临床免疫功能检测

1、人体免疫功能的检测第一节 免疫应答的类型及组成免疫应答分两种类型一.非特异性免疫应答二.特异性免疫应答一.非特异性免疫应答（固有性免疫应答，innate immune response)（一）概念 先天获得，无个体差异（二）特点1.起作用迅速2.先天获得3.无个体差异4.不因同一抗原进入机体次数多少改变反应强弱（三）组成1.皮肤、黏膜的机械阻挡作用及局部分泌的抑 菌、杀菌物质2.吞噬细胞3.NK(nature killer)细胞对病毒感染靶细胞的 杀伤作用4.血液、体液中的抗菌有关分子：补体、溶菌 酶二.特异性免疫应答（适应性免疫应答，adaptive immune response)（一）概

2、念 后天因抗原刺激获得（二）特点1.后天获得2.免疫发生时间因首次或再次接触抗原而不同3.有个体差异4.免疫发生强弱与抗原进入次数有关（三）组成细胞免疫：由T细胞主导完成体液免疫：由B细胞主导完成第二节 人体免疫功能检测非特异免疫功能体液中杀菌物质补体、溶菌酶吞噬细胞大、小吞噬细胞（数 量、 功能）特异性免疫功能细胞免疫功能T细胞数量功能体液免疫功能B细胞数量功能人特异免疫功能的检测一. T细胞数量的检测二. T细胞功能的检测三. B细胞数量的检测四. B细胞功能的检测一.T细胞的计数（T细胞表面标志的检测）（一）特异性抗原的检测 T细胞表面有一些特异的CD抗原，根据这些不同的CD抗原可鉴定不

3、同的T细胞群体T细胞表面主要CD抗原及其特异性 CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 T（辅助/诱导）细胞、M、HIV受体 CD8 T（杀伤/抑制）细胞、NK细胞的亚型 CD25 活化T细胞、IL-2受体检测T淋巴细胞表面CD抗原中：CD3+的数量 表示总T淋巴细胞的数量CD4+的数量 表示是Th细胞的数量CD8+的数量 表示是Ts细胞的数量 一般更重视CD4+/CD8+的比值，正常应1.5，免疫功能差或者免疫功能紊乱，此比值往往小于1。检测T细胞方法： 用标记的抗CD抗原的单克隆抗体检测1.间接免疫荧光法：用荧光素标记的单抗作为 试剂染色

4、淋巴细胞，计算出染上荧光的淋巴细 胞百分率如：荧光标记的抗CD4 淋巴细胞 染上荧光的细胞为CD4+细胞 染色2.免疫细胞化学法： 用酶标记的单抗检测淋巴细胞 淋巴细胞 淋巴细胞表面CD抗原与相应单抗结合 加底物 细胞上有颜色为阳性细胞 用酶标记的单抗洗涤洗涤染色3.抗体致敏细胞花环法 用相应单抗致敏红细胞（单抗结合到红细胞表面），与淋巴细胞混合 有相应抗原的T细胞周围可吸附红细胞，形成花环（二）T细胞特异性受体（E受体）的检测 E花环形成试验 (Erythrocyte Rosette forming test)原理： T淋巴细胞表面有绵羊红细胞（SRBC)受体，当淋巴细胞与绵羊红细胞混合时，

5、T细胞通过该受体吸附绵羊红细胞，形成的花环。 E:erythrocyte, 红细胞E花环形成试验据实验条件不同又分两种： Et花环形成试验（total, 总E花环） Ea 花环形成试验（active,活性E花环）1.Et花环形成试验 淋巴细胞 + SRBC (1: 2050) 37 C 、5分钟 低速离心 4C、2 h or 过夜 形成花环的百分率意义： 表示总T细胞数量（凡是T细胞均能形成 花环），数量低于正常，说明细胞免疫功能 不好。 正常值：60%80%2.Ea花环形成试验 淋巴细胞 + SRBC (1 : 8-15) 37C、5分钟 低速离心 计数花环形成百分率意义： 能形成Ea花环的

6、T 细胞是活性强的T细胞，Ea 花环形成率更能反映细胞免疫功能的情况。正常值：20%30% （三）T细胞的 - 醋酸萘酯酶测定( - acidnaphthyl acetate esterase , ANAE)成熟的T细胞中富含ANAE - 醋酸萘酯 醋酸 + 萘酚红色沉淀 暗红色 该试验将T淋巴细胞染成暗红色。正常值6080%ANAE酸性时水解六偶氮品红偶联甲基绿复染二.T细胞功能的检测 反映机体细胞免疫功正常，除了要T淋巴细胞数量正常外，还要T细胞功能正常。 检测T细胞功能正常的试验有：（一）淋巴细胞转化试验（二）相关的细胞因子的检测（在细胞因子章节介绍）（三）淋巴细胞的细胞毒性检测（一）淋

7、巴细胞转化试验1.原理 淋巴细胞在某些物质刺激下，细胞增殖、分化（如细胞变大、胞浆增多、出现空泡）DNA合成增加：细胞核疏松，核仁出现，即为淋巴母细胞。 淋巴细胞受到刺激物刺激是否易发生转化与其功能好坏有关，功能好的易转化，故可通过转化率了解其功能情况。2.刺激物 一般为有丝分裂原和抗原 分两类（1）非抗原刺激物（有丝分裂原） 可刺激相关的一类淋巴细胞发生转化，与机体是否已曾受过某一抗原致敏无关。常有： 非抗原刺激物 刺激物 能刺激发生转化细胞 植物血凝素 T(phytohemagglutinin, PHA) 刀豆素A T (Concanavalin A, Con A)脂多糖 (LPS) B美

8、洲商陆(PWM) T、B（2）抗原刺激物 只能使已经被相应抗原刺激（致敏）过的淋巴细胞发生转化。如结核菌纯蛋白衍化物 (purified protein derivative， PPD)，作为刺激物，只能刺激曾经接受过结核菌刺激的淋巴细胞（部分 T 细胞）发生转化，故用抗原刺激物做淋巴细胞转化试验其转化率正常时均低于用有丝分裂原刺激的。如用PPD做淋巴细胞转化试验正常值：15%-20%；用PHA刺激的淋巴细胞转化率应为60%-80%。3.试验方法（1）形态学检测法 将待测者血取出，加入一定量刺激物（一般用PHA )培养，3天后涂片染色，计数转化淋巴细胞（根据形态）的百分率。正常值60%80%操

9、作过程：试验管:抗凝血0.5ml +PHA2mg +培养液对照管：抗凝血+培养液37 C 5%co2培养3天涂片染色计数转化淋巴细胞百分率转化与未转化淋巴细胞的区别 转 化 细 胞 未转化细胞 特 点 母 细 胞 过 渡 型 小淋巴细胞细胞大小（直径） 1220 1216 68 胞 核染色质 疏 松 疏 松 致 密核仁 13个 有或无 无分裂相 有或无 无 无 量 丰 富 稍 宽 窄嗜碱性 强、深兰色 兰 色 天青兰空 泡 有或无 有或无 无伪 足 有或无 有或无 无 胞 浆形态学方法的优缺点优点： 简便、不需要特殊仪器，无有害物（放射性物质）污染。缺点： 判断结果不客观，操作中易损害细胞，辨

10、认困难，结果判断难以规范化。（2）同位素掺入法原理： T细胞受PHA刺激后，细胞进入增殖周期进行有丝分裂。整个细胞周期分G1、S、G2、M四个期。在G1期合成少量DNA和蛋白质，为DNA复制准备，S期细胞合成DNA量明显增加。试验中当细胞进入S期时，在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)，细胞摄入，合成DNA,据掺入细胞内的同位素量，可推测细胞增殖活跃程度，从而判断淋巴细胞转化的程度。步骤： 外周血分离淋巴细胞洗涤3次计数并配成1106/ml0.1ml细胞+1640 0.1ml+PHA0.5mg/ml37 C 54-56h 5%co2加3H-TdR 1ci/孔37 C 16-18h5

11、%co2收集于滤膜上8085 C 30分钟置有闪烁液的闪烁瓶中用 计数仪测cpm（每分钟脉冲数）计算刺激指数：刺激指数(SI) = 实验组cpm对照组cpmCpm： 每分钟脉冲数正常值：SI 3.0同位素掺入法的优缺点优点： 结果客观准确，有取代形态学法的趋势缺点： 技术要求高，操作中每一个因素的改变都可影响结果；需要特殊仪器检测；有同位素污染问题（3）MTT(四甲基偶氮唑盐） 法原理：MTT在活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成兰黑色的 MTT-甲，形成MTT-甲的量与细胞增殖程度呈正相关。淋巴细胞受刺激物刺激增殖，细胞数增多，故通过比色法测A值，计算出刺激指数作为判断淋巴细胞转化率的指

12、标。 试验孔A均值 SI= 对照孔A均值步骤： 外周血分离淋巴细胞洗涤3次计数并配成1106/ml0.1ml细胞+1640 0.1ml+PHA0.5mg/ml37 C 、68h5%co237 C 、4h5%co2培养结束，取出，1500rpm10min离心去上清液，每孔加100l DMSO，混匀5min，室温放置20min后，于酶标仪上测570nm A值每孔加5mg/ml MTT 10l按公式计算SIDMSO：二甲亚砜（二） T细胞介导的细胞毒试验 细胞毒性T细胞（CTL)具有杀伤靶细胞的作用，它是评价机体细胞免疫水平的一种指标之一。检测这种杀伤作用的试验称为细胞毒试验。 CD8+CTL与靶细

13、胞表面相应抗原结合通过脱颗粒，释放穿孔素、颗粒酶，使靶细胞溶解、凋亡。CTLCD8+靶细胞穿孔素、颗粒酶靶细胞溶解、凋亡致敏淋巴细胞方法1.形态学方法 淋巴细胞与靶细胞按一定比例加在一起培养一段时间，染色后计数残留靶细胞（肿瘤细胞）数，计算淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率。对照组： 对照组平均残留肿瘤细胞数实验组：实验组平均残留肿瘤细胞数抑制率% =对照组 - 实验组对照组 100%2.同位素法：常用51Cr释放试验原理： 用51Cr标记靶细胞（一般为肿瘤细胞），将它与待测淋巴细胞（效应细胞）一起培养，效应细胞破坏靶细胞， 51Cr释放出来，测定其51Cr数量，便可推知效应细胞的杀伤能力。方法

14、： 效应细胞：受检者外周血单个核细胞 靶细胞：用铬酸钠（Na251Cr)标记传代肿瘤细胞分三组：1. 最大释放组 50l靶C+150 l DW (靶细胞全溶)2. 自发释放组 50l靶C+150 l培养液3. 实验组 50l靶C+150 l培养液+100 l效C效C ：靶C 分别为100 ：1；50 ：1；25 ：1培养后取上清测cpm计算特异溶解百分率：实验组cpm-自发释放组cpm 最大释放组cpm -自发释放组 cpm 100%特异溶解百分率大于50%为阳性细胞免疫功能体内检测法 型超敏反应皮试原理： 型超敏反应的本质是细胞免疫，所以型超敏反应如为阳性，说明细胞免疫功能好。所用抗原：OT

15、 或 PPD以OT为例 OT 1:2000 0.1ml 皮内注射，4872h 观察结果，红肿硬结大于0.5cm为阳性 该试验设计是基于人群中96%的人均感染过结核菌（被结核抗原致敏）致敏淋巴细胞再次接触抗原，释放出细胞因子，使局部产生以巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主的炎症（表面为红肿硬结）。阳性：感染过结核菌，细胞免疫功能好阴性：细胞免疫功能差或未感染过结核 注意与型超敏反应皮试区别三.B细胞数量的检测（一）B细胞表面识别抗原受体（SmIg, Surface membrane Ig)的检测SmIg 是B细胞膜表面球蛋白存在于成熟B淋巴细胞膜上为结构蛋白类型为：IgM、IgD。作用及意义： B细胞表

16、面标志 b.识别抗原受体 c.检测外周血淋巴细胞表面有SmIg者为B细胞，a. 故可作为检测B细胞数量的方法。2.方法（常用免疫荧光法）（1）试剂：羊抗人IgM、IgD荧光标记物（2）外周血淋巴细胞涂片，荧光抗体染色（3）观察：阳性细胞呈斑点状、环状、帽状 荧光（4）注意点：染色后30分钟内观察，否则帽 状荧光易脱落或被吞饮3.正常值：15%20%（二）B细胞表面抗原的检测 B细胞表面特有的CD抗原有：CD19、CD20用抗CD20的单抗（间接荧光免疫法、酶免疫组化法）检测外周血淋巴细胞，阳性细胞为B淋巴细胞，约占总淋巴细胞的8%12%。 以上两种方法中，检测B细胞膜表面SmIg的方法用得多些。四.B细胞功能的检测（一）血清中Ig的测定 人的体液免疫功能正常（B 细胞功能正常），应反映在血清中有正常量的免疫球蛋白 检测人免疫球蛋白常用方法：单向琼脂扩散试验、免疫比浊法正常值：IgG 1200mg% (7601660) IgM 130mg% (40220) IgA 200mg% (70350)（二）血型抗体测定 可反映体内IgM水平正常6月婴儿抗 a 1 ：8