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文档简介

1、目的基因的克隆与分离鉴定(2)6 目的基因的克隆与分离鉴定目的基因的克隆与分离鉴定目的基因的克隆目的基因的克隆目的基因的分离鉴定目的基因的分离鉴定v一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:另一类是利用另一类是利用PCR扩增技术甚至扩增技术甚至化学合成法化学合成法体外直接合体外直接合成目的基因,然后将之克隆表达。成目的基因,然后将之克隆表达。一类是构建感兴趣的生物个体的一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库,基因文库,即将某生物即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建立合适的筛选模型从基体的全基因组分段克隆,然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因

2、的重组克隆;因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;第一节 目的基因的克隆C PCR法法B cDNA法法A 鸟枪法鸟枪法D 化学合成法化学合成法E 基因文库的构建基因文库的构建一、一、 鸟枪法鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性(一)鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法(shot-gun approach):随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段,然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。1.染色体DNA的切断 超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端; 全酶切:片段长度

3、不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控; 部分酶切:片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整。 2.2.与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝筛选,则选择多拷贝克隆载体;克隆载体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表表达型载体;达型载体;3.3.转化受体细胞转化受体细胞 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能 使目的基因表达的受体细胞;使目的基因表达的受体细胞;4.筛选含有

4、目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的 建立)建立) 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选,则选择大肠杆菌作为的受体细胞。筛选,则选择大肠杆菌作为的受体细胞。问题问题鸟枪法获得的克隆群体庞大鸟枪法获得的克隆群体庞大以人的基因组为例,如果载体承受外源以人的基因组为例,如果载体承受外源DNADNA片段片段的能力为的能力为1-3kb1-3kb;那么;那么, ,人类基因组人类基因组DNADNA需被切割成需被切割成几十万个大小不等的片段;几

5、十万个大小不等的片段;每个片段都分别插入到一个载体分子上,这样就每个片段都分别插入到一个载体分子上,这样就会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体;会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体;要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因的克隆,显然是非常费事的。的克隆,显然是非常费事的。(二) 鸟枪法操作的改进如果已知目的基因两端的酶切位点,可用该酶处理染色体DNA,然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高重组子中目的重组子的出现频率。 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。例如

6、,已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中,将染色体DNA用SalI切开,琼脂糖凝胶电泳分离;在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块,从此凝胶块中回收DNA片段,然后与载体进行拼接。v凝胶DNA片段回收技术 冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法v凝胶凝胶DNA片段片段回收程序回收程序 1.1.切胶回收于离心管中;切胶回收于离心管中; 2.2.加入等体积的加入等体积的溶液溶液I I; 3.50-603.50-60水浴加热约水浴加热约1010分钟至胶融分钟至胶融解解; 4.4.加入到加入到DNADNA纯

7、化柱内,室温放置纯化柱内,室温放置1 1分钟分钟; 5 5. .离心离心1 1分钟,倒弃收集管内的液体分钟,倒弃收集管内的液体; 6 6. .加入加入700700微升微升溶液溶液IIII,室温放置室温放置1 1分钟分钟; 7 7. .离心离心1 1分钟,洗去杂质分钟,洗去杂质; 8 8. .加入加入500500微升微升溶液溶液IIII,最高速离心最高速离心1 1分钟分钟; 9 9. .将将DNADNA纯化柱置于纯化柱置于1.51.5mlml离心管上,加入离心管上,加入3030ulul溶液溶液IIIIII至管内柱面上,放置至管内柱面上,放置1 1分钟分钟; 1010. .高速离心高速离心1 1分

8、钟,所得液体即为高纯度分钟,所得液体即为高纯度DNADNA。(三)鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大,需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构二、cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法克隆目的基因的局限性(一) cDNA法克隆目的基因的基本战略mRNA1.cDNA第一链的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTp55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTp5cDN

9、A第一链引物退火逆转录酶dNTPs2.cDNA第二链的合成 煮沸NaOH自身引导法:获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp 5DNApol dNTPsRNaesH置换合成法:获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAA OH3TTTTTTTTTTTTTT p5S15 AAAA

10、AAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 53T4-DNA ligase5AAAAAAAAAAAAAAp 3TTTTTTTTTTTTTTOH 55AAAAAAAAAAAAAA 3TTTTTTTTTTTTTT 5dCTPTdT引导合成法:获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列5ppp5G G AAAAAOH3TTTTTp53HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH33 HOCCCCCCCTTTTTp53 HOCCCCCCCTTTTTp55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp55 pGGGGGGGAAAAAOH3NaOH退火KlenowdNTPs3.双链cDNA的克

11、隆 双链平头的cDNA与载体的连接: 平头末端直接与载体连接,但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾,最好是AT同聚物尾,这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口,以便插入片段回收 (二) cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少,对酶和碱极为敏感,分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因 三 PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提条件是:已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。(一)PCR法定向扩增目的基因的基本原理PC

12、R(Polymerase Chain Reaction)法,又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,是一种高效快速的体外DNA聚合程序。55目的基因变性加热55引物退火55底物聚合5加热变性5555555555555555555555555555退火 引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合1235 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中,其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基,而且这个碱基几乎总是A,因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在,克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接,也可以使用专门的T载体克隆。 (二) PCR克隆目的基因的基本程序5

13、5AATT55PCR扩增产物T 载体T7lacZ MCSoriApr四 化学合成法化学合成法的基本战略化学合成的单元操作DNA化学合成的用途一、化学合成一、化学合成DNADNA的发展的发展二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法磷酸二酯法磷酸二酯法磷酸三酯法磷酸三酯法亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法固相合成法固相合成法自动化法自动化法三、化学合成三、化学合成DNADNA(寡核苷酸)的应用寡核苷酸)的应用v作为合成基因的元件作为合成基因的元件v作为测序的引物作为测序的引物v作为核酸分析杂交的探针作为核酸分析杂交的探针v用于基因定点诱变研究用于基因定点诱变研究v作为作为PCRP

14、CR反应的引物反应的引物v作为重组作为重组DNADNA连接等的构件连接等的构件(一)化学合成法的基本战略全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知,有三种战略:1.小片段粘接法: 混合退火根据目的基因全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接连接入合适的载体 2.补钉延长法: 混合退火根据目的基因两条互补链全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合3.大片段酶促法: 混合退火根据目的基因的全序列,分别合成40-50碱基长的单链DNA片段T4-DN

15、A连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合(二)化学合成的单元操作v化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去,每接一个单体就是一个循环反应,包括:基团保护、缩合、氧化、去保护等步骤;v从反应机理上来讲,DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法;具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式;v前者操作繁琐,基本上已淘汰;后者反应中间物的分离程序简便,DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT: 二

16、甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂OHGHHHHOCH2ODMTPOMeOHAHHHHOCH2OO(三) DNA化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。 全基因合成的问题上述三种方法各有利弊:化学合成DNA的单片段愈短,收率就愈高,但由于化学合成的份额较大,成本较高;在大片段酶促法合成目的基因时,虽然化学合成的份额相对较小,成本较低,但大片段化学合成的收率极低,例如,每聚合一个单体的产物收率为95%,则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总

17、收率只有7.7%第一节 目的基因的克隆三、三、PCR法法二、二、cDNA法法一、鸟枪法一、鸟枪法四、化学合成法四、化学合成法五、基因文库的构建五、基因文库的构建五、基因(组)文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序(一一) 基因文库的基本概念基因文库的基本概念v基因库与基因文库基因库(gene pool)特定生物体全基因组的集合(天然存在) 基因文库(gene library or gene bank)将特定生物个体的全部DNA片段连接入载体DNA分子上,并导入受体细菌或细胞中,经扩增产生的包含该生物全部基因组序列的克隆群体。(人工构建)基因组文库(含有全部基因) cDNA文库(含有特定

18、时期或组织中蛋白质编码基因) 根据构建方法的不同,基因文库分为: v基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体DNA。用cDNA法构建cDNA文库,材料来自mRNA。v 在高度分化的生物体中,不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同(即基因的表达谱不同),因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定,如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然, cDNA文库的信息量远小于基因组文库。1.重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力;2.载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利克隆排序;4.克隆片段

19、易于从载体分子上完整卸下;5.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;6.具有较高的完备性。v基因文库的质量标准基因文库的完备性是指:在构建的基因文库中任一基因存在的概率,它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示:N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中: P = 任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率f = 克隆片段的平均大小/生物基因组的大小 基因文库的完备性F例如,人的单倍体例如,人的单倍体DNADNA总长为总长为2.92.9x10 x109 9bpbp,基因文库中基因文库中克隆片段的平均大小为克隆片段的平均大小为1515kb,kb,则构建一个完备性为则构建一个完

20、备性为0.90.9的基因文库至少需要的基因文库至少需要4545万万个克隆;个克隆;F而当完备性提高到而当完备性提高到0.99990.9999时时, ,基因文库至少需要基因文库至少需要180180万万个克隆。个克隆。(二)基因文库的构建程序(二)基因文库的构建程序1.基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性, 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂;AAAA制备的DNA分子量越大,经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低,重组率和完备性也就越高。2. 基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理 和限制性内切

21、酶部分酶切两种方法,其目的是: 第一,保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二,保证DNA片段大小均一超声波处理后的DNA片段呈平头末端,需加装人工接头;部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶,如:Sau3A I或Mbo I等,这样DNA酶解片段的大小可控;连接前,上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离,以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体!3. 载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量,用于基因组文库构建的载体通常 选装载量较大的-DNA或考斯质粒;对于大型基因组(如动、植物和人类)需使用YAC或BAC载体;由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb,因此用于cDNA

22、文库构建的载体通常选质粒。-DNA上述几种载体的最大装载量如下:上述几种载体的最大装载量如下:质粒质粒考斯质粒考斯质粒15 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kbv用于基因文库构建的受体则根据载体使用用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌大肠杆菌或或酵母菌酵母菌4. 基因文库构建的技术性问题v在基因组文库的构建过程中,最应引起重视的问题是:避免外源DNA片段之间的连接!v为了避免上述情况的发生,可采取下列措施的组合: 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 第二节第二节

23、基因的分离基因的分离一、基于基因功能的基因分离技术一、基于基因功能的基因分离技术二、基于二、基于DNA插入作用的基因分离技术插入作用的基因分离技术三、基于基因图谱的基因分离技术三、基于基因图谱的基因分离技术一、基于基因功能的基因分离技术一、基于基因功能的基因分离技术1、已知目的基因的氨基酸序列、已知目的基因的氨基酸序列2、根据基因的同源性分离目的基因、根据基因的同源性分离目的基因3、根据、根据mRNA的特异性分离目的基因的特异性分离目的基因1 1、已知目的基因的氨基酸序列、已知目的基因的氨基酸序列(功能克隆)(功能克隆)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,根据某些蛋白将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,根

24、据某些蛋白质的氨基酸保守性合成寡核苷酸探针从质的氨基酸保守性合成寡核苷酸探针从cDNAcDNA库或基库或基因组文库中筛选编码基因;因组文库中筛选编码基因;将相应的编码蛋白制成相应抗体探针将相应的编码蛋白制成相应抗体探针, ,从从cDNAcDNA载载体表达库中筛选相应克隆。体表达库中筛选相应克隆。根据某些蛋白质的氨基酸保守性设计特异引物,根据某些蛋白质的氨基酸保守性设计特异引物,PCRPCR扩增出目的基因;扩增出目的基因;v某段连续氨基酸序列的简并探针的序列设计Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGT ATG GAC GAA ATG AAA AGA AAC A

25、TA C T G G G T TCTGTATGGACGAAATGAA此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计总探针类型:总探针类型:2222=16密集铺板(1-10万)杂交挖取铺板铺板目的重组克隆v文库筛选 氨基酸序列氨基酸序列核苷酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质特异蛋白质 目的基因目的基因 抗体抗体 基因文库筛选基因文库筛选评价评价优点优点 - 在单基因性状的基因分离方面仍为在单基因性状的基因分离方面仍为常用常用策略策略缺点缺点 - 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难* - 难以分离微量表达基因难以分离微量表达基因 - 无法研究无无法研究无蛋

26、白质蛋白质产物的基因产物的基因 - 难以进行多基因控制性状的基因分离难以进行多基因控制性状的基因分离根据近缘物种间或进化关系较近的物种间功根据近缘物种间或进化关系较近的物种间功能相关的基因间核苷酸序列的保守性,设计能相关的基因间核苷酸序列的保守性,设计探针,从基因文库中筛选并鉴定目的基因。探针,从基因文库中筛选并鉴定目的基因。2 2、根据基因的同源性分离目的基因、根据基因的同源性分离目的基因v文库筛选法文库筛选法保守序列保守序列保守序列保守序列F5个个MYB转录因子基因的比对结果转录因子基因的比对结果A. cDNA的合成的合成vcDNAcDNA末端快速扩增末端快速扩增(rapid amplif

27、ication of cDNA ends, RACE) 以以mRNA为模板,用依赖于为模板,用依赖于RNA的的DNA聚合聚合酶酶(反转录酶反转录酶)来催化合成来催化合成cDNA。目前商品化反。目前商品化反转录酶有禽类成髓细胞病毒转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和逆转录酶和鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。反转录酶。B. 同源片段的克隆同源片段的克隆简并引物的设计简并引物的设计利用利用DNAman、DNAstar等软件对等软件对GENbank中已公中已公布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列进行同布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列进行同源分析,然后,根据基因的保守区设

28、计合成一对简并源分析,然后,根据基因的保守区设计合成一对简并引物。引物。简并引物简并引物:是指编码单个氨基酸的所有不同碱基可能是指编码单个氨基酸的所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。性的不同序列的混合物。v为了增加特异性为了增加特异性,可以参考密码子使用表可以参考密码子使用表,根据不同生根据不同生物的碱基使用偏好物的碱基使用偏好,减少简并性。减少简并性。Gene1:TTC TAT CAC GAG TGC TGGPhe Tyr His Glu Cys TrpTTT TAT CAT GAA TGT TGGGene2:Degenerate Primer: 5-TT(T/C) TAT CA(T/C)

29、 GA(A/G) TG(T/C) TGG-3氨基酸序列氨基酸序列: :为了增加特异性为了增加特异性,可以参考密码子使用表可以参考密码子使用表,根据不根据不同生物的碱基使用偏好同生物的碱基使用偏好,减少简并性。减少简并性。简并简并PCR扩增同源片段扩增同源片段琼脂糖凝胶电泳对琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定;用洁净的刀产物进行鉴定;用洁净的刀片在长紫外灯下切下含有目的片在长紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶,片段的琼脂糖凝胶,放入放入1.5ml的微量离心管中;的微量离心管中;PCR产物回收试剂盒回收产物回收试剂盒回收目的片段。目的片段。将回收的将回收的PCR产物连接至产物连接至pMD1

30、8-T载体上,转化大载体上,转化大肠杆菌感受态,克隆目的片段,并测序鉴定。肠杆菌感受态,克隆目的片段,并测序鉴定。C. cDNA 3末端序列的克隆末端序列的克隆3RACE引物的设计引物的设计 根据已获得的基因的同源片段,设计基因特异的根据已获得的基因的同源片段,设计基因特异的巢式引物巢式引物(nested PCR primer)。GSP1和和GSP2,巢式,巢式PCR扩增扩增cDNA 3末端序列末端序列。RNA的提取及的提取及cDNA的合成的合成方法同前,但反转录引物不同方法同前,但反转录引物不同(带有接头序列带有接头序列):QT: 5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCA

31、TGACAGTG(T)18-3可利用此接头序列设计两条接头引物可利用此接头序列设计两条接头引物Q1和和Q2。Q1Q2巢式巢式PCR扩增扩增3-端端cDNA以以QT引物反转录获得引物反转录获得cDNA为模板,分别用基因为模板,分别用基因特异引物特异引物GSP1与通用引物与通用引物Q1进行第一轮进行第一轮PCR;将第一轮将第一轮PCR产物稀释产物稀释100倍作为模板,分别用基倍作为模板,分别用基因特异引物因特异引物GSP2与通用引物与通用引物Q2进行第二轮巢式进行第二轮巢式PCR;0.8%的琼脂糖凝胶电泳,回收的琼脂糖凝胶电泳,回收PCR产物并连接至产物并连接至T载体,转化大肠杆菌载体,转化大肠杆

32、菌DH-5,利用,利用-互补及菌落互补及菌落PCR筛选阳性克隆,并送测序公司测序。筛选阳性克隆,并送测序公司测序。图 ZmABC1-10 基因全长cDNA克隆D. cDNA 5末端序列的克隆末端序列的克隆5RACE引物的设计引物的设计根据已获得的基因的同源片段,设计基因特异的巢式根据已获得的基因的同源片段,设计基因特异的巢式引物(引物(nested PCR primer)。)。GSP1和和GSP2,巢式,巢式PCR扩增扩增cDNA 5末端序列。末端序列。1)TaKaRa公司公司RACE原理原理添加接头序列添加接头序列以以RNaseH分解掉分解掉cDNA-RNA杂交体中杂交体中RNA;利用一利用

33、一5端磷酸化的特异性引物对端磷酸化的特异性引物对mRNA进行反进行反转录形成转录形成5端磷酸化的端磷酸化的cDNA第一链;第一链;在在T4RNA连接酶的作用下将单链连接酶的作用下将单链cDNA环化或首环化或首尾相连;尾相连;用两对基因特异性引物:用两对基因特异性引物:A1、S1及及A2、S2分别分别进行二次进行二次PCR扩增得到所需目的片段扩增得到所需目的片段2) Clontech公司的公司的SMART 5 -RACE的原理的原理以以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶作为锁定引物在反转录酶M-MLV作用下,反转录合成标准第一链作用下,反转录合成标准第一链cDNA;利用该反转录酶具

34、有的末端转移酶活性,在反利用该反转录酶具有的末端转移酶活性,在反转录达到第一链的转录达到第一链的3末端时自动加上末端时自动加上3-5个个(dC)残残基,退火后基,退火后(dC)残基与含有残基与含有SMART寡核苷酸序寡核苷酸序列列Oliogo(dG)通用接头引物通用接头引物配对后,转换为以配对后,转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头序列为模板继续延伸而连上通用接头;然后用一个含有部分接头序列的通用引物然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(Universal Primer)作为上游引物,用一)作为上游引物,用一个基因特异引物(个基因特异引物(Gene Specific Pri

35、mer,GSP)作为下游引物,作为下游引物,PCR扩增目的基因扩增目的基因5末端的末端的cDNA片段片段3)Invitrogen的的 GeneRACER 5 -RACE的原理的原理5 mRNA CAP3 Poly A tailFull-length mRNAm7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAP/Truncated mRNAP/Non-mRNACIPm7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA去磷酸化反应去磷酸化反应:利用碱性磷酸酶利用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶,如牛小肠碱性磷酸酶,CIP)处理,水处理,水解掉解掉RNA 5末端的磷酸

36、。但末端的磷酸。但CIP不能破坏不能破坏mRNA5末端末端的帽子结构的帽子结构;去帽反应:去帽反应:利用烟草焦磷酸酶利用烟草焦磷酸酶Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)消化掉)消化掉mRNA5末端的帽子结构末端的帽子结构;m7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAP/TAP 接头连接:接头连接:将经去磷酸化和去帽处理的将经去磷酸化和去帽处理的RNA转入另一转入另一PCR管中,加管中,加入入RNA接头片段,在接头片段,在RNA Ligase 作用下,将作用下,将RNA Oligo接接头连接于去帽的头连接于去帽的mRNA5末端末端;AAAA

37、AAAAAAAARNA LigaseRNA OligoAAAAAAAAAAAAP/ 反转录:反转录: 在反转录酶的作用下,利用在反转录酶的作用下,利用Oligo(dT)反转录获得反转录获得cDNA;RTAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAARNA OligoTTTTTTTTTTTTT 巢式巢式PCR: 利用接头的通用引物利用接头的通用引物UP(Universal Primer)和基因特)和基因特异引物,巢式异引物,巢式PCR获得基因获得基因5片段。片段。UPGSP5cDNA 巢式巢式PCR扩增全长扩增全长cDNA:根据已获得根据已获得目的目的基因的基因的3序

38、列序列和和5序列,设计基因特异序列,设计基因特异的巢式引物的巢式引物5GSP和和3GSP,巢式,巢式PCR扩增扩增cDNA全长全长序列。序列。TTTTTTTTTTTTT5GSP3GSPPCR 差别杂交差别杂交 Differential hybridization 扣除杂交扣除杂交 Substractive hybridization 抑制性消减杂交抑制性消减杂交Suppression substractive hybrid 差别显示差别显示 Differential display 基因芯片技术基因芯片技术 Gene chips3 3、根据、根据mRNAmRNA的特异性分离目的基因的特异性分离

39、目的基因v差别杂交差别杂交(Differential hybridization)又叫差别筛选又叫差别筛选(Differential screening),适用于分离经特殊处理而被,适用于分离经特殊处理而被诱发表达的诱发表达的mRNA之之cDNA克隆。克隆。v差别杂交差别杂交的技术基础十分简单,它不需要任何有关的技术基础十分简单,它不需要任何有关目的基因的核苷酸序列信息,但重要的是要拥有两种目的基因的核苷酸序列信息,但重要的是要拥有两种不同的细胞群体。不同的细胞群体。3.1 3.1 差别杂交差别杂交1 1)差别杂交的操作程序)差别杂交的操作程序mRMAmRMAcDNA探针探针cDNA探针探针c

40、DNAcDNA文库文库表达目的基因表达目的基因mRNA的细胞的细胞不表达目的基因不表达目的基因 mRNA的细胞的细胞原初平板原初平板影印影印影印影印2 2)差别杂交的局限性)差别杂交的局限性差别杂交的灵敏度比较低,特别是对于那些低丰差别杂交的灵敏度比较低,特别是对于那些低丰度的度的mRNA而言,这个缺点就显得更为突出。而言,这个缺点就显得更为突出。差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜,鉴定大量的差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜,鉴定大量的噬菌斑或克隆片段,因此成本较高、工作量较大。噬菌斑或克隆片段,因此成本较高、工作量较大。由于两套平行转移的滤膜之间,由于两套平行转移的滤膜之间,DNA的保有量往的保有

41、量往往会有差别,导致杂交信号的强度不一致,从而降往会有差别,导致杂交信号的强度不一致,从而降低了此法的可重复性。低了此法的可重复性。不表达目的基因不表达目的基因的总的总mRNA表达目的基因表达目的基因的总的总mRNAcDNA杂交杂交DNA-RNA杂交分子杂交分子游离的单链游离的单链mRNA分子分子3.2 3.2 扣除扣除( (消减消减) )杂交杂交(Subtractive hybridization)差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异,分离克隆差异mRNA所对应的cDNA,因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如:正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中,有些新基因是不能自发表达的,需在多瘤

42、病毒感染之后方可转录。任务是:分离克隆这些新基因,进而研究其生物学功能。 多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆3.3 3.3 抑制性消减杂交抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)FSSHSSH的核心技术是抑制性的核心技术是抑制性PCRPCR,它是一种将检测子,它是一种将检测子cDNAcDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术;单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体

43、的技术;F抑制性抑制性PCRPCR是利用链内复性优先于链间复性的原理,是利用链内复性优先于链间复性的原理,是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生生“锅柄样锅柄样”结构或结构或“发夹结构发夹结构”而无法与引物配对,而无法与引物配对,从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。(In excess)总总mRNA(B)总总mRNA(A)cDNAcDNA电泳,电泳,显影显影比较差异条带比较差异条带RT-PCR(加入已标记的加入已标记的dCTP)3.4 差别显示差别显示(Differential display)基因芯片

44、基因芯片(gene chip) 基因芯片又称为基因芯片又称为DNADNA微阵列微阵列(DNA microarray),它是,它是指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的探针指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的探针有序地固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,有序地固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过杂交信号的强弱检测靶分子的一种检测工具。通过杂交信号的强弱检测靶分子的一种检测工具。 基因芯片技术上的特点是具有基因芯片技术上的特点是具有高度可行性、多样性、高度可行性、多样性、微型化微型化和和自动化自动化四大特点。四大特点。激光共聚焦荧光扫描显微镜检测杂交信号激光共聚焦荧光

45、扫描显微镜检测杂交信号 二、基于二、基于DNA插入作用的基因分离技术插入作用的基因分离技术1 1、原理:、原理:由于插入的由于插入的DNADNA序列相当于人为地给目的基因加上一个序序列相当于人为地给目的基因加上一个序列标签,因此用此列标签,因此用此DNADNA插入突变分离基因的技术又称为插入突变分离基因的技术又称为DNA标签法标签法(DNA tagging).(DNA tagging).当一段特定的当一段特定的DNA序列插入到基因组中某一个基因的内序列插入到基因组中某一个基因的内部或其邻近位点时,便会诱发该基因发生突变,并最终导部或其邻近位点时,便会诱发该基因发生突变,并最终导致表型变化,形成

46、突变体。如果此段致表型变化,形成突变体。如果此段DNA插入序列是已知插入序列是已知的,则可作为的,则可作为DNA杂交的分子探针,从突变体基因组杂交的分子探针,从突变体基因组DNA文库中筛选到突变基因。再以突变基因为探针,从其原始文库中筛选到突变基因。再以突变基因为探针,从其原始个体的基因组个体的基因组DNADNA文库中筛选目的基因。文库中筛选目的基因。v利用转座子的转座作用使被插入的目的基因突变利用转座子的转座作用使被插入的目的基因突变 失去活性,而转座子的删除作用又可使目的基因失去活性,而转座子的删除作用又可使目的基因 复活。复活。2 2、转座子标签法(、转座子标签法(Transposon

47、tagging)Transposon tagging)v根癌农杆菌中的根癌农杆菌中的TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA区可转移入特区可转移入特定的宿主细胞中,并整合到基因组定的宿主细胞中,并整合到基因组DNADNA上,从而可上,从而可作为特定的标签序列。作为特定的标签序列。3 3、T-DNAT-DNA标签法(标签法(T-DNA tagging)T-DNA tagging)三、基于基因图谱的基因分离技术三、基于基因图谱的基因分离技术v图位克隆图位克隆( (map-based cloningmap-based cloning) )又称定位克隆又称定位克隆( (positionalposi

48、tionalCloningCloning) ),19861986年首先由剑桥大学的年首先由剑桥大学的Alan CoulsonAlan Coulson提出提出。v用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的进行的,无需预先知道基因的DNA序列,也无需预先知序列,也无需预先知道其表达产物的有关信息。道其表达产物的有关信息。1 1、原理:、原理: 在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上,使用在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上,使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNADN

49、A文库,从而构建目的基因文库,从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆,最后通或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。 构建遗传分离群体:构建遗传分离群体:F F2 2、BCBC、DHDH、RILRIL找到与目标基因紧密连锁的分子标记;找到与目标基因紧密连锁的分子标记;用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;用遗传作图和

50、物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;构建含有大插入片段的基因组文库构建含有大插入片段的基因组文库(BAC(BAC或或YACYAC库库) );以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;通过染色体步行、登陆获得含有目标基因的大片段克隆;通过染色体步行、登陆获得含有目标基因的大片段克隆;通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆;通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆;通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的

51、碱基序列。2 2、图位克隆图位克隆基本程序基本程序高密度的分子标记图谱高密度的分子标记图谱3 3、要求:、要求:与目的基因紧密连锁的分子标记与目的基因紧密连锁的分子标记高质量的基因组高质量的基因组DNADNA文库文库v连锁分析需要依赖特定的序列作为连锁分析需要依赖特定的序列作为连锁标记,连锁标记,即即标记序列与待研基因之间存在连锁关系,而满足与标记序列与待研基因之间存在连锁关系,而满足与待研基因相连锁的标记实在太少,所以连锁分析对待研基因相连锁的标记实在太少,所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。克隆大多数基因存在着一定的困难。RFLPRFLP的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内,

52、的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内,解决了连锁分析中难以克服的困难。解决了连锁分析中难以克服的困难。 19801980年年WymanWyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度等科学家首次建立了限制酶切片段长度多态性多态性RFLPRFLP( (restriction fragment length polymorphismrestriction fragment length polymorphism) ),使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能。使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能。v其它常用是分子标记其它常用是分子标记 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA DNA ( (Rand

53、om Amplified Ploymorphic DNA, RAPD ) )由由WilliamsWilliams等于等于19901990年创立。此技术建立于年创立。此技术建立于PCRPCR基础之上,基础之上,使用一系列具有使用一系列具有1010个左右碱基的随机引物,对基因组的个左右碱基的随机引物,对基因组的DNADNA进行进行PCRPCR扩增,以检测其多态性;扩增,以检测其多态性;由于整个基因组中存在众多由于整个基因组中存在众多反向重复序列,反向重复序列,因此,单一引物因此,单一引物可与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增其多可与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增其多态性

54、;态性;引物结合位点引物结合位点DNADNA序列的改变,以及两扩增点之间序列的改变,以及两扩增点之间DNADNA碱基的碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异,从而缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异,从而表现出多态性;表现出多态性;简单重复序列简单重复序列(Simple sequence repeats,简称,简称SSR)在生物基因组中,均存在着许多由在生物基因组中,均存在着许多由2-52-5个碱基对组成的个碱基对组成的简单重复序列,或称微卫星简单重复序列,或称微卫星DNADNA(Microsatellite Repeat)、如如(GA)n,(AC)n,(GAA)n(GA)n,(AC)n,(GAA)n(其中(其中n n为重复次数)等;为重复次数)等;微卫星微卫星DNADNA其两端的序列其两端的序列高度保守,高度保守,可设计双引物进行可设计双引物进行PCRPCR扩增,揭示其多态性。扩增,揭示其多态性。 SSR标记扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)由由ZabeauZabeau和和Vo

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