SDSPAGE实验焦庆昉、邓小园

1、1邓邓小小园园2实验目的实验目的学习利用学习利用SDS-PAGESDS-PAGE测蛋白质的分子量。测蛋白质的分子量。3实验原理实验原理 电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。定向泳动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。离分析的技术。4蛋白质蛋白质N N端游离氨基，端游离氨基，C C端游离羧基以及侧链端游离羧基以及侧链上一些基团在一定上一些基团在一定pHpH条件带电荷，条件带电荷， 因此可以因此可以用电泳技术分离和鉴定用电泳技术分离和鉴定 COO- COO- COO- COO- COOH

2、COOH + H+ + H+ + H+ + H+ Pr Pr Pr Pr Pr Pr + OH- + OH- + OH- + OH- NH2 NH3+ NH2 NH3+ NH3+NH3+ PHPI PH=PI PHPI PH=PI PHPI PHPI 5 电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（胺（PAGEPAGE）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝

3、胶。6 聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：聚丙稀酰胺是由聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺和丙稀酰胺和N,N-N,N-亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）和过）和过硫酸胺（硫酸胺（APAP）激发的。被激活的单体和未被激活）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。连成为网状立体结构，最终

4、多聚链聚合成凝胶状。 7 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进胺凝胶系统中引进SDSSDS， SDSSDS能断裂分子内能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的剂的SDSSDS溶液中，与溶液中，与SDSSDS分子按比例结合，分子按比例结合，形成带负电荷的形成带负电荷的SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。8 这种复合物由于结合大量的这种复合物

5、由于结合大量的SDSSDS，使蛋白质，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于异，由于SDSSDS与蛋白质的结合是按重量成比与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小迁移速度取决于分子大小9影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素 样品本身：带电量，分子大小，形状样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压电场强度：电压 电泳介

6、质的电泳介质的pHpH和离子强度和离子强度 凝胶网络的孔径凝胶网络的孔径10实验材料和仪器实验材料和仪器 丙烯酰胺丙烯酰胺 丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料，易溶于水。具有毒产聚丙烯酰胺的原料，易溶于水。具有毒性作用：刺激皮肤和神经系统性作用：刺激皮肤和神经系统11 甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂 甲叉双丙烯酰胺，是一种白色晶体粉末，甲叉双丙烯酰胺，是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则自交无味，吸湿性极小。遇高温或强光则自交联，微溶于水、乙醇。联，微溶于水、乙醇。 12 过硫酸铵（过硫酸铵（APAP） 过硫酸铵

7、是一种白色、无味晶体，常作强过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，氧化剂使用，也可用作单体聚合引发剂也可用作单体聚合引发剂，极易潮解。极易潮解。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。13 四甲基二乙胺（四甲基二乙胺（TEMEDTEMED） 无色液体，有异味，对光敏感，应避光保无色液体，有异味，对光敏感，应避光保存。丙烯酰胺聚合成凝胶的催化剂存。丙烯酰胺聚合成凝胶的催化剂14 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS） SDSSDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，当是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，当其与

8、蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。白质分开。15 -巯基乙醇巯基乙醇 有特殊气味，可将蛋白质的二硫键断裂，有特殊气味，可将蛋白质的二硫键断裂，形成单链多肽，保证结合形成单链多肽，保证结合SDSSDS后，单位肽链后，单位肽链长度带相同点荷长度带相同点荷16考马斯亮蓝考马斯亮蓝 蛋白质与考马斯亮

9、蓝蛋白质与考马斯亮蓝G-250G-250结合在结合在2min2min左右的时左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下室温下1h1h内保持稳定，是一种常用的微量蛋白质内保持稳定，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。快速测定方法。17 实验器材实验器材 垂直板电泳装置垂直板电泳装置 直流稳压电源直流稳压电源 移液管移液管 滤纸滤纸 微量注射器微量注射器 大培养皿大培养皿18实验步骤实验步骤1.1.试剂配制试剂配制 实验管理人员，已配好，无需配制，具体实验管理人员，已配好，无需配制，具体配制方法，参考教材配制方法，参考教材P79-P80P79

10、-P80192.2.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好灌胶支架上固定好203.3.配制灌注聚丙烯酰胺凝胶配制灌注聚丙烯酰胺凝胶-10%-10%分离胶分离胶分离胶缓冲液分离胶缓冲液 2.5ml2.5ml蒸馏水蒸馏水 12.25ml12.25ml30%30%分离胶储存液分离胶储存液 4.9ml4.9ml10%AP 10010%AP 100l lSDS 200SDS 200l lTEMED 50TEMED 50l l21按比例配好分离胶按比例配好分离胶, ,用移液管快速加入，直至距样品模板梳用移液管快速加入，直至距样品模板梳齿下缘齿下缘1cm,1

11、cm,之后加少许蒸馏水约之后加少许蒸馏水约34mm34mm。凝胶聚合好的标志凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。是胶与水层之间形成清晰的界面。加水膜加水膜灌注分离胶灌注分离胶水封的目的是为了使分离胶上延平直水封的目的是为了使分离胶上延平直22分离胶分离胶 ( (分子筛效应分子筛效应) ) 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分离胶为小孔胶，的迁移率，这就是分子筛效应。分离胶为小孔胶，缓冲液缓冲液pH8.8pH8.8。当样品进入

12、分离胶，凝胶孔径变小，。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。移动慢。234.4.配制灌注聚丙烯酰胺凝胶配制灌注聚丙烯酰胺凝胶-5%-5%浓缩胶浓缩胶浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液 1.25ml1.25ml蒸馏水蒸馏水 6.8ml6.8ml30%30%浓缩胶储存液浓缩胶储存液 1.7ml1.7ml10%AP 10010%AP 100l lSDS 100SDS 100l lTEMED 50TEMED 50l l245.5.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干, ,按比例配好浓缩胶按比例配好

13、浓缩胶, ,连连续平稳加入浓缩胶至离边缘续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm处。处。灌注浓缩胶灌注浓缩胶256.6.迅速插入样梳迅速插入样梳, ,静置静置4040分钟分钟根据需要插入不同的梳子根据需要插入不同的梳子30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！左右加电泳缓冲液，再拔梳子！26 浓缩胶浓缩胶 浓缩胶为大孔胶，缓冲液浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.8.pH6.8.在电泳槽内充以在电泳槽内充以TrisTris甘甘氨酸缓冲液氨酸缓冲液(pH8.3)(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pHpH值的不连续性。在浓缩胶中值的不连续性。在浓缩胶中 HClHCl几乎全

14、部解离为几乎全部解离为ClCl- -，但，但只有极少部分甘氨酸解离为只有极少部分甘氨酸解离为H H2 2NCHNCH2 2COOCOO- -。蛋白质蛋白质的等电点的等电点一般在一般在pH5pH5左右，在此条件下其解离度在左右，在此条件下其解离度在HClHCl和甘氨酸之间。和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这当电泳系统通电后，这3 3种离子同向阳极移动。其有效泳种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为动率依次为ClCl- -蛋白质蛋白质 H H2 2NCHNCH2 2COOCOO- - ，故，故ClCl- -称为快离子，称为快离子，而而H H2 2NCHNCH2 2COOCOO- -称为慢离子。称为

15、慢离子。27浓缩胶浓缩胶 电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子好介于快慢离子之间，因此蛋白

16、质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成之间被浓缩成条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。数百倍。287.7.在上槽内加入缓冲液，拔出样梳后在上槽内加入缓冲液，拔出样梳后, , 整理上样槽整理上样槽拔梳子后形成点样孔拔梳子后形成点样孔孔周围有膜，用针拨开孔周围有膜，用针拨开298.8.点样。点样。 分别取待测蛋白分别取待测蛋白100100l l，再分别加入，再分别加入900900l l 样品缓样品缓冲液，混匀。取冲液，混匀。取1010l l上样。注意加标志蛋白质。上样。注意加标志蛋白质。30 9. 9.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳槽中加入缓冲液，接

17、通电源，进行电泳，开始电压恒定在电泳，开始电压恒定在4060V4060V，当进入分，当进入分离胶后改为离胶后改为120V120V，溴酚蓝距凝胶边缘约，溴酚蓝距凝胶边缘约0.51cm0.51cm时，停止电泳，断开电源。时，停止电泳，断开电源。31 10.10.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶放在大培养皿内，加入染玻璃板，将凝胶放在大培养皿内，加入染色液，染色色液，染色1 1小时左右。小时左右。32 11. 11. 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清次，再用脱色液脱色，直到蛋白质

18、区带清晰。晰。33注意事项注意事项制备凝胶应选用高纯度的试剂制备凝胶应选用高纯度的试剂固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板玻璃板凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速, , 催化剂催化剂TEMEDTEMED要在注胶前要在注胶前再加入再加入, ,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶. .注胶过程最好一次性注胶过程最好一次性完成完成, ,避免产生气泡避免产生气泡. .34样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入, ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底需水平梳底需水平取胶时应小心，防止损坏凝胶。做好标记，取胶时应小心，防止损坏凝胶。做好标记，以便染色、褪色后仍可辨认。以便染色、褪色后仍可辨认。35SDS-PAGESDS-PAGE应用应用 SDS-PAGESDS-PAGE因易于操作，而具有广泛的用途，因易于操作，而具有广泛的用途，是许多研究领域的重要的分析技术。是许多研究领域的重要的分析技术。 1. 1. 蛋白质纯度分析；蛋白质纯度分析； 2. 2. 蛋白质分析量