微生物学实验5-2-cmx2011

1、点评 1.菌落菌落-不称为点点或颗粒物。不称为点点或颗粒物。 2. 结果描述条理应该清晰，而不是简单的堆砌。结果描述条理应该清晰，而不是简单的堆砌。 3. 设计题完成情况不理想。设计题完成情况不理想。 4.显微镜使用，显微镜使用， 复位，清洁、签字（尼康）。复位，清洁、签字（尼康）。实验5 革兰氏染色法荚膜染色 一、实验目的一、实验目的v目的：目的：v1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术巩固显微镜操作技术及无菌操作技术;v2.学习革兰氏染色法以及荚膜染色法；学习革兰氏染色法以及荚膜染色法；v3.掌握染色原理。掌握染色原理。二、原理二、原理v革兰氏染色法革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性

2、菌可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌和革兰氏阴性菌(G )两大类，是细菌学上是常用的鉴两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。别染色法。v该染色法所以能将细菌分为该染色法所以能将细菌分为G菌和菌和G菌，是由这两类菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。vG菌细胞壁中肽聚糖层厚（菌细胞壁中肽聚糖层厚（20-80nm，15-50层）且交层）且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜

3、色。颜色。 vG菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄且肽聚糖层较薄(10nm,2-3层层)、交联度低，故用乙醇或、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。色，再经番红复染后就成红色。金黄色葡萄球菌革兰氏染色图金黄色葡萄球菌革兰氏染色图大肠杆菌革兰氏染色图大肠杆菌革兰氏染色图革兰氏染色的实际意义革兰氏染色的实际意义v(1)鉴别细菌鉴别

4、细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大用此染色法可将所有细菌分为两大类类,这样可将致病菌的范围缩小这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定然后再进一步鉴定. (2)选择药物选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏因而对抗菌素等药物的敏感度不一感度不一.例如大多数阳性菌对青霉素敏感，大多数例如大多数阳性菌对青霉素敏感，大多数阴性菌对青霉素不敏感阴性菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外脑膜炎球菌等除外),可供临可供临床实践中选用抗菌药物的参考床实践中选用抗菌药物的参考. (3)与致病性的关系与致病性的关

5、系:大多数革兰氏阳性菌的致病大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为内毒素。质主要为内毒素。v荚膜荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，含水量大，其他成分多为多胶质状物质，含水量大，其他成分多为多糖、多肽或糖蛋白。糖、多肽或糖蛋白。v细菌荚膜染色细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，且易被水洗去，的亲和力弱，不易着色，且易被水洗去，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从

6、而使荚膜在和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在在90以上，固染色时一般不加热固定，以上，固染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。以免荚膜皱缩变形。v荚膜功能：荚膜功能： 抗吞噬作用：荚膜因其亲水性及其空间占位、屏障作用，抗吞噬作用：荚膜因其亲水性及其空间占位、屏障作用，可有效抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用。可有效抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用。 粘附作用：荚膜多糖可使细菌彼此间粘链，也可粘附于粘附作用：荚膜多糖可使细菌彼此间粘链，也可粘附于组织细胞或无生命物体表面，是引起感染的重要因素。组织细胞或无生命物体表面，是引起感染的重

7、要因素。 抗有害物质的损伤作用：处于细菌细胞最外层，荚膜犹抗有害物质的损伤作用：处于细菌细胞最外层，荚膜犹如盔甲可有效保护菌体免受或少受多种杀菌、抑菌物质的如盔甲可有效保护菌体免受或少受多种杀菌、抑菌物质的损伤，如溶菌酶、补体等。损伤，如溶菌酶、补体等。 抗干燥作用：荚膜多糖为高度水合分子，含水量在抗干燥作用：荚膜多糖为高度水合分子，含水量在95%以上，可帮助细菌抵抗干燥对生存的威胁。以上，可帮助细菌抵抗干燥对生存的威胁。v荚膜用途荚膜用途:用于菌种鉴定、用作药物和生化试剂、用作工业原料等。有用于菌种鉴定、用作药物和生化试剂、用作工业原料等。有荚膜的菌形成的菌胶团对污水中的污染物有极强的吸附、

8、荚膜的菌形成的菌胶团对污水中的污染物有极强的吸附、降解的作用。降解的作用。v形成条件：形成条件： 荚膜的形成与环境条件密切相关。一般在动荚膜的形成与环境条件密切相关。一般在动物体内或含有血清或糖的培养基中容易形成物体内或含有血清或糖的培养基中容易形成荚膜，在普通培养基上或连续传代则易消失。荚膜，在普通培养基上或连续传代则易消失。v产荚膜的细菌形成的菌落一般具有直径产荚膜的细菌形成的菌落一般具有直径较大较大，无色透明，无色透明，隆起隆起明显，用接种环挑取时可明显，用接种环挑取时可拉拉出粘丝出粘丝等特点。等特点。 三、实验材料v革兰氏染色：革兰氏染色：（1） 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Stap

9、hylococcus aureus)、大肠杆菌（、大肠杆菌（Escherichia coli）斜）斜面；或选用自己保种的细菌。面；或选用自己保种的细菌。（2） 革兰氏染色液革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、石炭酸复红液等乙醇、石炭酸复红液等)、（3） 香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。精灯。四、实验步骤菌体适中，菌体适中，玻璃涂成薄膜玻璃涂成薄膜，不宜太厚，不宜太厚，用后接种环用火焰灭菌。用后接种环用火焰灭菌。制作涂片制作涂片四、实验步骤晾干

10、，易于染色晾干，易于染色3-6次过火固定，强度适中，不宜烫手次过火固定，强度适中，不宜烫手初染初染1-2min，所有染色过程染液不可干涸，所有染色过程染液不可干涸水洗至水流无色水洗至水流无色媒染媒染先冲去残留水，媒染先冲去残留水，媒染1min，水洗并沥干，水洗并沥干脱色脱色脱色至流出液为无色，一般脱色至流出液为无色，一般20-30s-1min，水洗并沥干。，水洗并沥干。整个过程整个过程不要靠近火焰。不要靠近火焰。复染复染1-2min，所有染色过程染液不可干涸，所有染色过程染液不可干涸water水洗，晾干，镜检。水洗，晾干，镜检。注意事项注意事项v1、染料避免干涸，酒精脱色务必避开火焰。、染料避

11、免干涸，酒精脱色务必避开火焰。v2、老龄菌易被染成红色（细胞通透性出现变化），造成假阴性。、老龄菌易被染成红色（细胞通透性出现变化），造成假阴性。一般选用生长活跃的菌体进行染色。（一般选用生长活跃的菌体进行染色。（18h-32h）v3、涂片过厚或菌悬液过浓，导致细胞大量堆积，容易导致脱色、涂片过厚或菌悬液过浓，导致细胞大量堆积，容易导致脱色不完全，造成假阳性。染色结果以不完全，造成假阳性。染色结果以分散良好分散良好的细菌染色结果为准。的细菌染色结果为准。v4、酒精脱色不够导致假阳性，脱色过渡导致假阴性。、酒精脱色不够导致假阳性，脱色过渡导致假阴性。v5、控制好染色区域控制好染色区域，保证整个染

12、色过程及最后镜检在同一个区，保证整个染色过程及最后镜检在同一个区域进行，可用铅笔标记域进行，可用铅笔标记 。思考题思考题v可用什么方法证明革兰氏染色是成功的？可用什么方法证明革兰氏染色是成功的？v革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？响最终结果？在什么情况下可以采用？v革兰氏染色哪一步最关键？革兰氏染色哪一步最关键？ 五、实验内容及结果v大肠杆菌、金黄葡萄球菌革兰氏染色，绘图，大肠杆菌、金黄葡萄球菌革兰氏染色，绘图，并记录染色结果（颜色，并记录染色结果（颜色，G+或或G-）及放大倍）及放大倍数（包括物镜及目镜）等等。数（包

13、括物镜及目镜）等等。大肠杆菌光学显微镜图（革兰氏染色）大肠杆菌光学显微镜图（革兰氏染色） 放大倍数：放大倍数：1000 解析：大肠杆菌，杆状，菌体为粉红色，属革兰氏阴性菌解析：大肠杆菌，杆状，菌体为粉红色，属革兰氏阴性菌1. 细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色金黄葡萄球菌光学显微镜图（革兰氏染色）金黄葡萄球菌光学显微镜图（革兰氏染色） 放大倍数：放大倍数：1000 荚膜染色荚膜染色v实验材料：实验材料：(l) 同学们自己培养的细菌同学们自己培养的细菌, 或或菌株菌株vv6/vv52/XH7 (2) 1%甲基紫或结晶紫染色液、黑色液（墨汁）。甲基紫或结晶紫染色液、黑色液（墨汁）。(3)载玻片、接种

14、环、洗瓶。载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜。显微镜。实验步骤v1制片：在制片：在干净干净载玻片一端滴一小滴无菌水，取少许细菌载玻片一端滴一小滴无菌水，取少许细菌在水滴中制成悬液。取在水滴中制成悬液。取一小滴一小滴墨汁（或墨汁（或一接种环一接种环墨汁）与菌墨汁）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以缘与菌悬液以30度角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其度角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。成匀薄的一层，风干。2固定：固定：用纯甲醇固定用纯甲醇固定1分钟，立即倾去甲醇，自然晾干。分钟，立即倾去甲

15、醇，自然晾干。3染色：加结晶紫染色：加结晶紫/番红番红/碱性复红碱性复红/甲基紫染液数滴于涂片甲基紫染液数滴于涂片上，染上，染1-2min，以细水流适当冲洗，吸去水后自然晾干。，以细水流适当冲洗，吸去水后自然晾干。4. 油镜观察结果。油镜观察结果。 先用低倍镜再高倍镜观察。先用低倍镜再高倍镜观察。 结果：背景黑色，菌体紫色或红色，荚膜呈一清晰透明圈。结果：背景黑色，菌体紫色或红色，荚膜呈一清晰透明圈。图6-2荚膜染色制片法注意事项注意事项v1、玻片干净无油脂。、玻片干净无油脂。v2、墨水使用量适中，关键是涂片要薄。、墨水使用量适中，关键是涂片要薄。v3、整个过程不加热，固定使用甲醇，甲醇有、整个过程不加热，固定使用甲醇，甲醇有较强的毒性且易挥发，对人体的神经系统和较强的毒性且易挥发，对人体的神经系统和血液系统影响最大血液系统影响最大 ，请同学使用过程特别留，请同学使用过程特别留意。意。实验内容及结果实验内容及结果v2株菌株荚膜染色，绘图，记录染色结果（菌株菌株荚膜染色，绘图，记录染色结果（菌