高二生物血红蛋白的提取和分离

1、课题课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离课标领航课标领航1概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。的基本原理。2能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，评价实验操作的过程是否规范，分析实验结评价实验操作的过程是否规范，分析实验结果。果。3尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法。过程和方法。【重点重点】凝胶色谱法、电泳法基本原理。凝胶色谱法、电泳法基本原理。【难点难点】实验操作的过程及分析。实验操作的过程

2、及分析。课题背景课题背景为年老多病的人注射丙种为年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增强球蛋白，可以在一定程度上增强其身体的抵抗力。在动物体内，其身体的抵抗力。在动物体内，丙种球蛋白和许多蛋白质混合丙种球蛋白和许多蛋白质混合在一起。要获得纯净的丙种球蛋在一起。要获得纯净的丙种球蛋白制品，就必须进行提取和分离。白制品，就必须进行提取和分离。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种

3、分子的分离。分子的分离。基础自主梳理基础自主梳理一、凝胶色谱法一、凝胶色谱法1依据依据2概念概念3原理原理4 4结合结合P64下面和下面和P65上面，画出分离方法的上面，画出分离方法的表格表格5 注意事项注意事项二、缓冲溶液二、缓冲溶液1作用作用2配制配制3意义意义三、电泳三、电泳1概念概念2原理原理3作用过程作用过程4方法方法核心要点突破核心要点突破解读实验原理解读实验原理1蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小直径大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直大于凝胶颗粒空隙直径径小于凝胶颗粒空隙直小于凝胶颗粒空隙直径径运动

4、方式运动方式垂直向下运动垂直向下运动无规则的扩散运动无规则的扩散运动运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路程运动路程较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从凝胶柱中洗脱出先从凝胶柱中洗脱出来来后从凝柱中洗脱出来后从凝柱中洗脱出来四、实验操作四、实验操作原则：依据每一种蛋白质的来源和性质原则：依据每一种蛋白质的来源和性质血液、红细胞、血红蛋白的组成血液、红细胞、血红蛋白的组成1样品处理：样品处理： (1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤-离心去除血清离心去除血清 (2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放-蒸馏水涨破蒸馏水涨破 (3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液-离心处理离心处理思考感悟思考感悟 1洗涤红细胞时

5、为什么不能用蒸馏水代替生理盐洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水？水？【提示提示】生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。思考感悟思考感悟 2在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？目的是什么？【提示提示】(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。(2)甲苯

6、的作用主要是溶解细胞膜。甲苯的作用主要是溶解细胞膜。细胞膜的主要细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。2粗分离：即透析粗分离：即透析 (1)方法方法 (2)目的：将样品中相对分子质量较小目的：将样品中相对分子质量较小的杂质除去。的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。而将大分子物质保留在袋内。3纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：质

7、蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作取长取长40 cm，内径为，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂的玻璃管，两端需用砂纸磨平。纸磨平。底塞的制作：打孔底塞的制作：打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。顶塞的制作：打孔顶塞的制作：打孔安装玻璃管。安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。特别提醒特别提醒底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，

8、还塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。(2)凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶)固定：将色谱柱垂直固定在支架上固定：将色谱柱垂直固定在支架上 装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内 洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h 注意事项注意事项:不能有气泡存在；不能发生洗脱液流不能有气泡存在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。干露出凝胶颗粒的现象。(3)样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱a.准

9、备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与上的缓冲液缓慢下降到与_平齐，关闭出平齐，关闭出口。口。b加样：用吸管小心地将加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。c加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内内.洗脱：加入洗脱：加入_，打开下端出口，进，打开下端出口，进行洗脱。行洗脱。凝胶面凝胶面磷酸缓冲液磷酸缓冲液特别提醒特别提醒(1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同

10、时注意不要破坏凝胶面。同时注意不要破坏凝胶面。(2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。4纯度鉴定：判断纯化的蛋白质是否达到要求。纯度鉴定：判断纯化的蛋白质是否达到要求。在鉴定的方法中，使用最多的是在鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。五、操作提示五、操作提示1红细胞的洗涤红细胞的洗涤2色谱柱填料的处理色谱柱填料的处理3凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填4蛋白质的分离蛋白质的分离六、

11、结果分析与评价六、结果分析与评价【探规寻律探规寻律】对分离效果的判断对分离效果的判断(1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。(2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。说明分离效果不好，装填不成功。【互动探究互动探究】(1)凝胶色谱柱的装填应注意哪些凝胶色谱柱的装填应注意哪些事项？事项？(2)血红蛋白溶液是如何分离的？血红蛋白溶液是如何分离的？【提示提示】(1)装填前为了加速膨胀，可以加入装填前

12、为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。内的空气。装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。质的洗脱次序，降低分离效果。装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。象。(2)蛋白质的分离是根据离心原理进行的。当含有细蛋白质的分离是根据离心原理进行的。当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重

13、力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的黏度有关。像红细胞大又与重力场的强度及液体的黏度有关。像红细胞大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。下观察到它们的沉降过程。 (2011年聊城高二检测年聊城高二检测)有关凝胶色谱法和有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是电泳法

14、的说法正确的是()A它们都是分离蛋白质的重要方法它们都是分离蛋白质的重要方法B它们的原理相同它们的原理相同C使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要需要D以上说法都正确以上说法都正确【尝试解答尝试解答】_A_【解析解析】凝胶色谱法是根据相对分子质量的大凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分

15、子的分离。这两种方度，从而实现样品中各种分子的分离。这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度。法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度。【误区警示误区警示】不同的蛋白质在凝胶色谱中有三不同的蛋白质在凝胶色谱中有三种运动情况：种运动情况：(1)分子很小，可进入凝胶全部内孔隙；分子很小，可进入凝胶全部内孔隙；(2)分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；(3)分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分。相应部分。跟踪训练跟踪训练下列各项中，一般不影响凝胶色谱法下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质的分离度的是

16、分离蛋白质的分离度的是()A层析柱的高度层析柱的高度B层析柱的直径层析柱的直径C缓冲溶液缓冲溶液 D样品的分布样品的分布解析：解析：选选B。分离度取决于柱高，为分离不同组。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱必须有适宜的高度，分离度与柱高的分，凝胶柱必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关。样品的分布也影响分离度，缓冲溶平方根相关。样品的分布也影响分离度，缓冲溶液的液的pH影响蛋白质所带的电荷，因此也影响分影响蛋白质所带的电荷，因此也影响分离度。只有层析柱的直径一般不会影响分离度。离度。只有层析柱的直径一般不会影响分离度。 下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入加入(图图)和洗脱和洗脱(图图)示意图，请据图回答下列示意图，请据图回答下列问题。问题。( 1 ) 在 加 样 示 意 图 中 ， 正 确 的 加 样 顺 序 是在 加 样 示 意 图 中 ， 正 确 的 加 样 顺 序 是_。(2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是用吸管加样时，应注意正确操作，分别是 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 、 贴 着 管 壁 加 样 、贴 着 管 壁 加 样 、_。(3)等样品等样品_时，才加入缓冲液，待时，才加入缓冲液，待_接近色谱柱底端时，用试接近色谱柱底端时，用试管收