大二下生物技术前沿讲座2012

1、1纳米生物技术纳米生物技术JiLin University 授课教师：徐力 教授2第一部分：绪论第一部分：绪论第二部分：纳米材料用于生物检测第二部分：纳米材料用于生物检测第三部分：纳米技术在免疫层析中的应用第三部分：纳米技术在免疫层析中的应用第四部分：磁性纳米材料在生物技术中的应用第四部分：磁性纳米材料在生物技术中的应用主要内容3 第一部分 绪论 返回4Contents 纳米的基本概念纳米的基本概念 纳米科技将改变我们什么纳米科技将改变我们什么 纳米生物技术的研究内容纳米生物技术的研究内容纳米材料与纳米结构纳米材料与纳米结构5纳米的基本概念和内涵纳米的基本概念和内涵纳米的概念全新的认识方法和实

2、践模式6D.M. Eigler, E.K. Schweizer. Positioning single atoms with a scanning tunneling microscope. Nature 344, 524-526 (1990).7STM89Title: Atom Media: Iron on Copper (111) Title : Carbon Monoxide Man Media : Carbon Monoxide on Platinum (111)10核酶二级结构11pBR322 DNA的原子力显微镜(AFM)像12水溶胶中氯化银粒子的透射电镜照片和电子衍射图水溶胶中氯

3、化银粒子的透射电镜照片和电子衍射图TEM micrograph (a) and ED Pattern (b) of AgCl nanoparticles in hydrosol13有机溶胶中氯化银粒子的透射电镜照片有机溶胶中氯化银粒子的透射电镜照片和电子衍射图和电子衍射图TEM micrograph (a) and ED Pattern (b) of AgCl nanoparticles in organosol14纳米材料与纳米结构纳米材料与纳米结构纳米材料：颗粒尺寸在纳米材料：颗粒尺寸在1-100nm1-100nm的范围内的的范围内的超微粒材料超微粒材料 。纳米材料：（广义上）是指在三维空

4、间中纳米材料：（广义上）是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构成的材料。为基本单元构成的材料。 15纳米材料的基本单元分为三类：纳米材料的基本单元分为三类：（I I）零维，指在空间三维尺度均在纳米尺度，如，纳）零维，指在空间三维尺度均在纳米尺度，如，纳米颗粒、原子团簇等；米颗粒、原子团簇等；（IIII）一维，指在空间有两维处于纳米尺度，如纳米）一维，指在空间有两维处于纳米尺度，如纳米丝、纳米棒、纳米管等；丝、纳米棒、纳米管等；（IIIIII）二维，指在三维空间中有一维在纳米尺度，如）二维，指在三维空间中有一维在纳米尺度，如超薄膜、多

5、层膜、超晶格等。超薄膜、多层膜、超晶格等。 16纳米结构纳米结构n纳米结构是以纳米尺度的物质单纳米结构是以纳米尺度的物质单元为基础，按一定规律构筑和营元为基础，按一定规律构筑和营造一个新的组装体系。造一个新的组装体系。n是原子和分子间借助共价键与非是原子和分子间借助共价键与非共价键组装的高级形式的集合体。共价键组装的高级形式的集合体。 17物理学家构建的纳米结构物理学家构建的纳米结构（1 1）人造原子（）人造原子（artificial atomsartificial atoms）与量子围栏（）与量子围栏（quantum corralquantum corral） Current image o

6、f 48-atom Fe ring constructed on the Cu (111) surface. 所谓人造原子是由一定数量的实际原子组成的聚集体，它们的尺寸小于100 nm，因此也是一种纳米结构。 18Title : Stadium Corral Media : Iron on Copper (111) Intrigued with the possibility of observing Quantum Chaos, the artists constructed a stadium shaped structure in the hopes of observing so-ca

7、lled scarring of the density distribution of the surface state electron density. No scarring was observed. The reason is that the electrons dont bounce around in the corral before they escape beyond it borders. The corrals are leaky.19Title : Rectangular Corral Media : Iron on Copper (111) 20(a) det

8、ection of the Kondo resonance localized around a single Co atom on Cu (111), (b) corresponding topographs of the experimental realizations employing Co atoms to corral two-dimensional electrons on Cu (111) and dI/dV maps acquired simultaneously with the corresponding topographs, (c) visualization of

9、 the quantum mirage. 在纳米尺度上构建人为排列的原子结构，以此作为电子的限域环境研究其量子限域行为。这种人造原子被称为量子围栏。 21化学家构建的纳米结构化学家构建的纳米结构 （1）超晶格纳米结构）超晶格纳米结构 Self-assembly of a linked network and bright-field TEM micrographs of monolayer films of 3.7-nm gold clusters supported on a thin flake of MoS2. (A) Unlinked array encapsulated by dod

10、ecanethiol. (B) Cluster network linked by 2.0 nm-long aryl dithiol. 22（2）超分子纳米结构）超分子纳米结构 Supramolecular nanostructures with well-defined shapes and sizes are likely to pack into predictable structures. Plates are likely to stack with a common stacking direction, and tube- or rodlike nanostructures w

11、ould tend to align uniaxially. 23Crystalline aggregates generated by the self-assembly of (A) crosses, (B) hexagons in an open network, and (C) hexagons close-packed. Panel (A) shows an extended two-dimensional square array formed from crosses having hydrophobic ends. Whitesides等人等人50 将分子自组装的思想扩展到介观

12、尺寸的领域将分子自组装的思想扩展到介观尺寸的领域，将尺寸在，将尺寸在110 mm之间的结构单元定向可控地组装成二维的之间的结构单元定向可控地组装成二维的阵列超结构阵列超结构 24（3）模板组装纳米结构）模板组装纳米结构 模板组装纳米结构即以有机分子或有模板组装纳米结构即以有机分子或有机分子的组装体为模板制备无机材料机分子的组装体为模板制备无机材料，以构建有机，以构建有机/无机复合的纳米结构。无机复合的纳米结构。 TEM images of molecular manipulated inorganic microstructures in nature 25TEM of three molec

13、ular manipulated microstructures of II-VI semiconductors: a colloidal crystal of CdSe nanocrystals covered by organic surfactants, a colloid of Cd(1-x)ZnxS punctured by a regular array of cavities templated by cylindrical molecular assemblies of surfactant molecules, and a lamellar particle with alt

14、ernating CdS and organic layers templated by an organic lamellar mesophase Artificial26纳米粒子和生物分子的尺寸范围纳米粒子和生物分子的尺寸范围 27生物体系中的纳米结构生物体系中的纳米结构 用用DNA分子本身分子本身构造出的纳米分子构造出的纳米分子图形图形中国的中国的“中中”字。字。范围：范围：450nm。 28利用纳米加工技术，按照分子设计的方法合成、复制成各种用途的生命零件，例如具有生物智能、运算速度更快的生物计算机；利用生物零件可以组装具有特定功能的纳米生物机器人 29Excitation trans

15、fer in the bacterial photosynthetic unit. The modeled photosynthetic unit showing the arrangement of its main pigment-protein complexes-namely, LH-II, LH-I and the photosynthetic reaction center (RC). Arrangement of bacteriochlorophylis and carotenoids in LH-II of Rs. Moliscbianum. 30（l l）在分子的水平上认识和

16、理解病变的机理）在分子的水平上认识和理解病变的机理 （2 2）大幅度提高医学诊断和疾病检测的精度）大幅度提高医学诊断和疾病检测的精度 （3 3）纳米医用机器人和完全可控制的体内显微手术）纳米医用机器人和完全可控制的体内显微手术 （4 4）特效的药物可以攻克和杀死任何肿瘤癌细胞和病毒）特效的药物可以攻克和杀死任何肿瘤癌细胞和病毒 （5 5）基因治疗）基因治疗 纳米科技将改变我们什么纳米科技将改变我们什么31n利用新兴的纳米技术来解决和研究生物学问题；利用新兴的纳米技术来解决和研究生物学问题；n利用生物大分子制造分子器件，模仿和制造类利用生物大分子制造分子器件，模仿和制造类似生物大分子的分子机器。

17、似生物大分子的分子机器。 纳米生物技术的研究内容纳米生物技术的研究内容32 第二部分第二部分纳米材料用于生物检测纳米材料用于生物检测33 一一 、纳米粒子和生物标记、纳米粒子和生物标记 二、金属纳米晶检测技术二、金属纳米晶检测技术 三、荧光量子点检测技术三、荧光量子点检测技术 主要内容主要内容34一一 、纳米粒子和生物标记、纳米粒子和生物标记1.生物标记及其标记物生物标记及其标记物2. DNA和蛋白质的物理化学特性和蛋白质的物理化学特性3. 可用于生物标记的纳米粒子可用于生物标记的纳米粒子35 -1.生物标记及其标生物标记及其标记物记物生物标记技术的原理是通过将具有标志性信号的材生物标记技术的

18、原理是通过将具有标志性信号的材料，如不同颜色的染料分子、能发射强荧光的分子料，如不同颜色的染料分子、能发射强荧光的分子、具有磁性或放射性的分子等，通过化学键或非共、具有磁性或放射性的分子等，通过化学键或非共价键和待识别的生物组织连接起来，从而直观地观价键和待识别的生物组织连接起来，从而直观地观察和分析被标记物的存在和变化。察和分析被标记物的存在和变化。36常见标记物及其检测方式常见标记物及其检测方式 标记物标记物检测方法检测方法标记物标记物检测方法检测方法57Co 125I 32P 碱性磷酸酯酶 -半乳糖苷酶 辣根过氧化物酶 FAD辅基 固体闪烁计数器固体闪烁计数器 固体闪烁计数器 显色 显色

19、 显色 显色 香豆素衍生物 荧光素 罗丹明衍生物 藻胆蛋白 Eu3螯合剂 Sm3 Tb3 荧光分析 荧光分析 荧光分析荧光分析 时间分辨荧光时间分辨荧光 时间分辨荧光 37Cell transfection image with GFPlipofectamine transfectioncalcium phosphate coprecipitation38GFPInto p19 cellsElectroporate transfection39一一 、纳米粒子和生物标记、纳米粒子和生物标记 2. DNA和蛋白和蛋白质的物理化学特性质的物理化学特性DNA的的Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列

20、因素有关： DNA的均一性的均一性 G-C之含量之含量介质中的离子强度介质中的离子强度40一一 、纳米粒子和生物标记、纳米粒子和生物标记 -3. 可用于生物标可用于生物标记的纳米粒子记的纳米粒子金属纳米粒子：金属纳米粒子：Au, Ag, Cu, Co等。等。半导体荧光纳米粒子：半导体荧光纳米粒子：II-VI族半导体中如族半导体中如CdSe、CdS、ZnS等和等和III-V族如族如InP、InAs等的纳米晶。等的纳米晶。 磁性纳米粒子：磁性纳米粒子：磁性磁性Fe3O4 ，Fe2O3 ，CoFe2O4 ，MnFe2O4 41单一粒子型单一粒子型: CdS, CdSe, CdTe,ZnCdSe核核-

21、壳型壳型: CdSe/CdS , CdSe/ZnS参杂型参杂型:ZnS:Cu , ZnS:Mn从纳米粒子的生长过程分类从纳米粒子的生长过程分类:42二、金属纳米晶检测技术二、金属纳米晶检测技术n1.金纳米粒子细胞染色金纳米粒子细胞染色n2.金属纳米晶用于核酸检测金属纳米晶用于核酸检测431.金纳米粒子细胞染色金纳米粒子细胞染色金纳米粒子的特点金纳米粒子的特点 胶体金胶体金1)1)粒子尺寸在粒子尺寸在1-100nm1-100nm区间内都可合成且方区间内都可合成且方法简便法简便, ,粒子稳定；粒子稳定；2)2)随粒径的变化呈现不同的颜色随粒径的变化呈现不同的颜色, ,从桔红色从桔红色到紫红色到紫红

22、色, ,有利于肉眼观察有利于肉眼观察 ；443)3)具有很高的电子密度，在电子显微镜下具具有很高的电子密度，在电子显微镜下具有很好的衬度；有很好的衬度；4)4)能够稳定而迅速地吸附蛋白质，而且蛋白能够稳定而迅速地吸附蛋白质，而且蛋白质的生物活性不发生明显地改变；质的生物活性不发生明显地改变；5)5)通过计量被检部分金颗粒通过计量被检部分金颗粒, ,可以对被检抗原可以对被检抗原或抗体进行免疫定量研究或抗体进行免疫定量研究. . 45光镜金银免疫金银染色标记细胞表面标志物的观察结果。(A) SiHa细胞中的HPV16病毒位置，HPV16是子宫颈癌的标志物， (B) 尖锐湿疣细胞中的HPV6/11病

23、毒，由于病毒大量感染，细胞被染成 深色46电镜下观察到的细胞纺锤形微管。 472.金属纳米晶用于金属纳米晶用于DNA检测检测几种常用的几种常用的DNA检验方法检验方法:DNA纹印技术纹印技术 DNA纹印技术的流程图如下：纹印技术的流程图如下： 生物样品 DNA提取 RE酶解 电泳 转移 分子杂交 洗膜 检测48A case; M：mother；C：child；1.2：two possible fathers A case of raped crime；1：victim; 2：sperm; 3.4.5：three suspects M C F1 F21 2 3 4 549原位杂交技术原位杂交技术

24、 PCRPCR技术技术50金属纳米晶用于金属纳米晶用于DNA检测检测 -利用金纳米晶的新型利用金纳米晶的新型DNA检测检测技术技术(Au)光学比色分析法 表面等离子体共振检测（Surface Plasmon Resonance） 表面增强拉曼检测（SERS） 电学检测法 其他的光学检测方法 51光学比色分析法光学比色分析法 DNADNA修饰的金纳米粒子比色检测示意图修饰的金纳米粒子比色检测示意图 52DNA连接的金纳米粒子在260 nm和700 nm处的吸收值随温度的变化 53(A）Au粒子修饰的DNA（）与纯DNA（）的熔化曲线的比较（B）Au粒子修饰的DNA的Northwestern斑点杂

25、交试验结果 54用于选择性分析的几种靶核苷酸和DNA修饰的金探针的碱基序列及对应的Northwestern斑点杂交实验结果。 （A）没有模板（B）一半互补的模板（C）全部匹配的模板（D）探针尾存在单碱基错配（E）模板尾存在单碱基错配（F）模板尾单碱基缺失（G）模板链上单碱基插入 由于碱基错配后DNA变性的温度将降低，除了全部匹配的模板在54.5时溶液颜色才从兰色变成红色外；其它存在错配的情况溶液在52.7时就已经变成红色，即DNA在较低的温度下解链。 55两种不同探针的DNA斑点测试结果（a）12.4 nm Ag/Au核壳粒子探针（b）13 nm Au探针：（）没有靶核苷酸（）室温存在靶核苷酸

26、（）58 C（超过DNA的杂交温度）下存在靶核苷酸 (a) (b)56三、荧光量子点检测技术三、荧光量子点检测技术n1. 新型荧光标记物n2.荧光纳米晶的合成n3.荧光纳米晶的表面修饰n4.荧光量子点标记物在生物成像中应用57荧光量子点又可称半导体量子点，荧光量子点又可称半导体量子点，简称为量子点（简称为量子点（Quantum DotsQuantum Dots），），是在受到光激发或加上电压后能够是在受到光激发或加上电压后能够产生强的荧光发射的一类纳米材料产生强的荧光发射的一类纳米材料, ,是纳米尺度是纳米尺度( (一般粒径范围在一般粒径范围在2 220 nm)20 nm)原子和分子的集合体。

27、原子和分子的集合体。II-II-VIVI族半导体中如族半导体中如CdSeCdSe、CdSCdS、ZnSZnS等等和和III-VIII-V族如族如InPInP、InAsInAs等的纳米晶等的纳米晶都是常见的荧光量子点。都是常见的荧光量子点。1. 新型荧光标记物新型荧光标记物58特点特点(1）量子点是无机半导体材料，其激发谱为连续谱带，而且发射谱较窄，通常大约在20 nm左右； （2）纳米晶的光稳定性要远高于有机染料分子，特别是核壳型纳米晶如CdSe /ZnS、CdSe/CdS等； （3）纳米晶可以通过调整粒子尺寸来得到不同颜色的荧光，而粒子的组成和表面性质无需改变，因此可以使用一套通用的偶联方法

28、实现多色标记 。59量子点标记过程示意图量子点标记过程示意图 60（A）荧光素的激发和发射谱；（B）CdSe量子点的激发和发射谱；（C）三种不同尺寸的量子点的荧光光谱。 612.荧光纳米晶的合成气相气相:气体冷凝法气体冷凝法,活性氢活性氢-熔融金属反应法熔融金属反应法,流动液面流动液面上真空蒸度法上真空蒸度法,通电加热蒸发法通电加热蒸发法,激光诱导化学气激光诱导化学气相沉积法等相沉积法等.液相液相( 有机相和水相有机相和水相) :沉淀法沉淀法, 喷雾法喷雾法,水热法水热法,溶剂挥发分解法溶剂挥发分解法, 溶胶凝溶胶凝胶法等胶法等.62HeatingMantleStir PlateTOPOArS

29、tockMain Problems:Extreme conditions Only for CdSeNot flexibleCd(CH3)2 + Se-TBP CdSe Nanocrystals300-360C90% TOPO沉淀法沉淀法-有机金属法有机金属法63Size, Shape, Optical-quality Control of CdSe Nanocrystals100nm100nmQuantum Rods100nm100nm100nm100nmQuantum RiceQuantum Trees50nm50nmQuantum DotsMonomer Concentration64R

30、ational Synthesis of Colloidal Nanocrystals1-100 nm diameterHighly crystallineCoated SurfaceSize Dependent PropertiesSSSSSSSS50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm50nm65Han et al., Nature Biotech 200166CdSeZnS67CdSe Core Size3.0nm3.5nm5.6nm6.4nm400600800Wavelength (nm)Absorbanc

31、e (a.u.)68Spectrophotometric TitrationpH 3.97pH 4.1269100 nm100 nmNiO100 nmCr2O3100 nmZnO50 nmMnOCo3O4Works for Other Oxide Nanocrystals100 nmFo3O4703.荧光纳米晶的表面修饰荧光纳米晶进行表面修饰的原因荧光纳米晶进行表面修饰的原因:1.表面缺陷往往充当电子和空穴的无辐射复合表面缺陷往往充当电子和空穴的无辐射复合中心，导致荧光量子产率的降低，因此在合中心，导致荧光量子产率的降低，因此在合成中和用于生物标记的过程中必须保证纳米成中和用于生物标记的过程中

32、必须保证纳米晶的表面不受到破坏，通过表面修饰在纳米晶的表面不受到破坏，通过表面修饰在纳米晶表面形成保护层，可以增强纳米晶的光稳晶表面形成保护层，可以增强纳米晶的光稳定性和化学稳定性。定性和化学稳定性。 2.水溶性是纳米晶用于生物标记必须解决的问水溶性是纳米晶用于生物标记必须解决的问题，许多常用荧光纳米晶均只能在有机溶剂题，许多常用荧光纳米晶均只能在有机溶剂中分散，因此必须选择适当的相转移剂将其中分散，因此必须选择适当的相转移剂将其转至水相中，同时还必须保证纳米晶的稳定转至水相中，同时还必须保证纳米晶的稳定性和荧光性质不变。性和荧光性质不变。71采用两种荧光量子点标记的的小鼠3T3纤维原细胞的荧

33、光显微照片 4.荧光量子点标记物在生物成像中应用72量子点标记细胞表面Her2，（A,C）采用单克隆抗Her2抗体，羊抗鼠IgG抗体量子点复合物标记的乳腺癌SK-BR-3细胞。（B,D）加入普通鼠IgG和羊抗鼠IgG抗体量子点复合物则不能实现标记 73量子点标记细胞核和微管的荧光显微镜照片。（A）采用抗核原抗体、生物素修饰的抗人IgG抗体和亲和素修饰的量子点（红色）标记鼠3T3细胞核；采用鼠抗微管蛋白抗体、生物素修饰抗鼠IgG抗体和亲和素修饰的量子点（绿色）标记细胞微管。（B）采用鼠抗Her2抗体和IgG量子点（绿色）标记细胞表面Her2；采用抗核原抗体，生物素修饰的抗人IgG抗体和亲和素修饰

34、的量子点（红色）标记细胞核。 74图1.28 量子点和染料光稳定性的比较。采用亲合素量子点（红）标记细胞核，用染料Alexa 488标记细胞微管，采用100 W汞灯持续照射3 min。量子点和染料光稳定性的比较。采用亲合素量子点（红）标记细胞核，用染料Alexa 488标记细胞微管，采用100 W汞灯持续照射3 min。 75量子点标记追踪甘氨酸受体在神经表面的移动。绿色点为标记量子点的甘氨酸受体，红色为神经突触，可以观察到b1处的一个受体（箭头处）逐渐移动至b2处的过程。 76双光子激发得到的毛细血管荧光图像。双光子激发得到的毛细血管荧光图像。（A A）量子点标记；（）量子点标记；（B B）

35、荧光素标记）荧光素标记 77 第三部分第三部分纳米技术在免疫层析中的应用纳米技术在免疫层析中的应用78第一代第一代: : 放射免疫方法放射免疫方法第二代第二代: : 酶联免疫方法酶联免疫方法第三代第三代: : 金标单克隆抗体快速检测试纸金标单克隆抗体快速检测试纸这种新兴检测技术已经可以检测多达一百多种抗原物质，可以这种新兴检测技术已经可以检测多达一百多种抗原物质，可以应用于各种传染病、早期癌症、性病、艾滋病、早早孕、排卵、应用于各种传染病、早期癌症、性病、艾滋病、早早孕、排卵、胎儿畸形早期检测等许多临床检测项目胎儿畸形早期检测等许多临床检测项目79抗体结构示意图抗体结构示意图 抗原抗体识别示意

36、图抗原抗体识别示意图 80金标免疫层析金标免疫层析(gold immunochromatographic assay (gold immunochromatographic assay 简称简称GICA)GICA)是以是以金纳米晶作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种免金纳米晶作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术。疫标记技术。 原理是将待测试液滴入试条时，待测液体原理是将待测试液滴入试条时，待测液体样品通过毛细管作用在条状纤维制成的膜样品通过毛细管作用在条状纤维制成的膜上向前移动，将金纳米晶带到吸附有抗体上向前移动，将金纳米晶带到吸附有抗体的测试线（或捕获线）

37、上，若试液中的抗的测试线（或捕获线）上，若试液中的抗原与此抗体相对应，则产生特异性结合，原与此抗体相对应，则产生特异性结合，金纳米晶滞留在测试线上，呈红色或紫红金纳米晶滞留在测试线上，呈红色或紫红色，称阳性；反之不显色，称阴性。色，称阳性；反之不显色，称阴性。 一、金标试纸一、金标试纸81 目前常规的检测方法金标试纸法 酶标法、凝集法、印迹法HIV唾液检测试纸检测项目HIV抗体HIV抗体检测样本血液（不便、痛苦、有交叉感染风险）唾液（方便、无痛苦、无感染风险）检测时间平均一天510分钟检测费用1001000元35元操作复杂、需专业人员简单、不需专业训练仪器专有仪器不需任何仪器使用范围医院及专门

38、机构任何单位、个人隐私保护度低高准确率 99% 99%金标试纸法金标试纸法与酶标法的与酶标法的比较比较 82免疫层析试验原理示意图免疫层析试验原理示意图 双抗体夹心法双抗体夹心法 83利用金标免疫层析检测组织转谷氨酰胺酶抗体利用金标免疫层析检测组织转谷氨酰胺酶抗体 金金 标标 试试 纸纸84金标试纸的结构和外观示意图金标试纸的结构和外观示意图85国外生产的金标免疫层析产品已达国外生产的金标免疫层析产品已达3030余种，余种，可检测的待测物包括可检测的待测物包括人绒毛膜促性腺激素（人绒毛膜促性腺激素（HCGHCG）、）、促黄体生成激素（促黄体生成激素（LHLH）、）、促卵泡生成激素（促卵泡生成激

39、素（FSHFSH）、）、A A族乙型溶血性链球菌（族乙型溶血性链球菌（StrepAStrepA）、）、乙型肝炎表面抗原（乙型肝炎表面抗原（HbsAgHbsAg）、）、甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）、）、前列腺特异抗原（前列腺特异抗原（PSAPSA）、）、苯丙胺（苯丙胺（AITlphetamineAITlphetamine）、可卡因）、可卡因（CocaineCocaine）、大麻（）、大麻（MaruuanMaruuan）、吗啡、海）、吗啡、海洛因等。洛因等。国内市售的金标免疫层析产品多为进口国外国内市售的金标免疫层析产品多为进口国外散件国内组装或直接代销的国外产品。国产散件国内组装或直接代销

40、的国外产品。国产材料制成的成型产品较少，主要是材料制成的成型产品较少，主要是HCGHCG试纸、试纸、HBSAgHBSAg试纸、试纸、AFPAFP测试等测试等 86金纳米晶微观结构示意图金纳米晶微观结构示意图（金核（金核/ /吸附层吸附层/ /扩散层）扩散层） 二、金纳米晶的制备二、金纳米晶的制备金纳米晶是由一个基础金核金纳米晶是由一个基础金核（原子金（原子金AuAu）及包围在外的双）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（的是内层负离子（AuCl2-AuCl2-），），外层离子层外层离子层H+ H+ 则分散在胶体则分散在胶体间溶液中，以维持金纳米晶的间

41、溶液中，以维持金纳米晶的稳定状态稳定状态 金纳米晶粒径（金纳米晶粒径（101070nm70nm）与）与最大吸收峰之间呈线性相关，最大吸收峰之间呈线性相关，基本符合如下直线回归方程：基本符合如下直线回归方程：Y Y0.4271X0.4271X514.56 514.56 87金纳米晶的金纳米晶的TEMTEM照片：照片： 13 131nm1nm（左）；（左）；25251nm1nm（右）（右） 88柠檬酸三钠柠檬酸三钠（mlml）0.300.300.450.450.700.701.001.001.501.502.002.00金纳米晶颜色金纳米晶颜色蓝灰蓝灰紫灰紫灰紫红紫红红红橙红橙红橙橙粒径粒径 (n

42、m) (nm)14714797.597.571.571.5414124.524.51515100 ml 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金纳米晶粒径的影响对金纳米晶粒径的影响 89金纳米晶标记金纳米晶标记蛋白过程蛋白过程 90 新型纳米晶标记的免疫层析技术新型纳米晶标记的免疫层析技术 存在的问题存在的问题（1 1）检测灵敏度低：目前广泛使用的金标试纸）检测灵敏度低：目前广泛使用的金标试纸的灵敏的灵敏 度只能达到度只能达到1 ng/ml1 ng/ml，不能满足临床检测的，不能满足临床检测的需要；需要；（2 2）检测准确率低：在免疫层析试纸检测过程）检测准确率低

43、：在免疫层析试纸检测过程中经常中经常 出现假阳性和漏检的情况；出现假阳性和漏检的情况；（3 3）无法定量检测：目前绝大多数的免疫层析）无法定量检测：目前绝大多数的免疫层析试纸只试纸只 能用于定性和半定量检测，难于使用仪器能用于定性和半定量检测，难于使用仪器实现定量检测；实现定量检测；（4 4）检测指标单一：通过对单一标记物聚集颜）检测指标单一：通过对单一标记物聚集颜色的肉眼观察，色的肉眼观察， 很难实现多个指标的同时检测。很难实现多个指标的同时检测。 91金纳米晶分别经过金纳米晶分别经过HAuCl4HAuCl4和和NH2OHNH2OH水溶液一次水溶液一次( B )( B )和两次和两次( C

44、)( C )增强后的增强后的TEMTEM照片和免疫斑点实验示意图照片和免疫斑点实验示意图 一、新型金标免疫层析试纸的研制一、新型金标免疫层析试纸的研制 92基于银增强的金标免疫电化学检测示意图基于银增强的金标免疫电化学检测示意图 在酸性介质中用溴化氢作为银的氧化剂将沉积的银氧化释放，使银以银离子状态在酸性介质中用溴化氢作为银的氧化剂将沉积的银氧化释放，使银以银离子状态存在于溶液中。这主要考虑到银溶出时生成的存在于溶液中。这主要考虑到银溶出时生成的Ag+Ag+离子与加入的溴离子生成离子与加入的溴离子生成AgBrAgBr沉淀，随后又与过量的溴离子生成沉淀，随后又与过量的溴离子生成AgBr2-AgB

45、r2-络合物，加快了溶出反应的进行。络合物，加快了溶出反应的进行。因为银的沉积是以金纳米晶为核，所以与金纳米晶的量成正比，这样就可以通过因为银的沉积是以金纳米晶为核，所以与金纳米晶的量成正比，这样就可以通过阳极溶出伏安法检测银离子的量从而达到检测待测物抗原的目的阳极溶出伏安法检测银离子的量从而达到检测待测物抗原的目的 93不同尺寸的半导体纳米晶的发射光谱不同尺寸的半导体纳米晶的发射光谱(A)(A)；不同尺寸的半导体纳米晶在水溶液中的颜色照片不同尺寸的半导体纳米晶在水溶液中的颜色照片(B) (B) 二、荧光纳米晶标记的免疫层析试纸二、荧光纳米晶标记的免疫层析试纸 94荧光纳米晶探针标记免疫层析纸

46、条实验荧光纳米晶探针标记免疫层析纸条实验 第一，用复合纳米晶直接爬纸条时，在控制带上可以观察到荧光，说明复合纳米晶与抗第一，用复合纳米晶直接爬纸条时，在控制带上可以观察到荧光，说明复合纳米晶与抗抗体发生了相互作用抗体发生了相互作用(a)(a)；第二，将复合纳米晶与抗体对接并用；第二，将复合纳米晶与抗体对接并用BSABSA封闭，然后再爬纸条，封闭，然后再爬纸条，在控制带上又观察到了荧光，这是抗体与抗抗体进行特异性识别所引起的在控制带上又观察到了荧光，这是抗体与抗抗体进行特异性识别所引起的(b)(b)；第三，；第三，用用BSABSA对复合量子点表面进行封闭，这时再爬纸条，在控制带上看不到荧光，说明

47、对复合量子点表面进行封闭，这时再爬纸条，在控制带上看不到荧光，说明BSABSA已已经将复合量子点封闭经将复合量子点封闭c c。 a b c95磁性纳米晶免疫层析实验模拟图磁性纳米晶免疫层析实验模拟图 三、磁性纳米晶标记的免疫层析试纸三、磁性纳米晶标记的免疫层析试纸 检测的灵敏度达到检测的灵敏度达到0.02 pg/ml0.02 pg/ml。96Fe3O4/Fe3O4/葡聚糖葡聚糖/ /抗体磁性纳米生物探针的形成机制抗体磁性纳米生物探针的形成机制( (左左) )； BSA BSA包覆的磁性葡聚糖包覆的磁性葡聚糖/IgG/IgG生物探针的层析实验（右）生物探针的层析实验（右）AB97 磁性葡聚糖标记

48、的鼠源单克隆乙肝病毒表面抗原抗体磁性葡聚糖标记的鼠源单克隆乙肝病毒表面抗原抗体(IgGH)(IgGH)在抗抗体在抗抗体(anti-(anti-IgGH)IgGH)修饰的镀金的硅基底上的组装过程修饰的镀金的硅基底上的组装过程硫辛酸硫辛酸98免疫层析试纸反应免疫层析试纸反应A : F e 3 O 4 / ( P E 3 / C d T e ) 3 / P E 4 , b : A : F e 3 O 4 / ( P E 3 / C d T e ) 3 / P E 4 , b : Fe3O4/(PE3/CdTe)3/PE4/IgGH, Fe3O4/(PE3/CdTe)3/PE4/IgGH, C: Fe

49、3O4/(PE3/CdTe)3/PE4/IgGH/BSA. C: Fe3O4/(PE3/CdTe)3/PE4/IgGH/BSA. a b c磁性和荧光功能磁性和荧光功能 于一体的粒子于一体的粒子99第四部分磁性纳米材料在生物技术中的应用100101体相磁性材料体相磁性材料磁性纳米材料磁性纳米材料磁磁 性性超薄膜超薄膜/多层膜多层膜磁磁 性性纳米棒纳米棒/丝丝102n单磁畴单磁畴n超顺磁性超顺磁性 n磁化率磁化率n矫顽力矫顽力n居里温度居里温度n磁相变温度磁相变温度n表面磁结构表面磁结构n天然磁性纳天然磁性纳n 米粒子米粒子n人工合成磁人工合成磁n 性纳米粒子性纳米粒子n金属金属n合金合金n金属

50、氧化物金属氧化物103天然磁性纳米粒子天然磁性纳米粒子104有机小分子有机小分子有机高分子有机高分子SiO2其它无机材料其它无机材料105l生物法生物法 主要由生物体内提取。所得粒子大小均匀、不团主要由生物体内提取。所得粒子大小均匀、不团 l 聚、易降解、无毒、生物相容性好。制备的磁性聚、易降解、无毒、生物相容性好。制备的磁性 l 纳米粒子的种类和尺寸都有限，且很难大量制备。纳米粒子的种类和尺寸都有限，且很难大量制备。l l物理法物理法 主要代表是机械粉碎法。简单。所得粒子尺寸分主要代表是机械粉碎法。简单。所得粒子尺寸分l 布较宽、易团聚、耗时耗能、有粉碎极限。布较宽、易团聚、耗时耗能、有粉碎

51、极限。 l化学法化学法 主要代表是共沉淀法、高温分解法和微乳液法。主要代表是共沉淀法、高温分解法和微乳液法。l 粒子种类、尺寸、形态、表面性质等方面的可控粒子种类、尺寸、形态、表面性质等方面的可控l 优于生物法和物理法性，且成本更低。优于生物法和物理法性，且成本更低。106SupersaturationNucleationGrowthTimeSolute Concentration制备单分散纳米粒子的制备单分散纳米粒子的Lamer “成核扩散控制模型成核扩散控制模型 107均相反应体系均相反应体系成核过程（过饱和度较大）成核过程（过饱和度较大）生长过程生长过程 （过饱和度较小）（过饱和度较小）

52、过饱和度过饱和度= = 组成粒子物质的浓度（组成粒子物质的浓度（c c）- - 溶解度（溶解度（s s）108均相反应体系均相反应体系 ：共沉淀方法，高温分解方法共沉淀方法，高温分解方法 非均相反应体系非均相反应体系 ：微乳液和反相胶束法微乳液和反相胶束法 ， 超声化学法超声化学法 109 1. 共沉淀法共沉淀法1. Fe(II)-(部分氧化）部分氧化）-Fe(III)2. Fe(III)-(部分还原）部分还原）-Fe(II)3. Fe(II)， Fe(III)-同时水解同时水解操作简便、反应条件温和。但产物难控制。操作简便、反应条件温和。但产物难控制。 110111 2. 高温分解法高温分解

53、法在高沸点有机溶剂中在高沸点有机溶剂中1.反应原料（易分解的有机金属化合物）反应原料（易分解的有机金属化合物）-快速快速注入高温溶剂（表面活性剂）快速成核，反应温注入高温溶剂（表面活性剂）快速成核，反应温度和时间的控制度和时间的控制-粒子；粒子；2.反应原料（低温条件）反应原料（低温条件）-预先混合预先混合-缓慢加缓慢加热至反应开始热至反应开始-不断补加反应原料不断补加反应原料-恒定的过恒定的过饱和浓度饱和浓度-窄粒度分布的粒子。窄粒度分布的粒子。 具有粒度分布窄，尺寸和形貌可控等特点具有粒度分布窄，尺寸和形貌可控等特点 ，粒子的疏水，粒子的疏水性却大大限制了它们在生物医学领域的应用性却大大限

54、制了它们在生物医学领域的应用 112高温分解法制备的高温分解法制备的-Fe2O3 (a), Co (b) -Fe2O3 (a), Co (b) 纳米粒子及其纳米粒子及其CoCo纳米棒纳米棒 (c) (c) 的的TEMTEM图图 2.2.高温分解法高温分解法113高温分解法制备的高温分解法制备的FeFe纳米粒子（纳米粒子（a a）, Fe, Fe纳米棒（纳米棒（b b）及）及-Fe2O3-Fe2O3纳米粒子纳米粒子（c c）的）的TEM TEM 图图 高温分解法制备的高温分解法制备的Fe3O4 Fe3O4 纳米粒子纳米粒子(a), CoFe2O4(a), CoFe2O4纳米粒子纳米粒子(b)(b

55、)以及以及MnFe2O4(c)MnFe2O4(c)纳米粒子的纳米粒子的TEMTEM图图 114高温分解法制备的水溶性高温分解法制备的水溶性Fe3O4Fe3O4纳米纳米粒子的粒子的TEMTEM图图115微乳液和反相胶束法是利用由水、油和表面活性微乳液和反相胶束法是利用由水、油和表面活性剂三元体系形成的微乳液或反相胶束作为反应场剂三元体系形成的微乳液或反相胶束作为反应场所制备纳米粒子的方法。所制备纳米粒子的方法。表面活性剂表面活性剂-1 1）阻止纳米粒子的聚集和进一步生长，从而实）阻止纳米粒子的聚集和进一步生长，从而实现对粒子尺现对粒子尺 寸的有效控制；寸的有效控制；2 2）可以为粒子提供可溶解性

56、或可分散性。）可以为粒子提供可溶解性或可分散性。3 3）可以自发地形成尺寸均一的自组装结构）可以自发地形成尺寸均一的自组装结构 ，形，形状及其极性基团的大小对胶束的形状有着重要影状及其极性基团的大小对胶束的形状有着重要影响响 尺寸分布及其形貌控制方面有优势，结晶度和磁尺寸分布及其形貌控制方面有优势，结晶度和磁响应性等方面还有待于提高响应性等方面还有待于提高 3. 微乳液和反相胶束法微乳液和反相胶束法116 4. 超声化学法超声化学法超声化学法是利用超声波的空化作用瞬间产生超声化学法是利用超声波的空化作用瞬间产生的高温（的高温（5000 K5000 K）、高压（）、高压（20 MPa20 MPa

57、）以及极）以及极高的冷却速率（高的冷却速率（1010 Ks-11010 Ks-1）等极端条件促使）等极端条件促使氧化、还原、分解和水解等反应的进行来制备氧化、还原、分解和水解等反应的进行来制备纳米粒子纳米粒子 粒子的成核和生长过程受活性物种的生成和扩散等因素的粒子的成核和生长过程受活性物种的生成和扩散等因素的影响，因此该方法在纳米粒子的尺寸和形貌控制方面仍有影响，因此该方法在纳米粒子的尺寸和形貌控制方面仍有待于进一步提高，此外，此方法制备的纳米粒子还存在结待于进一步提高，此外，此方法制备的纳米粒子还存在结晶度相对较低的问题晶度相对较低的问题 117超声分解法制备的超声分解法制备的FeFe纳米粒

58、子的纳米粒子的TEMTEM图图 118二二 磁性纳米粒子的表面修饰磁性纳米粒子的表面修饰 表面修饰方法：表面修饰方法：119天冬氨酸或谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酸、2, 3-2, 3-二巯基丁二酸、柠二巯基丁二酸、柠檬酸、磷酰维生素檬酸、磷酰维生素B B、-环糊精等环糊精等 对于油溶性的磁性纳米粒子，通常可采用下述两种方法实对于油溶性的磁性纳米粒子，通常可采用下述两种方法实现其水溶性和生物相容性：现其水溶性和生物相容性：（1 1）通过修饰剂与稳定剂之间的特殊相互作用实现粒子溶）通过修饰剂与稳定剂之间的特殊相互作用实现粒子溶 液的水溶性。液的水溶性。（2 2）通过配体交换反应实现粒子溶液的水溶性。）

59、通过配体交换反应实现粒子溶液的水溶性。 120天然高分子天然高分子葡聚糖、淀粉、多肽和蛋白等；葡聚糖、淀粉、多肽和蛋白等；合成高分子合成高分子聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、聚乙烯醇（）、聚乙烯醇（PVAPVA）、聚乙二醇）、聚乙二醇聚乳酸（聚乳酸（PEG-PLAPEG-PLA）、聚（）、聚（N-N-异丙基丙烯酰胺）及异丙基丙烯酰胺）及其共聚物等其共聚物等 121举例举例1 葡聚糖葡聚糖 共沉淀方法共沉淀方法 Fe3O4粒子粒子 表氯醇表氯醇 交联反应交联反应 交联聚合物交联聚合物 浓氨水浓氨水表面带有氨基的磁性表面带有氨基的磁性纳米粒子纳米粒子122举例举例2去铁铁蛋白去铁铁蛋白（Apo

60、ferritinApoferritin） 硫酸亚铁铵硫酸亚铁铵 三甲胺氮氧化物三甲胺氮氧化物 蛋白修饰蛋白修饰Fe3O4粒子粒子123高温分解方法制备的磁性纳米粒子表面一般都以带有长烷基链的两亲性高温分解方法制备的磁性纳米粒子表面一般都以带有长烷基链的两亲性分子作为稳定剂，一般采用置换反应，除去稳定剂，增加水溶性。分子作为稳定剂，一般采用置换反应，除去稳定剂，增加水溶性。 举例举例3四甲胺基氢氧化四甲胺基氢氧化铵（铵（TMAOHTMAOH） 油油 酸酸 水溶性的磁性水溶性的磁性纳米粒子纳米粒子 LysLys与与AspAsp的的嵌段共聚物嵌段共聚物 聚合物胶团聚合物胶团 相转移前后相转移前后(a