专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离(最后可用的)

1、20032003年年4 4月月1414日宣布人类基因组序列图日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。完成这标志着进入了后基因组时代。人类基因组：指人类基因组：指2222常常+X+Y+X+Y共共2424条染色条染色体，即体，即2424条条DNADNA上的全部碱基序列。上的全部碱基序列。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。的总和。主要是对蛋白质功能的研究。能够编码蛋白质的序列只占到了能够编码蛋白质的序列只占到了1.5%1.5%。n n 新华网首尔月日电（记者新华网首尔月日电（记者 干玉兰）韩国干玉兰）韩国浦项工业大学科

2、学家日宣布，他们已查明可抑制浦项工业大学科学家日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的艾滋病病毒感染的“”蛋白质核心部分的蛋白质核心部分的结构。结构。n 浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了公开了“”蛋白质内核心部分蛋白质内核心部分“”的三维分子结构，并称已弄清楚的三维分子结构，并称已弄清楚这一这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期研究成果发表在最新一期分子细胞分子细胞杂志上。杂志上。n 2 2年英国年英国自然自然杂志曾刊登论文说，杂志曾刊登论文说，“”蛋白质可有效抑

3、制艾滋病病毒的感染。蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各地的很多科学家开始研究此后，世界各地的很多科学家开始研究“”蛋白质的结构蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。性进展。课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离总结：分离生物大分子的基本思路是什么？总结：分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的选用一定的物理或化学的方法物理或化学的方法分离具分离具有有不同物理或化学性质不同物理或化学性质的生物大分子。的生物大分子。思考思考: 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，

4、如根据蛋白质各种特性的差异，如分子分子的形状和大小、所带电荷的性质和多的形状和大小、所带电荷的性质和多少、少、溶解度和吸附的性质和对其他分溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力子的亲和力等等，可以用来分离不同等等，可以用来分离不同蛋白质蛋白质。一、基础知识：一、基础知识： 凝胶色谱法凝胶色谱法（分配色谱法）：（分配色谱法）： 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离蛋白质、概念：根据被分离蛋白质相对分子质相对

5、分子质量的大小量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离的方法。子筛作用，来进行分离的方法。3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（ ）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（ ），移动速），移动速度（度（ ），而（），而（ ）的蛋白）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（）移动，路程（ ），移动速），移动速度（度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。此得以分离。4、具体过程、具体过程相

6、对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液： 2、作用：、作用： 能够抵制（能够抵制（ ）的对溶液）的对溶液的（的（ ）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的

7、酸或碱PH值值 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（就可以制得（ ）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3电泳：电泳：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模，目的是利用

8、缓冲液模拟细胞内的拟细胞内的PHPH环境，环境，保证血红蛋白的正保证血红蛋白的正常结构和功能，常结构和功能，便于观察（红色）和材便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）料的科学研究（活性）1、概念：、概念： 2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下，这些基团会带上下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身）以及分子本身（ ）、（）、（ ）的不同使带电分子）的不同使

9、带电分子产生不同的（产生不同的（ ），从而实现样），从而实现样品中各种分子的分离。品中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH 2、原理、原理 蛋白质在电泳时的迁移率取决于它所带净电蛋白质在电泳时的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。荷的多少以及分子的大小等因素。思考填写下表：思考填写下表： 决定运动方向决定运动方向 形成库伦力形成库伦力形成阻力形成阻力运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小

10、3 分类：分类： 和和琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所带负电荷的所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而因而掩盖了不同种蛋白

11、质间的电荷差别，使电泳掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于迁移率完全取决于( )。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小4 分离过程：分离过程：思考：思考： 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于，便于进行进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。红蛋白。样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度

12、鉴定蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：二二 实验操作实验操作1.样品样品血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（ ）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链共四条肽链共四条肽链90n每条肽链环绕一个每条肽链环绕一个亚铁血红素亚铁血红素基团，可携带基团，可携带一一分子氧或一分子二氧化碳分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含。血红蛋白因含血红血红素素而呈现红色。而呈现红色。红细胞的洗涤红细胞的洗涤（一）样品处理（一）样品处理n目的是去除杂

13、蛋白。要加入目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水生理盐水洗涤，洗涤，重复三次重复三次直至上清液不再呈现直至上清液不再呈现黄色。黄色。n2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：n3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：n4、透析、透析：n在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）血红

14、蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物（一）样品处理（一）样品处理n1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：n目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。洗涤。n2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：n在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放n3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：n4、透析：、透析：n装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于

15、磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。）透析。离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。出红色透明液体。透析过程视频（3.38）（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 取长取长40厘米，内径厘米，内径1.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。两端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则

16、难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位将上述三者按相应位置组装成一个整体置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75）。）。B、代表意义：、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水时吸水7.5克。克。配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算

17、并称取一定计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。液。A、固定：、固定：将色谱柱装置将色谱柱装置固定在支架上。固定在支架上。B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性的装将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。均匀。注意注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。视频（2.14）装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓

18、冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml的的20mmol/l的的磷酸磷酸缓冲液（缓冲液（pH为为7.0）充分充分洗涤平衡洗涤平衡12小时，使凝胶小时，使凝胶装填紧密装填紧密。1、液、液面不要低于凝胶表面，否面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效生物大分子物质的分离效果。果。2、不能发生洗脱液、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现流干，露出凝胶颗粒的现象象。打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口。 吸

19、管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。凝胶面。 加样后打开下端出口，使样品渗入凝加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用

20、试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。视频（6.30）（三）纯度鉴定（三）纯度鉴定n使用最多的是使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳。二、实验操作二、实验操作n蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为

21、四步：n（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。n（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。）粗分离：透析除去分子较小的杂质。n（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。的杂质蛋白质除去。n（4）纯度鉴定：通过）纯度鉴定：通过SDS聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。胶电泳鉴定。视频（2.14）练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种