第14章_细胞因子与细胞粘附因子的测定

1、第第十四十四章章 细胞因子与细胞粘附因子的细胞因子与细胞粘附因子的测定测定 是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。 细胞因子细胞因子细胞粘附因子细胞粘附因子 是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。达和可溶性两种形式存在。 第一节

2、第一节 细胞因子与细胞因子受体的细胞因子与细胞因子受体的特性和功能特性和功能一 细胞因子的共同特性和作用方式 作用方式 旁分泌 自分泌 内分泌 共同特性 多效性 重叠性 拮抗性 协同性二 细胞因子受体的共同特性 链 专一性 链 信号转导三 T细胞相关细胞因子与功能 介导细胞免疫的Th1型细胞因子 IFN- IL-12 IL-18 IL-2介导体液免疫的Th2型细胞因子 IL-4 IL-5 介导免疫调节和免疫抑制效应的Th3型细胞因子 TGF- IL-10家族介导炎症反应的Th17型细胞因子 Th17 TNF IL-23第二节 趋化因子及趋化因子受体了解第三节 细胞粘附分子与受体细胞粘附分子分类

3、细胞粘附分子分类 整合素超家族 选择素超家族 免疫球蛋白超家族 钙粘素超家族 可溶性细胞粘附分子第四节第四节 生物学测定方法生物学测定方法 1.1.基于基于DNADNA检测的分子生物学测定法：检测的分子生物学测定法： DNADNA扩增法扩增法 RNARNA印迹法印迹法 原位杂交法原位杂交法 核酸酶保护分析核酸酶保护分析 2.2.生物活性测定法生物活性测定法 生物学测定法分类生物学测定法分类根据细胞因子特定的生物学活性根据细胞因子特定的生物学活性, ,应用相应的指示应用相应的指示系统系统, ,同时与标准品对比测定同时与标准品对比测定, ,从而得知样品中细从而得知样品中细胞因子的活性水平胞因子的活

4、性水平, ,一般以活性单位一般以活性单位(U/ml)(U/ml)表示表示生物活性测定法原理生物活性测定法原理有助于细胞因子有助于细胞因子检测的活性作用检测的活性作用刺激刺激细胞细胞增殖或集落形成的活性增殖或集落形成的活性维持维持细胞细胞生长和存活的特性生长和存活的特性抑制抑制细胞细胞生长或破坏细胞的效应生长或破坏细胞的效应促进促进细胞细胞趋化或抗病毒作用趋化或抗病毒作用以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。株增殖来评估细胞因子的活性水平。 一、促进细胞增殖和

5、增殖抑制测定法一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法直接计数法直接计数法 简便、直观简便、直观, ,但费时、主观因素影响大、难但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法细胞代谢活性测定方法 3 3H-TdRH-TdR、125125I-UdRI-UdR掺入法或掺入法或MTTMTT等比色法等比色法细胞代谢产物测定法细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法记或可溶性分子测定法细胞增殖检测方法分类细胞增殖检测方法分类 通过检测细胞通过检测细胞DNADNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在合

6、成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，细胞的增殖过程中，DNADNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3 3H/H/125125I I ），通过检测），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。实验前：细胞浓度确定；台盼蓝拒染实验实验前：细胞浓度确定；台盼蓝拒染实验结果客观易于自动化；结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细胞方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性

7、污染株影响；放射性污染(1) (1) 放射性核素掺入法放射性核素掺入法常见细胞因子常见细胞因子3 3H-TdRH-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件掺入检测法所需细胞及参考试验条件细细 胞胞 株株所需浓度所需浓度（细胞数（细胞数/ml/ml）3 3H-TdRH-TdR前培养时间前培养时间3 3H-TdRH-TdR后培养时间后培养时间检测细胞因子检测细胞因子D10G4.1D10G4.12 210105 5484818-2018-20IL-1IL-1L929L9292 210105 556561616IL-1IL-1CTLL-2CTLL-210105 524244-64-6IL-2IL-2FD

8、C-P1,32DCL-27FDC-P1,32DCL-275 510104 424244-84-8IL-3IL-3CT.4SCT.4S10105 524244-64-6IL-4IL-4CH12CH125 510103 348486 6IL-5IL-5B13B135 510104 436361212IL-5IL-5T88-MT88-M1 110105 524241212IL-5IL-5BCL1BCL110105 572726 6IL-5IL-5Clone-K,IClone-K,IN/2bxN/2bx10105 524244-64-6IL-7IL-7TS1TS13 310104 466666 6IL

9、-9IL-9T10T1010105 572726 6IL-11IL-11UT-7UT-71.51.510105 572726 6SCFSCF（干细胞因子）（干细胞因子）CCL-64CCL-64* *5 510108 872728 8TGF-TGF-DA3.15, IFDA3.15, IF5 510104 424244-84-8GM-CSFGM-CSFM14/NES60.4M14/NES60.45 510104 424244-84-8M-CSF/G-CSFM-CSF/G-CSF特点：不使用放射性核素，特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与

10、线粒体（琥珀酸脱氢酶）代谢活性相关指示细胞的增殖情况与线粒体（琥珀酸脱氢酶）代谢活性相关 测定步骤类似测定步骤类似与同位素掺入法相比与同位素掺入法相比掺入物：掺入物：MTTMTT而非而非3 3H-TdRH-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同培养时间不同(2) MTT (2) MTT 比色法比色法四甲基偶氮唑盐比色法四甲基偶氮唑盐比色法 细胞株细胞株/ /原代细胞原代细胞细胞终浓度（细胞数细胞终浓度（细胞数/ml/ml）加入加入MTTMTT前温育时间（前温育时间（h h）加入后加入后检测细胞因子检测细胞因子B9B9，MH60,BSF2,TTD1MH

11、60,BSF2,TTD15 510104 4/2/210105 596/4896/483737度度 1h1hIL-6IL-6B9-11B9-115 510104 49696IL-11IL-11B9-1-3B9-1-35 510104 49696IL-13IL-13KYM-1D4KYM-1D42 210103 37272MV-3D9MV-3D95 510103 3120120TGF-TGF-WEHI-164/clone13WEHI-164/clone132 210103 37272TNFTNF32D/Mp110S32D/Mp110S1 110103 34444L929L9292 210105 5

12、5656TNFTNFCTLL-2CTLL-210105 522-2422-24IL-2IL-2小鼠基质细胞小鼠基质细胞, 32DCL-27, 32DCL-271.51.510105 57272IL-3IL-3细胞增殖或抑制活性检测的细胞增殖或抑制活性检测的MTTMTT比色法常用靶细胞比色法常用靶细胞 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与

13、细胞因子的活性呈正比。试验时，与的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞情况可用同位素情况可用同位素5151CrCr释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可通过结晶紫、萘酚蓝黑、通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTTMTT、NBBNBB等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标仪比色测定吸光值。死细胞数、仪比色测定吸光值。死细胞数、5151CrCr释

14、放量越高或比色测定的吸光值越低，表释放量越高或比色测定的吸光值越低，表明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。本法常用于本法常用于TNFTNF等的测定等的测定二、细胞毒活性测定法二、细胞毒活性测定法基本原理基本原理 TNF- TNF-和和TNF-TNF-与同一受体结合，故两者生物学活性相似与同一受体结合，故两者生物学活性相似 用用TNF-TNF-与与TNF-TNF-特异性中

15、和抗体作阻断试验，以区别两类特异性中和抗体作阻断试验，以区别两类TNFTNFTNFTNF活性测定靶细胞：小鼠成纤维细胞株活性测定靶细胞：小鼠成纤维细胞株L929L929、L-ML-M、WEHI164.13WEHI164.13注意：注意： 若选用若选用L929L929细胞，其不宜生长过密。细胞，其不宜生长过密。 细胞被某种因素激活后，代谢增强，线粒体脱氢酶活性也增强，细胞被某种因素激活后，代谢增强，线粒体脱氢酶活性也增强， 着色也会加深。着色也会加深。 MTTMTT染色时，必须考虑待检样品中有无激活靶细胞的因素。染色时，必须考虑待检样品中有无激活靶细胞的因素。细胞毒活性测定法常用于细胞毒活性测定

16、法常用于TNFTNF等的测定等的测定Wish、Hep2/c 人干扰素人干扰素L929 小鼠干扰素小鼠干扰素Ratec 大鼠干扰素大鼠干扰素A549MDBK 多种族的多种族的IFN-和和IFN-本法常用于本法常用于IFNIFN等的测定，等的测定，IFNIFN可诱导细胞产生抑制病毒可诱导细胞产生抑制病毒RNARNA和和DNADNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病变效应（变效应（CPECPE）。）。 VSV、EMCV及及Sindbis virus等等细胞病变效应细胞病变效应(CPE)倒置显微镜直接或结晶紫染色观察倒置显微镜直接或结晶紫染色观察抑制病

17、毒蚀斑形成或抑制病毒的产量抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量三、抗病毒活性测定法三、抗病毒活性测定法常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于攻击细胞的病毒常用于攻击细胞的病毒检测抗病毒活性的方法检测抗病毒活性的方法经典方法：经典方法：将生长在10%FBS的RPMI-1640培养基的Wish细胞按1105/ml接种96孔细胞培养板，每孔体积100l,Wish株在96孔板上贴壁生长过夜至每孔约4万个细胞，去除营养液后加入4倍梯度稀释的待测样品或干扰素标准品，再培养15-18小时，去除干扰素溶液，用50-100TCID50水疱性口炎病毒（VSV）攻击一定时间后至病毒对照孔细胞完全

18、病变，用 0.1%结晶紫染色指示。用能抑制50%细胞病变的最高稀释度作为一个干扰素单位。结果计算方法：距离比例=高于50%细胞病变抑制百分数50/高于50%细胞病变抑制百分数低于50%细胞病变抑制百分数再将高于50%的细胞病变抑制率的稀释度的对数与距离比例相加，即为该干扰素的50%细胞病变抑制率的最高稀释度的对数（log4）。 细胞病变程度分为细胞病变程度分为5 5个等个等级，即：级，即： “0 0”，表示无明显，表示无明显CPECPE； “1+1+”，CPE25CPE25； “2+2+”，CPECPE为为25255050； “3+3+”，CPECPE为为50507575； “4+4+”，CP

19、ECPE为为7575100100。根据病变程度找出根据病变程度找出CPEI50CPEI50的标的标本稀释范围，并以此计算出距本稀释范围，并以此计算出距离比例和确定离比例和确定IFNIFN效价。效价。 该法操作复杂、影响因素较该法操作复杂、影响因素较多，在试验前应对所用的病毒多，在试验前应对所用的病毒进行滴定。进行滴定。 标本稀释度log4两孔平均CPE细胞病变抑制程度细胞病变抑制积累细胞病变积累细胞病变抑制率30416016/16(100%)40412012/12(100%)504808/8(100%)61.52.541.54/5.5(73%)72.51.51.541.5/5.5(27%)80

20、0080/8(0%)细胞病变抑制法结果判断举例细胞病变抑制法结果判断举例* * *结果：结果：CPEI50CPEI50稀释度介于稀释度介于4-6-4-74-6-4-7之间，距离比例为之间，距离比例为(73-50)/(73-27) (73-50)/(73-27) =0.50=0.50，效价为，效价为4 46.56.5；同法计算；同法计算IFNIFN标准品的标准品的CPEI50CPEI50稀释度，将稀释度，将IFNIFN效价效价换算成国际单位，换算成国际单位，IFNIFN国际单位国际单位= =样品样品CPEL50CPEL50的稀释度的稀释度/ /标准品标准品CPEI50CPEI50稀释度稀释度标准

21、品的单位。标准品的单位。 趋化性趋化性(chemotaxis)(chemotaxis)： 诱导细胞向由诱导细胞向由趋化因子低浓度出向趋化因子低浓度出向趋化因子高浓度处作定向趋化因子高浓度处作定向移动的特性移动的特性, ,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。化学增活性化学增活性(chemokinesis)(chemokinesis)： 细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性, ,可采用琼脂糖可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。小滴化学动力学试验检测。趋化因子诱导细胞移动的方式趋化因子诱导细胞移动的方式四、趋化活性测定法四、趋化活性测定

22、法敏感性较高敏感性较高特异性不高特异性不高操作繁琐操作繁琐易受干扰易受干扰五、生物学活性测定方法学评价五、生物学活性测定方法学评价第五节第五节 免疫学测定法免疫学测定法 细胞因子细胞因子( (或受体或受体) )与相应的特异性抗体与相应的特异性抗体( ( 单克隆抗体或多克隆抗体单克隆抗体或多克隆抗体) )结合，通过同位结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示， 从而定性或定量显示细胞因子从而定性或定量显示细胞因子( (或受体或受体) )的水平。的水平。根据抗体性质和特异性不同，夹心法根据抗体性质和特异性不同，夹心法ELISAELISA可分为：可分为

23、：1. PcAb1. PcAb与与McAbMcAb夹心法夹心法2. McAb2. McAb与与PcAbPcAb夹心法夹心法 3. 3. 双双McAbMcAb夹心法夹心法4. 4. 细胞、细胞、McAbMcAb夹心法夹心法一、一、ELISAELISA方法方法ELISAELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISAELISA的基本步骤，的基本步骤，可作定性或定量分析。可作定性或定量分析。ELISAELISA法不仅可以用于细胞因子检测，法不仅可以用于细胞因子检

24、测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定 敏感性偏低敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性。不能判断细胞因子的生物学活性。ELISAELISA特异、简便特异、简便易于推广和标准化等优点易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法细胞因子测定的首选方法二、流式细胞分析法二、流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面

25、粘附分子分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。的表达情况。 1 1分离和培养待检细胞分离和培养待检细胞 2 2细胞固定细胞固定 3 3封闭非特异性结合位点封闭非特异性结合位点 4 4染色与分析染色与分析 基本步骤基本步骤使用流式细胞分析法，可以：使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：区分不

26、同分泌特性的细胞亚群： Th1Th1细胞细胞 IFN-IFN- Th2 Th2细胞细胞 IL-4IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：细胞表面的粘附分子或细胞因子受体： 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态三、酶联免疫斑点试验三、酶联免疫斑点试验(ELISPOT(ELISPOT或或ElisaSpot) ElisaSpot) 在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可在包被有待测细胞因

27、子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISAELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。分别作直接或间接法。 一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量

28、相关 基基本本原原理理四、免疫学测定方法学评价四、免疫学测定方法学评价优点：优点： 特异性高特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。缺点：缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞

29、因子的结合因子的结合第第三三节节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用细胞因子的测定主要应用于：细胞因子的测定主要应用于：特定疾病的辅助诊断特定疾病的辅助诊断机体免疫状态的评估机体免疫状态的评估临床疾病治疗效果的监测和指导用药临床疾病治疗效果的监测和指导用药疾病预防疾病预防一、临床应用原则一、临床应用原则 细胞因子和粘附分子的细胞因子和粘附分子的异质性异质性、功能交叉性功能交叉性和和多多样性、来源的复杂性样性、来源的复杂性和和组织细胞的非特异性组织细胞的非特异性，决定了，决定了在进行这些分子检测时，必须对方法选择和结果判断在进行这些分子检测时，必须对方法选择

30、和结果判断作出综合考虑。作出综合考虑。 细胞因子的检测方法多种多样，各有利弊。细胞因子的检测方法多种多样，各有利弊。 高敏感性方法：特异性的降低、废弃物难处理高敏感性方法：特异性的降低、废弃物难处理 活性测定方法：定性试验活性测定方法：定性试验 基因分析法：利于细胞内定位分析、操作烦琐基因分析法：利于细胞内定位分析、操作烦琐（一）方法的联合应用（一）方法的联合应用常用临床标本：抗凝全血，并分离获得单个核细胞常用临床标本：抗凝全血，并分离获得单个核细胞炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测：相应细胞细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测

31、：相应细胞相应细胞因子的基因和相应细胞因子的基因和mRNAmRNA表达：相应细胞表达：相应细胞疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测免疫荧光染色和流式细胞分析：注意待检细胞的活性和状态，以保免疫荧光染色和流式细胞分析：注意待检细胞的活性和状态，以保 证结果的特异性证结果的特异性（二）标本的适当选取（二）标本的适当选取意义：意义： 细胞因子具有网络调节的状调节的特点细胞因子具有网络调节的状调节的特点 级联效应或相互抑制作用的网络系统。级联效应或相互抑制作用的网络系统。 有助于提供有效的疾病诊断和机体免有助于提供有效的疾病诊断和机体免 疫状态信息疫状态信息举例：举例： T T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的 功能：功能：IL-1IL-1、 IL-2IL-2、IFN-IFN-和和GM-CSFGM-CSF Th1/Th2 Th1/Th2细胞平衡状态：细胞平衡状态：IL-2IL-2、IL-4IL-4、IL-10IL-10和和IFN-IFN-（三）细胞因子的联合检测（三）细胞因子的联合检测二、特定疾病诊断的辅助指标二、特定疾病诊断的辅助指标 许多疾病过程均可出现粘附分子和细胞因子表许多疾病过程均可出现粘附分子和细胞