southern杂交和测序

1、1. Southern blotting, for detecting DNA ;2. Northern blotting, for detecting RNA;3. Western blotting, for detecting protein.Southern and Northern blottingBlot typeTargetProbeApplicationsSouthern DNA DNA or RNAmapping genomic clonesestimating gene numbersNorthernRNADNA or RNARNA sizes, abundance,and

2、expressionWesternProteinAntibodiesprotein size, abundanceSouthern and Northern blottingDNA on blotRNA on blot1.Genomic DNA preparation RNA preparation2.Restriction digestion-3.Denature with alkaliby formamide4. Agarose gel electrophoresis 5. DNA blotting/transfer and fixation RNA6. Probe labeling 7.

3、 Hybridization (temperature) 8. Signal detection (X-ray film or antibody) Southern blotting1.Genomic DNA preparation2.Restriction digestion3.Denature with alkali4.Agarose gel electrophoresis 5.DNA blotting/ transfer and fixation6.Probe labeling 7.Hybridization (temperature) 8.Signal detection (X-ray

4、 film or antibody)Stringency (严厉度，紧张性严厉度，紧张性): Determined by hybridization temperature and salt concentration in the hybridization buffer. High temperature and low salt is more stringent as only perfectly matched hybrids remain stable.Formamide （甲酰胺，甲酰胺，50）in hybridization buffer reduce the actual h

5、ybridization temperature by 25C (from 68C to 43C )Washing temperature: 12C below theoretical melting temperature (理论熔解温度，理论熔解温度，Tm)Tm = 69.3C + 0.41 (G+C) % 650/L, where L is the length of probe moleculeNorthern blotting for detecting:Length of mRNAWhether a genomic clone has regions that are transc

6、ribed 基基因组克隆是否含有转录区因组克隆是否含有转录区Differential expression in tissues and cellsZoo blots (多物种印迹）多物种印迹）: blots with DNA/RNA samples from different organisms for detecting conserved genes between species（不同生物体的印迹检测种间保守（不同生物体的印迹检测种间保守基因）基因）.NCBI的另一个网站，EntrezOMIM:人类孟德尔遗传在线人类孟德尔遗传在线Books :在线图书在线图书Taxonomy, Ge

7、nBank中收录生物的分类中收录生物的分类Structure ：大分子三：大分子三维结构数据库维结构数据库PubMed,生物医学文献，包括生物医学文献，包括植物分子生物学文献，但不包植物分子生物学文献，但不包括传统植物文献括传统植物文献 NCBI的另一个网站，Entrez (http:/www.ncbi. /Entrez/)把文献检索、基因数据、应用软件、生物分类、相关图书等资源都整合到了一起，应用起来非常方便，所以如果要到GenBank，最好通过Entrez。 Entrez网站包括以下主要内容（均可网站包括以下主要内容（均可点击链接）：点击链接）：(1)PubMed,生

8、物医学文献，包括植物生物医学文献，包括植物分子生物学文献，但不包括传统植物分子生物学文献，但不包括传统植物文献；文献；(2)Books ，在线图书；，在线图书；(3)OMIM，人类孟德尔遗传在线网，人类孟德尔遗传在线网（online mendelian inheritance in man）,主要用于医学；主要用于医学；(4)GenBank，核苷酸序列数据库；，核苷酸序列数据库；(5)Protein sequence database, 蛋白质蛋白质序列数据库；序列数据库；(6)CDD，保守结构域数据。，保守结构域数据。(7) 3D Domains，来自，来自Entrez Structure结

9、构域数据；结构域数据；(8)UniSTS,标记和作图数据；标记和作图数据；(9) PopSet ，群体研究数据组合，群体研究数据组合(10) Genome ，完全组装后的基因组，完全组装后的基因组序列；序列；(11) Structure ，大分子三维结构数据，大分子三维结构数据库；库； (12) Taxonomy, GenBank中收录生物中收录生物的分类；的分类；(13)SNP，单核苷酸多态性，单核苷酸多态性。 点击Entrez“Genome”，就可以进入到基因组数据库，既可以寻找任何生物的基因组，又可以到各类生物群体中去浏览，如:微生物基因组；细胞器基因组；植物基因组中心；病毒基因组等等。

10、 还有用于基因组研究的主要计算机软件：TaxPlot(基因组相似性比较)；COGs（clusters of orthologous groups of protein,正源蛋白质类聚)；BLAST（寻找同源序列）。 点击点击“Plant genomes Central” ，就会进入如下几大，就会进入如下几大类：类：Genome projects in progress (正在进行的基因组计划正在进行的基因组计划)； Plant-oriented resources at NCBI （NCBI与植物有关的资与植物有关的资源）；源）； Large-scale sequencing projects

11、（大规模序列分析项（大规模序列分析项目）；目）；Genetic maps（遗传图谱）；（遗传图谱）； Large-scale EST sequencing projects（大规模（大规模EST序列分析序列分析项目）。项目）。 点击点击“Large-scale sequencing projects”中的中的“Arabidopsis thaliana” (拟南芥拟南芥)，就会被链接到一，就会被链接到一个含有拟南芥基因组个含有拟南芥基因组5条染色体及线粒体和叶绿体图条染色体及线粒体和叶绿体图像的界面。像的界面。基因组基因组5条染色体（条染色体（ I 、II、III、IV、V）；）；叶绿体（叶绿体

12、（CHL） ；线粒体（线粒体（MT）；）； 还可以将任何基因序列与拟南芥基因组比较还可以将任何基因序列与拟南芥基因组比较（点击右上角的（点击右上角的“BLAST search Arabidopsis genome”）。）。 如果点击染色体如果点击染色体I，就会看到，就会看到拟南芥第一条染色体的整体图：拟南芥第一条染色体的整体图：克隆、基因的分布；克隆、基因的分布；基因序列（蛋白质、基因序列（蛋白质、mRNA）的链接；的链接；基因产物结构与功能的分析鉴基因产物结构与功能的分析鉴定资料链接（定资料链接（TIGR MIPS TAIR，拟南芥的三大数据库）；，拟南芥的三大数据库）；该基因的描述：该基因的描述：s