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518FS1518硬脂嗜热芽孢杆菌硬脂嗜热芽孢杆菌FS617FS617产气梭状芽孢杆菌产气梭状芽孢杆菌PA3679PA36793.8-2.63.8-2.60.770.772.92.91.81.8121某些细菌芽孢的值4、培养基灭菌温度的选择 培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外

18、，还伴随着培养基培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。 培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。基成分破坏减至最少的条件。 灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残留定律表达式可知）。留定律表达式可知）。 在其它条件不变时，比死亡速率在其它条件不变时，比死亡速率 与温度的关系可用阿仑尼与温度的关系可用阿仑尼乌斯方程式表示。乌斯方程式表示。Svante

19、August Arrhenius was a Swedish physical chemist best known was a Swedish physical chemist best known for his theory that electrolytes, certain for his theory that electrolytes, certain substances that dissolve in water to yield a substances that dissolve in water to yield a solution that conducts el

20、ectricity, are solution that conducts electricity, are separated, or dissociated, into electrically separated, or dissociated, into electrically charged particles, or ions, even when there is charged particles, or ions, even when there is no current flowing through the solution. In no current flowin

21、g through the solution. In 1903 he was awarded the Nobel Prize for 1903 he was awarded the Nobel Prize for Chemistry.Chemistry. = A eR TEArrhenius equationA A 比例常数；比例常数；E E 杀死细菌所需的活化能，杀死细菌所需的活化能，( ( E)E) （4.18 J/mol4.18 J/mol）; ;T T 绝对温度，绝对温度，(K)(K)R R 气体常数，气体常数，1.9781.9784.18 J/(molK)4.18 J/(molK)e

22、 2.71 (exp)e 2.71 (exp) = A eR TElg = + lgAE2.303RT以以lg lg 对对1/T1/T作图，得一直线，其斜率为作图，得一直线，其斜率为-E/2.303R-E/2.303R，截距为，截距为lgAlgA，从斜率和截距科求得从斜率和截距科求得A A和和E E值。值。1/Tlg 截距 = lgA斜率 = E/2.303R培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：- dC / d = CC 对热不稳定物质的浓度, (mol/L); 分解速率常数 （s1）； 分解反应时间 （s） 随反应物质种类和

23、温度不同随反应物质种类和温度不同在化学反应中，其他条件不变，在化学反应中，其他条件不变， 和温度的关系也可用和温度的关系也可用阿阿仑尼乌斯方程表示：仑尼乌斯方程表示： = A eR TEA A 比例常数；比例常数；E E 分解活化能，分解活化能，( ( E) E) （4.18 J/mol4.18 J/mol）; ;T T 绝对温度，绝对温度，(K)(K)R R 气体常数，气体常数，1.9781.9784.18 J/(molK)4.18 J/(molK)e 2.71 (exp)e 2.71 (exp) 1= A eR T1E 2= A eER T2相除取对数相除取对数ln 2 1= E 1 1R

24、 T1 T2 在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数 和培养基成分破坏速率常数和培养基成分破坏速率常数 都变化。都变化。温度由温度由T T1 1升高到升高到T T2 2， 值分别为：值分别为：同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：ln 2 1 = R T1 T2E 1 1ln( 2 / 1)ln( 2 / 1)EE上面两式相除，得上面两式相除，得由于灭菌的E大于培养基成分分解的E名称E (J/mol)叶酸叶酸泛酸泛酸维生素维生素B12B12维生素维生素B1B1嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌枯草杆菌肉毒

25、梭菌肉毒梭菌70.370.387.987.996.796.792.192.1283283318318343343因此ln 2/ 1ln 2/ 1 即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。 根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时间的方法，有利于减少营养成分的破坏。 灭菌温度/ 灭菌时间/min 维生素B1破坏量/%100 400 99.3110 36 6

26、7115 15 50120 4 27130 0.5 8145 0.08 2150 0.01 1二）影响培养基灭菌的主要因素二）影响培养基灭菌的主要因素1、微生物热阻 （前述）2、pH 微生物在微生物在pH6.0pH6.08.08.0范围内耐热性最大范围内耐热性最大 pHpH低于低于6.06.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，则所需的杀菌时间愈短。则所需的杀菌时间愈短。影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued） 温度 孢子数 灭菌时

27、间 (min) () (个/ml) pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13110 10000 70 65 35 30 24100 10000 740 720 180 150 150 pH对灭菌时间的影响影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued）3、菌的浓度浓度越高，所需灭菌时间越长浓度越高，所需灭菌时间越长例如： 如肉毒梭状芽孢杆菌，在105湿热灭菌时间 芽孢杆菌数芽孢杆菌数/ml /ml 时间时间 (min)(min) 9 910108 8 48 9 910106 6

28、36 9 910104 4 20 9 910102 2 14 9 9 2影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued）4、 培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性 因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的传入。传入。 而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued）5、泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物；中潜伏的微生物； 易产生泡沫的培养基在灭菌

29、时，可加入少量消泡剂。易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。6、颗粒 颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued）三、分批灭菌三、分批灭菌（实罐灭菌）一）操作1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的 分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。 若已先行空罐灭菌，此步可不进行若已先行空罐灭菌，此步可不进行2、 预热向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至7070左右。左右。作用： 利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音有

30、的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量，确保培养基的浓度。3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。4、罐压达1kg/cm2 ( 0.1 MPa)时，安装在发酵罐封 头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。升升 温温 阶阶 段段5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度 保持在一稳定水平，维持一定时间。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保保 温温 阶阶 段段6、保温结束后，依次关闭各排汽

31、、进汽阀；待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压降降 温温 阶阶 段段ABCD升温 保温 降温小型罐升降温小型罐升降温快，可忽略；快，可忽略；但大型罐不可但大型罐不可忽视忽视min二）二） 灭菌时间的计算灭菌时间的计算V = V加热 + V维持 + V冷却 RT2 (E 2RT)V 加热加热 = t 加热加热 (T-T0)E2 RT2 (E 2RT)V 冷却冷却 = t 冷却冷却 (T-T0)E2R R ：气体常数；：气体常数；= 1. 986

32、 = 1. 986 卡卡/ /克分子克分子KKE E ：耐热孢子致死的活化能；：耐热孢子致死的活化能；= 65000 = 65000 卡卡/ /克分子克分子 T T：灭菌维持温度；：灭菌维持温度； 121 121 （393 K393 K）T T0 0：开始计算灭菌效果的温度；：开始计算灭菌效果的温度；100 100 （373 K373 K）例：1 1）小型发酵罐在）小型发酵罐在120120灭菌维持灭菌维持1515分钟，由分钟，由100 100 （100100以以下灭菌效果不计）加热至下灭菌效果不计）加热至120120的时间为的时间为5 5分钟，由分钟，由120120冷却冷却到到100100的时

33、间为的时间为3 3分钟，计算总的灭菌时间。分钟，计算总的灭菌时间。 1.9863932(65000 21.986 393)V加热加热 = 5 = 1.15 (393-373) 650002 1.9863932(65000 21.986 393)V冷却冷却 = 5 = 0. 69 (393-373) 650002V = V加热 + V维持 + V冷却 = 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min) 例 ）如果灭菌条件不变，大罐由如果灭菌条件不变，大罐由加热到加热到需分钟；冷却至需分钟；冷却至的时间为的时间为.6分钟；求大分钟；求大罐的维持时间罐的维持时间。 1.9863932(6

34、5000 1.986 393)V加热加热 V冷却冷却 = （ ） (393-373) 650002.min则大罐维持时间V维持 = V（V加热V冷却）16.6 9.2 = 7.4 min在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间发酵罐规模（升） 维持时间（分） 200 17. 5 500 12. 6 5000 11. 3 50000 8. 8三）分批灭菌的优缺点优点：不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单、灭菌效果可靠。不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单、灭菌效果可靠。对蒸汽的要求较低，一般对蒸汽的要求较低，一般3-4kg/cm3-4kg/cm2 2即可满足。即可满足。缺点：在灭菌过程中蒸汽

35、用量变化大，造成锅炉负荷波动大在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大中小型罐经常采用四、培养基的连续灭菌四、培养基的连续灭菌 （连消） 将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌。 温度 （） 时间 （min) 121 24.8 130 4.1 138 0.72 146 0.14 154 0.029 163 0.0061灭菌时间与温度的关系（以杀死细菌芽孢为准）一）连续灭菌流程1 配料罐 3 连消装置 4 维持罐 6 冷却装置 配料罐（兼作预热） 输料泵 连消塔（器）维持罐（管） 冷却器 发酵罐连续灭菌流程1 1、预热、预热可在专门的预热罐，也可用配料罐兼作温度：一

36、般预热至一般预热至7070左右左右预热的物料用泵泵入连消装置预热的物料用泵泵入连消装置输料泵： 常用常用 旋涡泵、往复泵、螺杆泵旋涡泵、往复泵、螺杆泵旋涡泵往复泵螺杆泵2 2、加热、加热常用连消装置有三类： 套管式连消器套管式连消器 汽液混合式连消器汽液混合式连消器 喷射式加热器喷射式加热器物料泵入加热器，培养基与蒸汽混合，温度迅速上升至130140套管式连消塔上疏下密，上疏下密，4545小孔，孔小孔，孔径径6 6毫米左右毫米左右培养液流动线速度小于培养液流动线速度小于0.1m/s ; 0.1m/s ; 在管内逗留时间在管内逗留时间为为15152020秒秒 汽液混合式连消器1 1 喷嘴喷嘴 2

37、 2 吸入口吸入口 3 3 吸入室吸入室 4 4混合喷嘴混合喷嘴 5 5 混合段混合段 6 6扩大管扩大管喷射加热器3 3、保温、保温保温设备保温设备 （维持设备）（维持设备） 保温材料包裹保温材料包裹 两种形式： 罐式；管式罐式；管式 1、维持罐连续灭菌时，关连续灭菌时，关2 2开开1 1；预热罐中的物料输送完后，预热罐中的物料输送完后，关关1 1开开2 2。培养基的平均停留时间 = V / FM-平均停留时间平均停留时间 （s s）V- V- 维持罐的体积维持罐的体积 （ m m3 3）FM - FM - 培养基的流量培养基的流量 （m m3 3/s/s）Note: 培养基在维持罐的流动不

38、可能非常均匀，可能产生沟流，培养基在维持罐的流动不可能非常均匀，可能产生沟流，造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值。为保证造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值。为保证灭菌彻底，在设计罐式维持器时，通常取平均停留时间的灭菌彻底，在设计罐式维持器时，通常取平均停留时间的3 35 5倍。倍。经验： 在灭菌温度为在灭菌温度为130130时，实际平均时间可取时，实际平均时间可取1010分钟；在分钟；在140140时则可取时则可取3 34 4分钟。分钟。2、管式维持器在设计管式维持设备时，须采用在设计管式维持设备时，须采用停留时间分布的概念，的概念，而不能采用单纯的停留时间。而不能采用单纯的停

39、留时间。圆管内不同流动形式流体的速度分布情况 湍流 Vaverage = 0.82 Vmax 活塞流 V Vaverageaverage = V = Vmaxmax 粘滞流 Vaverage = 0.5 Vmax 在管式维持器中，若培养基流动为活塞流，可根据维持管在管式维持器中，若培养基流动为活塞流，可根据维持管的内径、培养基的流量求出管长。的内径、培养基的流量求出管长。 但实际上培养基不可能呈活塞流，当培养基处于粘滞留状但实际上培养基不可能呈活塞流，当培养基处于粘滞留状态时，管内速度呈抛物线，管中心部位的最大流速为平均流速态时，管内速度呈抛物线，管中心部位的最大流速为平均流速的的2 2倍；若

40、以平均流速确定管长，则会造成边缘部分的培养基倍；若以平均流速确定管长，则会造成边缘部分的培养基过热（加热过长）。过热（加热过长）。 确定维持管的长度，应采用确定维持管的长度，应采用扩散模型 ( Dispersion model) . . （复杂，略）（复杂，略）4、冷却喷淋冷却器喷淋冷却器板式冷却器板式冷却器真空冷却器真空冷却器喷淋冷却器结构简单；广泛使用结构简单；广泛使用板式换热器体积小，换热效率高；但流动阻力较大体积小，换热效率高；但流动阻力较大板式换热器板式换热器板式换热器原理图喷射加热-真空冷却连续灭菌系统二）二） 连续灭菌的优缺点及注意事项连续灭菌的优缺点及注意事项1 1）可采用高温

41、短时灭菌，培养基受热时间短，营养）可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；成分破坏少，有利于提高发酵产率；2 2）蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。）蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。3 3）适于自动控制，降低劳动强度。）适于自动控制，降低劳动强度。缺点： 设备复杂，投资大设备复杂，投资大优点：连消注意事项：1 1）连消前，应先进行空罐、维持罐（管）、冷却系统的灭菌；）连消前，应先进行空罐、维持罐（管）、冷却系统的灭菌；2 2）确保管路无渗漏；）确保管路无渗漏；3 3）当培养基含有较大固体颗粒或有较多泡沫时，采用连消容易）当培养基含有较大固体颗粒或有较

42、多泡沫时，采用连消容易发生灭菌不彻底。发生灭菌不彻底。思考题：思考题：1.为什么培养基灭菌（湿热灭菌）一般采用为什么培养基灭菌（湿热灭菌）一般采用高温短时灭菌？高温短时灭菌？2.培养基连续灭菌的设备有哪些？（按安装培养基连续灭菌的设备有哪些？（按安装顺序）顺序）二二 发酵设备发酵设备发酵设备是微生物工程中最重要的设备之一，一个优良发酵设备是微生物工程中最重要的设备之一，一个优良的培养设备应该具备的条件：的培养设备应该具备的条件：1.严密的结构严密的结构2.良好的液体混合性能良好的液体混合性能3.高的传质和传热速率高的传质和传热速率4.可靠的检测及控制仪表可靠的检测及控制仪表发酵罐的分类：厌氧发

43、酵罐和好氧发发酵罐的分类：厌氧发酵罐和好氧发酵罐酵罐好氧发酵罐分为通风和搅拌式好氧发酵罐分为通风和搅拌式按能量输入方式可分为三类：按能量输入方式可分为三类：1.内部机械搅拌型发酵罐内部机械搅拌型发酵罐2.外部液体搅拌型发酵罐外部液体搅拌型发酵罐3.空气喷射提升式发酵罐空气喷射提升式发酵罐1.机械搅拌发酵罐机械搅拌发酵罐利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合。利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合。满足的要求：满足的要求：1.适宜的高径比适宜的高径比2.能承受一定压力能承受一定压力3.通风装置能使气液充分混合通风装置能使气液充分混合4.足够的冷却面积足够的冷却面积5.少死角少死角6.轴封严密轴封严密发酵罐的结构：发酵罐的结构：1.罐身：受压容