版《中国药典》微生物学检验技术实施指导与修订解读

1、杨凌化药质量部周国娟 电话2015.04.21目录一、一、1515版药典结构；版药典结构；二、非无菌产品微生物检查；二、非无菌产品微生物检查；2.1微生物计数法2.2控制菌检查法2.3微生物限度标准三、微生物实验室质量控制内容；三、微生物实验室质量控制内容；3.1实验菌株的质量控制3.2培养基的质量控制实验3.3微生物鉴定技术四、制药用水的检验及修订内容；四、制药用水的检验及修订内容；五、药品微生物实验室规范指导原则增修订的内容五、药品微生物实验室规范指导原则增修订的内容一、15版药典结构背景微生物检测方面的国际背景：1、国际方面（1）美国、欧美 、日本制药产业占全世

2、界市场份额的70%-80%；ICH Q4B（药品管理部门对药典的互认）附录4A、4B和4C已经得出结论，美国药典、欧盟药典、日本药典中的微生物限度检查方法协调统一。（2）中国虽然不是ICH的成员国，但中国与国外制药行业交往日益增多，且中国药品想要进入国际市场，药品检验方法和标准的统一势在必行。一、15版药典结构背景微生物检测方面的国际背景：2、方法科学性和灵活性：(1)准确度：方法适用性实验模拟样品污染微生物后进行方法适用性验证(2)精密度：结果判定以变化范围进行规定，符合微生物计数规律。(3)培养体系：采用更适宜的培养体系。(4)偏差调查：微生物检验结果偏差调查的引入。(5)与微生物指导原则

3、、理念有机统一。一、15版药典结构背景微生物检测方面的国际背景：3、兼顾国情：(1)适用性试验增加供试品对照组(2) 菌种采用CMCC(3)检验量、样品制备依照中国药典2010版，与ICH不同，主要工艺、剂型限制，例如贴剂检验量规定完全不同。一、15版药典结构背景微生物检测方面的国际背景：4、依据以上原则修订后具有以下特点：(1)修订后的计数法明确了10版药典未规定的事项，如该检验方法的适用范围，替代法的应用原则。(2) 修订后的计数法合理性、有效性、准确性得以充分体现，结果更接近真实污染情况，如方法适用性加菌方式的改变(3)修订后的计数法与美国、日本欧洲药典协调后的方法一致，对于采用国际、国

4、内两套体系（检验方法和检验标准）的生产企业而言，在方法一致的前提下，检测结果具有可比性，减轻企业检验负担。一、15版药典结构背景背景背景标准号标准号内容内容国际背景USP3661非无菌产品的微生物检查：微生物计数法62非无菌产品的微生物检查：控制菌检查法1111非无菌产品的微生物限度标准EP7.02.6.12非无菌产品的微生物检查：微生物计数法2.6.13非无菌产品的微生物检查：控制菌检查法5.1.4非无菌产品的微生物限度标准国内背景中国药典1995年版首次收载了微生物限度检查法，沿用86版卫生部颁布的标准2000年版首次收载了微生物限度标准法2005年版首次收载了方法验证，标准分列在三部药典

5、。对含生物原粉制剂增加大肠埃希菌的控制，用于深部组织的制剂增加厌氧菌检查。完成微生物检查的方法标准统一。年版首次收载培养基适用性检查，眼用制剂修订为无菌要求，阴道尿道给药制剂增加白色念珠菌的控制。年版基本与微生物检查法接轨，涵盖标准和方法的整体变化。各国药典，微生物限度检查结构列表一、15版药典结构总述药典由原来的三部改为四部，预计15年7月颁布执行：其中一部、二部、三部分别为中药、化药、生物药，四部：中国药典2015版总则，主要包括：凡例：凡例：主要增加对检测方法适用性、制剂通则、辅料标准适用性等的要求制剂通则：制剂通则：把一部、二部、三部的整合和完善通用方法通用方法/ /检测方法检测方法：

6、把一部、二部、三部的附录整合，解决了各部药典方法相同要求不统一的问题指导原则指导原则:新增药包材、标准物质的指导原则药用辅料品种正文：药用辅料品种正文：辅料加强安全性和功能性控制，增加收载的品种，增加辅料红外鉴别光谱图附表附表:原子量表、国际单位换算表、新旧附录新旧附录/通则编码对照表(链接)一、15版药典结构微生物内容以上内容详见：1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法1107非无菌药品微生物限度标准15版药典还增加了9204 微生物鉴定指导原则非无菌产品微生物限度检查(2010版微生物限度检查法）1105 微生物计数法1106 控制菌检

7、查法1107微生物限度标准9204微生物鉴定指导原则二、非无菌产品微生物检查2.1微生物计数法2.2控制菌检查法2.3微生物限度标准2.1微生物计数法定义：定义：系指对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数，不适用于活菌制剂的检查。本法适用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否符合规定的微生物限度标准。2015版 1105非无菌产品微生物限度检查-微生物计数法2.1微生物计数法1、试验环境2、供试液制备3、培养基配制4、试验方法选择5、培养计数及结果报告操作流程2.1微生物计数法试验环境项目项目1515版药典版药典1010版药典版药典检测环境1、在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空

8、气区域内进行2、既要最大可能防止微生物污染，又要防止检验过程对环境和人员造成危害。同时注意活动区域的合理规划及分区3、单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测1、在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行2、检验过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出3、单向流空气区域、工作台面及环境定期按照现行国标进行监测洁净等级分级级、级100级、10000级培养温度1、需氧菌总数（胰酪胨大豆胨琼脂），置30-35培养3-5天2、霉菌及酵母菌数总数（沙氏葡萄糖琼脂），置20-25培养5-7天1、细菌数（营养琼脂培养基），30-35培养3

9、天2、霉菌及酵母菌数（玫瑰红钠培养基），23-28培养5天备注1、升版后的洁净等级的划分与国际接轨,详见汇总表；2、上述“定期”规定详见通则9205。2.1微生物计数法试验环境上述描述的“不低于B级环境”中的操作要点：紫外灭菌完成后，通风10-15分钟后进行其他操作；检查操作区域气流是否正常，通常是由上至下；规范有序进行试验，即双手缓慢进入其内，等待约1分钟，再对样品进行处理；避免手臂快速移动和频繁进出安全柜，紊乱气流，同时避免实验材料挡住风口；安全柜内不能进行文字工作，避免纸张污染，进而污染实验室。2.1微生物计数法试验环境对实验环境USP1117中描述的实验室分区原则：1）实验区域划分合理

10、：无菌、非无菌样品操作区域应该与活菌培养区完全隔离，或采用其他无菌操作及防护措施减少污染事件发生的概率。所有实验室操作的关键检测过程在控制条件下执行。2）无菌检查的比较适宜环境：隔离器的使用（有建议过氧化氢灭菌3.5h）由此可见15版药典逐渐与国际要求接轨，达到与国际统一，便于实验室管理执行。2.1微生物计数法供试液制备称取规定量的供试品加入稀释剂，采用适宜的方法混匀此处样品的称取量一般是10g或ml、100cm；稀释剂的类别是经过方法确认得出的适合该产品的稀释剂操作流程2.1微生物计数法供试液制备1、根据供试品的理化特性与生物学特性，来制备供试液。常用的制备方法详见“通则1105非无菌产品微

11、生物限度检查-微生物计数法”中规定。其中不同于10版药典就是缓冲液、某些样品量的规定有所变化；2、供试液的浓度，按照方法确认的结论进行确定；3、供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45；4、供试液从制备加入至检验用培养基，不得超过1小时；5、微生物的每一个检验项目，平行制备2管或2个平皿。2.1微生物计数法供试液制备4、检验量说明：项目项目1515版药典版药典1010版药典版药典检验量1、除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml2、膜剂为100平方厘米3、贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减4、检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得

12、少于4片5、一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验5、一般应随机抽取不少于检验用量（2个最小包装单位）的3倍量供试品6、要求检查沙门菌的供试品，检验量应增加20g/ml。解析15版药典中“规定量”，具体解析为“充足量”，即包含了微生物各项检验及异常情况调查的量。2.1微生物计数法供试液制备5、新增加的概念内容：供试液制备中增加“分散均匀”概念，并非一定要溶解表面活性剂使用时，在确认对微生物无毒性的同时，需要确认与使用的中和剂或表面活性剂的相容性。偏差调查概念的引入MPN法使用范围，含菌量较低的供试品细菌总数测定，可作为平板计数法和薄膜过滤法不适用时的补充2.1微

13、生物计数法培养基配制对于检查使用的培养基，本次药典对培养基的类别进行了比较大的调整，如下表列出：项目项目 1515版药典版药典1010版药典版药典培养基类别1、胰酪胨大豆胨琼脂（需氧菌总数），30-35培养3-5天2、沙氏葡萄糖琼脂（霉菌及酵母菌数总数），20-25培养5-7天3、缓冲液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH7.2磷酸盐缓冲液、胰酪胨大豆肉汤培养基、PH6.8无菌磷酸盐缓冲液或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液1、营养琼脂培养基（细菌数），30-35培养3天2、玫瑰红钠（霉菌及酵母菌数），23-28培养5天3、缓冲液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲液或

14、PH7.6无菌磷酸盐缓冲液总结 该修订对测试项目名称、培养基、温度、时间都有调整。2.1微生物计数法培养基配制对于培养基的基本要求基本要求如下：1、购买成品干粉培养基需收集的内容： 处方、使用说明书、有效期、存储条件、用途、运输证明、供应商资质、适用性检测使用的质控菌株及实验证明。2、购买的成品培养基（配制好的培养基），需要求其为双层包装。3、培养基配制：应用玻璃器皿或搪瓷器皿配制，禁止使用金属容器；实验室指南中：含代谢药物或抑制剂的培养基应使用专用的玻璃器皿，使用器皿的洗涤程序进行验证；培养基的配制需记录配制日期、名称、成分、称量、质量监控结果、批号、有效期；配制前需对干粉培养基进行检查，如

15、有受潮结块不能使用；培养基灭菌后，不得在灭菌锅内保存过夜；培养基灭菌前后的PH值会降低0.2左右，该值需要在灭菌前校正，灭菌后确认。2.1微生物计数法培养基配制3、培养基的使用使用：理想状态是现配现用，若采用微波炉加热，需验证微波前后的失水量，在配制时将该水分量加上；固体培养基在复溶后放置时间不得超过8小时，且只能复溶1次；培养基的有效期：在非密闭的容器中，最长应在三周内使用（该效期不需要验证，如需延长，需进行验证）；在密闭环境中保存，规定为1年的有效期。琼脂平板最好现配现用，如放冰箱保存，一般不超过一周，且密闭保存，若延长需经验证；使用前需对培养基状态进行检查，不得出现浑浊、变色、有菌生长、

16、脱水等状态。2.1微生物计数法培养基配制4、培养基的使用检查流程：检查该批培养基是否进行了质量控制实验否根据第三章内容进行实验是培养基的外观检查目视培养基是否有干裂、气泡、颜色是否有变化等现象符合培养基的无菌培养不符合进行实验室偏差调查将培养基置于平皿中，按规定温度培养。结果应该无菌。不符合符合培养基正常使用对于购买的成品培养基，要求为双层包装，检测前还需进行预培养2.1微生物计数法试验方法选择项目项目1515版药典版药典1010版药典版药典测试方法1、平皿法：倾注法、涂布法（接种0.1-0.2ml供试液，涂布均匀，培养）2、薄膜过滤法3、最大可能数法（MPN）：该法的精密度和准确度不是很高，

17、仅在供试品需养菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，不适用于霉菌计数。该方法为数学理论推算法，是一种基于置信区间的间接计数方法。1、平皿法：倾注法2、薄膜过滤法测试项目1、需氧菌总数2、霉菌及酵母菌数总数1、细菌数2、霉菌及酵母菌数备注MPN的方法（最大可能数）简述：1、按标准配制供试液，加入每ml中含菌量不少于100cfu的试验菌，按10倍稀释法稀释供试品3个稀释度，加入9-10ml胰酪胨大豆肉汤培养基，每个稀释度3管，共9管，读取各管的生长情况2、结果报告为：最大可能数为2.1微生物计数法试验方法选择内容见详见通则1105章节2.1微生物计数法试验方法选择方法确认一般包括的项目：方法确认一般

18、包括的项目：项目项目1515版药典版药典1010版药典版药典试验组供试液中加入规定量的菌液，使每1ml供试液或每张滤膜所过滤的供试液中含菌量不大于100cfu供试液和菌液同时加入平皿中供试品对照组供试液，以稀释液代替菌液，按照试验组进行试验供试液直接加入至平皿中（不加菌液）菌液对照组取不含中和剂、灭活剂稀释液加入规定量的菌液中直接加入菌液至平皿中阴性对照组稀释液+稀释液+培养基说明1、阴性对照组是对整个试验环境的监测，应在所有试验开始前进行的。且其必须为阴性，否则整个试验将失败2、对方法中如含有了中和剂、灭活剂的情况，各试验项目需要用“含中和剂的稀释液”替代“原稀释液”。2.1微生物计数法试验

19、方法选择中和剂对照组的流程图：2.1微生物计数法试验方法选择对于上试验菌的说明：项目项目1515版药典版药典1010版药典版药典菌种个数总需氧菌计数用五种菌株试验细菌用三种菌株进行验证菌种种类总需氧菌（平皿法和薄膜过滤法）：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉（MPN法是金葡、铜绿、枯草）霉菌和酵母菌：白色念珠菌、黑曲霉细菌：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌霉菌和酵母菌：白色念珠菌、黑曲霉加菌方式菌液加入供试液中，使每ml供试液或每张滤膜所过滤的供试液中含菌量不大于100cfu，且所加菌液的体积不超过供试液体积的1%平皿计数验证时菌液和供试液同时加入平皿中，加

20、菌量为50-100cfu（薄膜法，将菌液加入最后一次冲洗液中，抽干）培养时间细菌72h；真菌5天细菌48h；真菌72h结果判定各菌回收率应在50-200% MPN法：生长良好浑浊度相似各菌回收率应70%说明回收率的计算：（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数*100%MPN法：试验组菌落数应在稀释剂对照组菌落数的95%置信限内2.1微生物计数法试验方法选择对方法确认出现的结果判断：各试验菌的回收率是否50-200%范围是根据该方法进行操作检测否更换检测方法重新进行确认否开发的检测方法项目准确度、精密度、专属性、定量限、线性、范围、重现性、耐用性的全套验证符合该方法正常使用是根据

21、该方法进行操作检测出现该原因可能是产品中含有抑制物质，需进行稀释该稀释需要由低往高浓度进行，且稀释浓度由限度控制（例如微生物限度标准是1g需氧菌总数不得过103cfu，则最高稀释级是1:103 ）2.1微生物计数法 培养计数及结果判定培养的方式培养的方式：在相应的温湿度要求下，倒置培养。此处倒置的目的：1、避免培养皿上的水滴落造成污染；2、由于重力的作用使菌落相对不会蔓延的太快，降低计数难度；3、防止水分的蒸发。结果计数：结果计数：1、需养菌总数测定选取平均菌落数小于300cfu的稀释级2、霉菌和酵母菌总数测定选取平均菌落数小于100cfu的稀释级3、选取最高的平均菌落数，计算1g、1ml或1

22、0cm供试品中所含的微生物数。对于MPN法的结果，按照检索表查询后，报告为“最大可能数为XXX”4、如各稀释级别的平皿均无菌落生长，以1该稀释剂倍数5、（逐日）观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数并报告。平均值的报告结果采用“四舍五入”，进行修约6、若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15，且两个平皿的菌落数不能相差1倍或以上。该结果可能是由于样品溶液的不均匀或者操作有误导致的需要进行微生物调查2.1微生物计数法 培养计数及结果判定结果判定：结果判定：1、供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合规定，判供试品符合规定2、其中任何一项不符合规定，判供试品不符合规定。针对此处

23、，15版药典也有更新，详见下表：项目项目1515版药典版药典1010版药典版药典复测的规定各结果均不得复试，通过实验室调查、回顾、分析结果的准确性进行评估计数菌任何一项不符合规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以三次结果的平均值报告菌数总结1、在15版中明确说了产品结果不得进行复测，以一次结果为准。2、修订后的的结果如果不符合规定，需进行确认，判断是细菌或者是霉菌数超标（可采用玫瑰红钠培养基，该培养基对细菌有一定的抑制作用）2.1微生物计数法总结检测经验：检测经验：1、平皿法中的涂布法：n培养基表面需要干燥，不要有凝集水（操作可在洁净室内晾干或者放在培养箱内10-20min），防止涂

24、布后菌落生长成一片。n接种量为0.1-0.2ml，防止过多菌量的加入影响结果的计数。2、薄膜过滤法：n对膜的完整性，可采用测试过滤后的液体进行培养，来保证、监控膜的完整性；n每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml。2.2控制菌检查法定义：定义：控制菌检查法系指用于在规定的试验条件下，检查供试品在特定的培养基内是否存在特定的微生物。2015版 1106非无菌产品微生物限度检查-控制菌检查法。2.2控制菌检查法1、试验环境准备2、供试液准备3、培养基准备4、方法适用性确认5、培养及结果报告操作流程2.2控制菌检查法控制菌检查法的“试验环境准备”、“供试液准备”同微生物计数法章

25、节内容。如果供试品具有抑菌活性，应尽可能去除或中和；中和剂或灭活剂的使用，应确认该方法的有效性以及对微生物的无毒性，并确认供试液与所用的中和剂或灭活剂的相溶性。2.2控制菌检查法培养基准备控制菌检查用培养基数量减少7个；在增菌过程，使用无选择性增菌培养基培养。理由：污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损伤，使用无选择性增菌培养基培养，对受损伤的细菌得到修复，提高检出率。培养基的规定同微生物计数法章节关于培养基的内容。检验项目详见1106章节2.2控制菌检查法培养基准备项目项目15版药典规定（共计版药典规定（共计16种）种）10版药典规定（共计版药典规定（共计23种）种）培养基类别肠道增菌

26、液培养基紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基麦康凯琼脂/肉汤培养基RV沙门菌增菌液培养基木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基三糖铁琼脂培养基溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂培养基沙氏葡萄糖液体/琼脂培养基念珠菌显色培养基胰酪大豆胨琼脂/肉汤培养基胆盐乳糖培养基乳糖胆盐发酵培养基4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基麦康凯琼脂/肉汤培养基营养肉汤培养基四硫磺酸钠亮绿培养基胆盐硫乳琼脂培养基沙门、志贺菌属琼脂培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基三糖铁琼脂培养基溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基绿脓菌素测定培养基亚碲酸盐肉汤培养基卵黄氯化钠琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基梭菌增

27、菌培养基哥伦比亚琼脂培养基沙氏葡萄糖液体/琼脂培养基念珠菌显色培养基1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基表中共计减少7种培养基2.2控制菌检查法方法适用性确认项目项目1515版药典版药典1010版药典版药典测试测试方法方法1、按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；2、采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤，注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。1、取规定量供试液及10-100cfu试验菌接入增菌培养基中依相应的控制菌检查方法进行检查；2、采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中

28、，过滤后，注入增菌培养基或取出接入增菌培养基中。测试测试菌种菌种耐胆盐的革兰氏阴性菌：采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌大肠菌群：采用大肠埃希菌为试验菌大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌2.2控制菌检查法方法适用性确认项目项目1515版药典版药典1010版药典版药典结果结果判断判断1、若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的测试2、若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性2、若未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验

29、证结论结论根据该方法确认，得出适合该产品的检测方法即可具体测试方法详见通则1106章节，注意大肠埃希菌的检测方法（如下页截图）。2.2控制菌检查法方法适用性确认2.2控制菌检查法培养及结果报告培养方式培养方式同微生物计数法章节。具体温度详见： 通则1106章节结果报告结果报告：对于控制菌有2种结果，阴性结果即为合格， 阳性结果为不合格。2.3微生物限度标准10版药典规定：直接规定限度标准为不超过100cfu、1000cfu等1515版版药典规定：对101cfu，解释其限度为：可接受的最大菌数为20；对102cfu ，解释其限度为：可接受的最大菌数为200；对103cfu ，解释其限度为： 可接

30、受的最大菌数为2000；依此类推。备注：1、此处强调微生物计数单位是“cfu”2、15版微生物计数结果以10n表示，该限度的表述不能理解为限度的放宽。在之前药典统计方面，默认菌种计数方法是没有系数的，但经长期大量的研究发现菌落个数以离散型或正态分布的数学统计学原理进行的分布，为了体现出检测结果的真实性，需要增加一个数学方法的系数。由大量数据得出系数“2”。因此结果是更加严密，而非放宽。2.3微生物限度标准微生物限度标准不在以文字描述（凡例附录P122），用以表格的形式进行描述，内容包括有：1、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准2、非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准3、非无菌的药

31、用原料及辅料微生物限度标准4、中药提取物及中药饮片的微生物限度标准具体内容详见“2015版 1107非无菌药品微生物限度标准”注意点：沙门菌的检查增加至口服制剂项下（前提是含脏器提取物、发酵类原粉）2.3微生物限度标准除了本限度标准所列出的控制菌外，药品中若检出其他可能具有潜在危害性的微生物，应从以下方面进行评估：1、药品的给药途径：给药途径不同，其危害性不同；2、药品的特性：药品是否促进微生物生长，或者药品是否有足够的抑制微生物生长能力；3、药品的使用方法；4、用药人群：用药人群不同，如新生儿、婴幼儿及体弱者，风险可能不同；5、患者使用免疫抑制剂和甾体类固醇激素等药品的情况；6、存在疾病、伤

32、残和器官损伤，等等；7、当进行上述相关因素的风险评估时，评估人员应经过微生物学和微生物数据分析等方面的专业知识培训；8、评估原辅料微生物质量时，应考虑相应制剂的生产工艺、现有的检测技术及原辅料符合该标准的必要性。总结：微生物检查法修订后特点：修订后，微生物检查法概念更明确，控制指标更合理，计数方法及标准合理准确反应真实污染情况；检测方法基本与一致；修订后既与接轨，有兼顾国情，采用菌种，检验量按照版药典，控制菌检查保留了部分生化试验。三、微生物实验室质量控制内容3.1实验菌株的管理3.2培养基质量控制实验3.3微生物鉴定技术3.1实验菌株的管理菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。药品微生物检验

33、用的菌株，应来自国内外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。标准储备菌株：从国内外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后的。标准储备菌株应进行纯度和特性确认。详见9203 药品微生物实验室质量管理指导原则上述菌种保藏机构常见的有：CMCC CMCC 中国医学菌种保藏中心中国医学菌种保藏中心ATCC ATCC 美国标准菌种收藏中心美国标准菌种收藏中心NCIMB 英国食品工业与海洋菌种保藏中心NBRC 日本技术评价研究所生物资源中心CIP 法国巴斯德研究所菌种保藏中心3.1实验菌株的管理菌种保存方式菌种保存方式3 3种：种：菌种的管理工作：1、

34、菌种需要有专用的冰箱、上锁、专人管理；2、菌种接收时需注意其来源、名称、标准号、日期等详细信息。3、菌种的管理记录详细记载：标准菌株工作菌株转种传代定期鉴定（纯度、特性）使用及销毁都要有详细记录4、菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证明和登记，并包装严密；菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录5、菌种接收的质量确认：允许菌种在使用前再进行确认。6、一旦发现菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理。保存方式保存方式保存环境保存环境冷冻保藏在低温下保藏，一般在低于-30或者-70，是有效地长期储藏方法冻干法保藏是一种长期保存菌种的方法冷藏在2-8保藏，是短期储藏方法。（但是具

35、体时间未规定）3.1实验菌株的管理菌种的使用：菌种的使用：1、日常使用的工作菌种均由标准储备菌株制得，在使用前需要确保其纯度和特性，即菌种的鉴定。2、工作菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代。传代就是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何形式的转种均被认为是传代1次。）3、标准菌株或者工作菌株如果确认试验证明已经老化、退化、变异、污染等，应及时灭菌销毁。4、菌种的保存时间药典没有强硬的规定，企业根据菌种的质量控制结果进行评估制定。3.1实验菌株的管理菌种的使用：菌种的使用：5、工作菌悬液制备后，存放室温条件下，在2小时内使用，若保存在2-8下，可在2

36、4小时内使用。黑曲霉孢子在2-8的验证过的贮存期内使用。6、工作菌悬液不能用来进行传代培养。各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌悬液制备操作程序；采用适宜的保存方法，不可重复从菌种包装瓶中移取菌种或重新冷冻菌种。3.1实验菌株的管理右图是一个较为常见的菌种使用流程图3.1实验菌株的管理1、上述“储备管”变为“斜面储存管”，则编号为SV9027/03-01（至30号）/18/2，共计有30个管，进行日常菌悬液的制备。2、日常使用的工作菌悬液，编号可以为：WSxxxx/xx-xx/xx/x-x-时间菌种编号的内容3.1实验菌株的管理上图中，工作菌悬液各菌一般采用的培养基如下列

37、表：菌株菌株培养基培养基培养温度培养温度培养时间培养时间金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌胰酪胨大豆肉汤30-3518-24h白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤20-252-3天黑曲霉马铃薯葡萄糖肉汤20-255-7天，或直到获得丰富的孢子即可3.1实验菌株的管理菌种制备过程中的技巧：1、铜绿假单胞菌：该菌的斜面保存应该在室温进行，否则菌落会发黑（其最适宜生长温度为，不能生长）。2、枯草芽孢杆菌：菌种易抱团生长，在制备肉汤时需将试管混匀，才可均匀生长。3、菌悬液制备时，如挑上的菌种为块状，可在液面上“研磨”，使其分散，同时需要考虑该菌种是否放置时间过长所致。4、黑曲霉的生长对培养基的营养成分要求不是

38、很高，制备斜面时，让培养基中的水分蒸干（或者制备好的斜面放置一段时间）再进行接种；其霉菌的平板在拿动时，注意不要随便晃动，否则孢子等溅出污染环境。5、白色念珠菌在液体培养基内生长会沉淀在底部（原因是期体积较大），其形态在高倍镜下即可看到，不需要用油镜。3.2培养基的质量控制实验培养基的质量控制实验，主要包括： 培养基外观检查外观检查、培养基无菌检查无菌检查、培养基适用性检查适用性检查，其中培养基的适用性检查适用性检查实验，属于重点内容；同一个批号、同一次购买进的粉末成品培养基，若采用已验证的配制和灭菌程序，那么可不用每配制一批进行一次适用性检查。对于购买的成品培养基，也需按照培养基的类别进行相

39、应的适用性检查，以确保培养基的质量。3.2培养基的质量控制实验培养基适用性检查一般包括： 促生长试验、抑制性试验、指示能力促生长试验、抑制性试验、指示能力备注：备注：培养基适用性检查可参考药典中对培养基适用性检查要求的列表进行试验，如下表：3.2培养基的质量控制实验3.2培养基的质量控制实验修订前修订后范围固体培养基液体、固体培养基加菌量50-100cfu不大于100cfu培养温度营养琼脂30-35玫瑰红钠23-28TSA琼脂30-35TSB肉汤30-35SDA琼脂20-25培养时间细菌48h真菌72h细菌不大于72h真菌不大于5天可接受范围70%固体培养基50-200%液体培养基生长良好汇总

40、：培养基适用性检查内容3.2培养基的质量控制实验举例：培养基适用性检查例子-TSB(胰酪胨大豆肉汤培养基)培养基名称TSB无菌性检查取经过灭菌的TSB，于30-35培养不少于3天，培养基应澄清试验用菌株枯草芽孢杆菌、金葡、铜绿接种方法分别接种不大于100cfu的菌液，摇匀，培养适用性检查接种试验用的菌株后，30-35度培养不超过72h，与对照培养基比较试验菌生长良好备注，该培养基同时用于稀释液的制备和控制菌检查时，需要同时满足计数和控制菌培养基适用性检查控制要求3.2培养基的质量控制实验举例：培养基适用性检查例子-TSA(胰酪胨大豆琼脂培养基)培养基名称TSA无菌性检查取经过灭菌的TSA，于3

41、0-35培养3-5天，应无菌落生长试验用菌株枯草、金葡、铜绿、白念、黑曲接种方法1、涂布法接种不大于100cfu菌液2、倾注法同1，倾注培养基摇匀适用性检查枯草、金葡、铜绿于30-35培养不超过3天，白念、黑曲于30-35培养不超过5天与对照培养基比较，恢复率在50-200%之间3.2培养基的质量控制实验举例：培养基适用性检查例子SDA（沙氏葡萄糖琼脂培养基）培养基名称SDA无菌性检查取经过灭菌的SDA，于20-25培养5-7天，应无菌落生长试验用菌株白念、黑曲接种方法1、涂布法接种不大于100cfu菌液2、倾注法同1，倾注培养基摇匀适用性检查白念、黑曲于20-25培养不超过5天与对照培养基比

42、较，恢复率在50-200%之间3.2培养基的质量控制实验举例：培养基适用性检查例子SDA+抗生素培养基名称SDA+抗生素（用于细菌超标引起霉菌和酵母菌总数超标用）无菌性检查取经过灭菌的SDA，于20-25培养5-7天，应无菌落生长试验用菌株抑菌性检查：枯草、金葡、铜绿促生长能力：白念、黑曲霉常用抗生素1、庆大霉素，广谱。对G-、+菌有很好的抗菌作用；2、氯霉素，对G-作用强，对G+菌的作用不及青霉素与四环素接种方法抑菌、促生长能力测试适用性检查白念、黑曲于20-25培养不超过5天与对照培养基比较，恢复率在50-200%之间；枯草、金葡、铜绿不得生长3.2培养基的质量控制实验总结：总结：1、培养

43、基适用性检查所用的菌种类别菌种类别详见1105、1106章节；2、培养基适用性检查所用的菌种浓度菌种浓度均为控制在不大于100cfu的范围内；3、培养温度，同总需氧菌、酵母菌和霉菌总数的温度4、培养基适用性检查结果的判断结果的判断：固体培养基，与对照培养基比较，菌种的回收率应在0.5-2之间；液体培养基，应与对照培养基的生长情况保持一致。3.2培养基的质量控制实验说明：说明：10版药典借鉴欧美药典，引入了培养基适用性检查以保障微生物检查结果的准确性和可靠性。但是在药典修订过程中，对于欧盟药典中的“之前验证过的培养基”的采纳与否，存在很大的争议，主要集中在两点：1、我国药品微生物实验室小而分散，

44、数以千计的企业和基层药检所难以有效地进行参比培养基的验证、评价工作；2、在监督检查中，难以有效评估企业微生物实验室对参比培养基的验证情况；经过九届药典委员会微生物专业委员会的反复讨论，提出以统一的、经过充分评价和验证过的对照培养基替代需要由每个实验室分散评价的“之前验证过的培养基”-生产统一的对照培养基。3.3微生物鉴定技术微生物鉴定为非无菌产品微生物限度、控制菌检查中疑似菌及标准菌株的鉴定，也可用于药物原料、辅料、制药用水、终产品和环境中的微生物进行的鉴定。当鉴定结果有争议时，以伯杰氏系统细菌学手册现行版的结果为准。微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数非无菌生产

45、过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规形态、革兰氏染色或其它染色法、某些能够给出鉴定结论的关键生化反应（如氧化酶、凝固酶等反应）进行分析即可满足要求。对非无菌产品的控制检查应达到种的水平； 无菌试验结果鉴定一般需达到菌株水平。来源9204 微生物鉴定指导原则3.3微生物鉴定技术微生物鉴定的基本流程：4、基因型微生物鉴定采用核酸的方法进行。通常仅在关键微生物调查中使用3、表型微生物鉴定以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标2、初筛试验确定待检菌的基本微生物特性，采用革兰氏染色、芽孢染色、细胞形态、生化反应等1、待检菌的分离纯化对待检菌进行划线分离纯化（必要时先进行增菌培养），获

46、得单个菌落3.3微生物鉴定技术重点鉴定技术要点：重点鉴定技术要点：1、革兰氏染色工作，一般最好是新鲜菌种（分离纯化后的菌种），在20-24h之内进行； 染色液中的碘液需在密闭的暗色瓶内储存，防止挥发或被还原。注意试液由原来的红棕色变为淡黄色不宜再用； 染色片用油镜显微镜观察。2、生化反应用到的试剂最好为现配现用（例如过氧化氢酶），否则效果不明显，造成假阴性结果。下面介绍几种常见的微生物鉴别方法：过氧化氢酶试验、血浆凝固酶试验、革兰氏染色、芽孢染色3.3微生物鉴定技术过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验1. 1. 原理及目的原理及目的细菌代谢产生过氧化氢酶，对菌细胞有毒，过氧化氢酶的作用能使过氧化氢分解

47、成分子态氧和水，使其解毒。具有过氧化氢酶的细菌培养物，加入过氧化氢试液，立即产生气泡，即为阳性反应。革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，但链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步鉴定。2. 2. 范围范围适用于微生物检验室内进行葡萄球菌、微球菌、链球菌的确认。3. 3. 试验器具及试剂试验器具及试剂载玻片、无菌接种环、过氧化氢酶试剂4. 4. 试验程序试验程序4. 1 过氧化氢酶试验用无菌接种环挑取一环琼脂培养基上的可疑菌落置洁净的载玻片上，滴加过氧化氢试剂数滴，或于琼脂斜面培养物上直接滴加过氧氢试剂，立即观察结果。如果产生气泡者为阳性反应，不产生气泡者则为阴性反应。3.

48、3微生物鉴定技术过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验4. 2 注意事项试验用的培养基、载玻片不得含有血液或其它体液，因红细胞含有过氧化氢，易造成假阳性反应。本试验必须用 18-24h 的培养物，因陈旧培养可能丧失酶活性，出现假阴性反应。试验时，勿先加过氧化氢试剂再加菌，更不能用无菌接种环将菌苔与过氧化氢试剂相混合。试验时，应以已知阳性菌株作对照。4.3试验结束后，所有器具均需进行灭菌处理后销毁。3.3微生物鉴定技术血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验1. 1. 原理及目的原理及目的血浆凝固酶是一种能使血浆凝固的酶类物质。致病性的葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白，附着于细菌表面，形成凝块。葡萄球菌产生的

49、凝固酶有两种，一种是与细胞壁结合的结合凝固酶，它直接作用于血浆中的纤维蛋白原，使发生沉淀，可用玻片法测定；另一种是由菌体生成后释放于培养基中，叫做游离凝固酶，它能使血浆中的凝固酶反应因子形成类似凝固酶的物质，间接地使纤维蛋白原转变成纤维蛋白，可由试管法测定。金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，该酶具有抗原性，能和兔血浆结合形成一种稳定的结合物，使血浆凝固，而其它的葡萄球菌没有该特性，所以可以用该反应来确认金黄色葡萄球菌的存在。在实验室一般采用试管法进行测定。2. 2. 范围范围适用于微生物检验室金黄色葡萄球菌的确认。3. 3. 试验器具及试剂试验器具及试剂兔血浆（置2-8冰箱内或依据说明书储存）、无菌

50、水、CSB（胰酪胨大豆肉汤培养基）3.3微生物鉴定技术血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验4. 4. 试验程序试验程序4.1 打开一瓶兔血浆，以无菌方式吸取1.5ml 无菌水加入瓶内，摇匀直至完全溶解。4.2 取三支无菌试管，每支试管分装0.5ml 兔血浆，进行以下试验：用无菌接种环挑取纯化后的菌株，置其中一支试管（或加入可疑菌株的CSB 培养物0.5ml），作为供试品管。接种金黄色葡萄球菌少许置第二支试管（或金黄色葡萄球菌CSB 培养物0.5ml），作为阳性对照管。第三支试管中不加任何培养物，作为阴性对照管。（备注：当阳性管和阴性管加入肉汤类培养物时，阴性管同样加入0.5mlCSB）将这三支试管同时

51、置36361 1培养箱（最好将试管置于盛少量水的烧杯中），3小时后开始观察，随后间断的进行观察至 24 小时。检查时，将试管轻轻倾斜，仔细观察，阴性对照管血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，供试品管血浆凝固者为阳性，否则为阴性。阳性对照管和阴性对照管中任何一管不符合要求者，应重新进行试验。3.3微生物鉴定技术革兰氏染色革兰氏染色1.1.原理原理该染色法可以将细菌分为G- 菌和G+ 菌，主要是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同所决定的。G- 菌的细胞结构较为简单，染色后易被脱色，再经复染液染色后成红色。G+ 细菌细胞壁结构较为复杂，因此仍保留初染时的紫色。2 2、范围范围适用于微生物检验室细菌

52、革兰氏阴阳性菌的鉴定。3 3、相关、相关试剂试剂结晶紫溶液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复染液、香柏油4 4、试验程序试验程序涂片：用接种环挑取1环纯化水至洁净载玻片上，在平板上挑取一个单菌落，与纯化水混合均匀，涂布于载玻片上，尽可能涂布均匀，且不要太厚，空气中自然干燥菌液。（如果样品来自肉汤培养基中，直接挑取1-2环肉汤培养物至洁净载玻片上，不需要涂布开，空气中自然干燥菌液。）3.3微生物鉴定技术革兰氏染色革兰氏染色固片：涂布经火焰固定。手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通过3次（用手指触摸涂片反面，以不烫手为宜）。待冷却后再染色。此步目的有两个，一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片，二

53、是增加其对染料的亲和力。固定时尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。初染：加结晶紫溶液约染一分钟，水洗。媒染：加碘液约染一分钟，水洗。脱色：加脱色剂乙醇时要注意不时摇动载玻片约10-30秒，至无紫色脱落为止，水洗。复染：加复染液约染一分钟，水洗。油镜镜检：在载玻片上滴加香柏油，仔细观察其颜色、形态，革兰氏阳性菌为暗紫色至紫色，革兰氏阴性菌为红色至淡红色。 3.2微生物鉴定技术革兰氏染色革兰氏染色5 5、注意事项注意事项涂片时可以采用三区涂片法，即在一个载玻片上同时进行两种阴阳性菌的染色，中间为二者的混合，以便于很好的区分阴阳性。革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如果脱色时间过长，革兰氏阳性菌

54、可能被脱色，误认为是革兰氏阴性菌。反之脱色时间过短也会造成误差。脱色时间还受涂片的厚薄、脱色时玻片的晃动以及乙醇用量多少等因素。所以此项实验一般要用已知的革兰氏阴阳菌做练习，掌握脱色时间。染色过程中勿使染液干涸。用水冲洗后，应甩干玻片上残留的水，以免染色液倍稀释而影响染色效果。选用培养18-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使结果颠倒。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。3.3微生物鉴定技术革兰氏染色革兰氏染色流程图：流程图：3.3微生物鉴定技术芽孢染色芽孢染色1 1、原理原理芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的一个圆形或椭圆形的休眠体，它对不良环境具有很强的抗性，在适合

55、的条件下又会吸水萌发，重新形成一个新的菌体。所以芽孢具有厚而密的壁，透性低，不易着色。根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点，除采用着色力强的染料外，还需要加热，以促使芽孢着色，菌体脱色。芽孢上的染料难以渗出，故经过脱色后还会保留原来的颜色，对菌体可以再采用一种对比度比较强的染料对其进行复染，是使二者呈现不同的颜色便于观察。一般实验室采用的是芽孢染后呈绿色，菌体呈红色。2 2、范围范围适用于微生物检验室细菌是否有芽孢的鉴定。3 3、相关、相关试剂试剂石炭酸复红染液（A液）、95%酒精（B液）、碱性美兰液（C液）3.3微生物鉴定技术芽孢染色芽孢染色4 4、试验程序试验程序涂片：用接种环

56、挑取1环蒸馏水至洁净载玻片上，在平板上挑取一个单菌落，与蒸馏水混合均匀，涂布于载玻片上，尽可能涂布均匀，且不要太厚，空气中自然干燥菌液。（如果样品来自肉汤培养基中，直接挑取1-2环肉汤培养物至洁净载玻片上，不需要涂布开，空气中自然干燥菌液。）滴加A液于涂片上，并于玻片上缓缓加热，使染液冒蒸气但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，从冒蒸气开始计时保持5min。涂片冷却后，倾去染液，用B液脱色至无红色染剂洗脱为止，水洗。用C液复染2-3min，水洗，吸干。油镜镜检：在载玻片上滴加香柏油，仔细观察其颜色，辨别是否有芽孢。芽孢呈绿色，菌体呈红色。四、制药用水的检验及修订内容制药用水由符合国家标

57、准的饮用水制得，分为纯化水和灭菌注射用水。其检测标准收载在15版药典中关于纯化水、灭菌注射用水项下的规定。制水系统应该经过验证，并建立日常监控、检测和报告制度，有完善的记录备查；制药用水系统应定期进行清洗和消毒，消毒可以采用热处理或化学处理；采用的消毒方法以及化学处理后消毒剂的去除应经过验证。四、制药用水的检验及修订内容检测方法的修订：项目项目15版药典版药典10版药典版药典检测方法1、取本品不少于1ml，采用薄膜过滤法处理后，采用R2A琼脂培养基，30-35培养不少于5天，依法检查；2、需氧菌总数每1ml供试品不得超过100cfu1、取本品，采用薄膜过滤法处理后，用营养琼脂玫瑰红钠琼脂进行检查；2、细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得超过100个备注具体要求以15版药典为准五、药品微生物实验室规范指导原则增修订内容（原药典附录中内容）1 1、名称修改、名称修改：由“药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则”修订为“药品微生物实验室质量管理指导原则药品微生物实验室质量管理指导原则