现代生物技术第2讲

1、现代生物技术现代生物技术 第二讲第二讲基因工程与环境污染生物治理基因工程与环境污染生物治理2022-6-111授课内容1. 现代生物技术概况2. 基因工程与环境污染生物治理3. 细胞工程与环境污染生物处理4. 酶学工程与环境污染生物治理5. 发酵工程在环境污染治理中的应用6. 生态工程与污水处理系统人造化学品与生物进化 工业革命以来，化石能源大大规模开发 矿产资源大大规模开发和利用 人类在近代才开始大规模的合成化学品 20世纪末已经合成出来并经过校核的化合物总数已超过2000万种，而且新化合物增长的速度仍然保持在每年数百万种的水平。2022-6-113环境生物面临的环境 矿产资源开采，大量重金

2、属从地球深层暴露于地表，造成的重金属暴露于环境 化石能源的开采导致了原油污染和重金属污染 大量合成的化合物，有些具有非常特殊的性质，如持久性，剧毒，难降解，有些则使用规模非常巨大 环境微生物是环境中最关键的污染修复者，他们的进化已经赶不上环境的变化2022-6-114解决问题的方法呢？ 通过基因工程改造微生物，使之能够处理现阶段环境污染物，能够达到环境修复的目的 集中与创造目的基因提供综合性代谢新污染物的通路和杂种细胞； 提高代谢通路结构基因的表达，针对新的污染物，改变表达的调节方式； 控制降解途径的限制性步骤，提高分解代谢酶的合成或其他生化反应过程效率； 防止有毒终污染物的产生，防止非需要产

3、品的出现，用确定的基因实现最初的目的。2022-6-115DNA变性 加热、极端的加热、极端的pH 甲醇、乙醇甲醇、乙醇 尿素、甲酰胺尿素、甲酰胺 2022-6-116 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序PCR技术的反应原理2022-6-117一个标准的PCR过程2022-6-1189一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列；并在特定切点切割一. 限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具 1、来源：2、种类：3、作用：主要是微生物4000种。2022-6-11104、结果：形成两种末端

4、粘性末端平末端2022-6-11112022-6-11几种重要的内切酶2022-6-111213 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？被同一种限制酶切断的几个来源不同的DNA是否具有相同的黏性末端？2022-6-1114二个不同的DNA的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端。2022-6-1115二. DNA连接酶“分子缝合针”、作用：把两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来2022-6-1116二、基因的针线DNA连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子

5、。2022-6-1117基因的针线：基因的针线：DNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割2022-6-1118三、基因进入受体细胞的运载”分子运输车” 、作用：将外源基因导入受体细胞、特点（条件）1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存2、具有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接3、具有标记基因，便于进行筛选2022-6-1119、常用的运载体：质粒（最常用）、噬菌体和动植物病毒

6、等标记基因，便于进行检测。都有侵染或进入宿主细胞的能力它们的共同特点是： 其中质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子.2022-6-1120第一步：第一步：（二）基因工程基本步骤：第二步：获取目的基因目的基因与运载体结合方法：1、直接分离：鸟枪法2、人工合成：注意：要保持基因的完整性注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用DNA连接酶连接。2022-6-1121第三步：第四步:将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达1、常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、动植物细胞等2、常用微生物作受体细胞的原因：微生物增殖快、代谢快、目的产物多

7、3、若受体细胞为细菌应作何处理：应用CaCl2处理一般检测：标记基因是否表达目的是：增大细胞壁的通透性2022-6-112022-6-1122基因工程在环境领域的应用 石油污染物降解 多环芳烃降解 卤代芳烃讲解基因工程菌 尼龙寡聚物基因工程菌 多糖分解基因工程菌 抗重金属基因工程菌 杀虫剂降解基因工程菌 植物基因工程石油的历史 宋朝的沈括记录了最早的石油，他在现在的延州发现了石油“鹿延境内有石油。旧说高奴县出脂水，即此也” 二朗山下雪纷纷，旋卓穹庐学塞人，化尽素衣冬不老，石油多似洛阳尘 本草衍义鹿延界内有石油，燃之，烟甚浓，其煤叮为墨，黑光如漆，松烟不入，其识文曰延川石液者，是不可人药，当附于

8、此2022-6-1123石油的大规模开采和利用 内燃机的出现大大的推动了原油的开采和利用 石油是现在最重要的工业原料2022-6-1124近年来的石油污染事件 1980 年代初发生在英国北海的油田和油轮漏油事件 在美国阿拉斯加威廉王子海峡触礁的万吨级“埃克森瓦尔迪兹号”油轮使得 5000 万加仑原油倾泻进海里 90 年代初，由于中东海湾战争的破坏，原油以每天数百万桶的速度从艾哈迈迪输油管中漏入海中，在海湾内形成一片长 56 千米、宽 16 千米的油膜，溢油总量达 170 万吨 2011年，康菲漏油事件，康菲公司赔偿50万美金 2010年，墨西哥湾漏油事件，英石油同意赔偿187亿美元 在开采和废

9、弃的油井附近存在2022-6-1125石油污染的危害 组成复杂：石油的成分复杂c4-30的烷烃；芳香烃；多环芳烃 造成海洋、陆地等大面积的污染 难于降解 对水鸟和水生生物有严重威胁 对渔业造成影响 陆地上同样对动植物的灾难性的 接触会有致癌性和过敏反应2022-6-11262022-6-1127石油降解菌在自然界中,能够降解石油污染物质的微生物分布广泛,主要集中在细菌、霉菌、放线菌、真菌、酵母和藻类。一般认为, 细菌更能有效地降解原油,因其数目最多。细菌类:不动杆菌属(Acimtobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、节杆菌属(Archrobacter)、产碱杆菌属(Aka

10、ligems)、黄杆菌属(Flavobacterhm)、微杆菌属 (Microbacter)、棒杆菌属(Coryneforms) 、微球菌(Mycobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus);真菌类:假丝酵母属(Candida)、金色担子菌属(Aureobasidium)、毛霉属（Mucor)、掷抱酵母属(Spowbolomyces)、红酵母属(Rhodotomla)、青霉属(PeniciHum)、曲霉属(Aspergillus )、被孢霉属(Mortierella )、練刀霉属(Fuscnium)、木霉属(Trichoderma );放线菌类：诺卡氏菌属(Nocardia)、链霉属

11、;藻类包括鱼腥藻(Anabeana)、颤藻属 (Oscillatoria)、鞘藻属(Microcoleus)等。2022-6-1128直链烷烃的降解 直链烷烃的降解形式包括三种:双末端氧化、单一末端氧化以及次末端氧化 单加氧酶RnCH3 RnCH2OH RnCHORn-1CH3 RnCOOH2022-6-1129芳香烃的降解2022-6-1130微生物降解石油的影响因素氧气温度湿度盐度pH压力微生物数量利用程度2022-6-1131基因特征通过转移或者结合方式从其它可降解该有机物的微生物中得到相应的降解基因,这就会导致同一环境中因相同污染物的存在而使各菌株降解基因具有高度的同源性。即使这些菌株

12、存在于不同的环境,由于具有对同一污染物的降解特性而使基因也具有较高的同源性,并且获得的降解基因在微生物种群中会普遍传播。大量研究表明,石油污染过的环境中,具有降解能力的微生物的数量会大大增长,其中大部分是含有降解质粒的微生物,增长幅度可提高数倍甚至是数十倍。没有受到石油污染的环境中含有质粒的细菌,比在被石油污染过的环境中出现的数量大幅度降低2022-6-1132研究历史Chakrabarty等人在非发酵细菌中提取出降解樟脑的质粒。编码多环芳烃、编码脂肪烃、编码芳香烃及它们的氯代芳烃、多氯联苯及氧化产物的基因,并且这类降解基因都位于质粒上,目前已发现的降解质粒已经达到了数百种。Kumar等人从被

13、石油污染过的土壤中分离得到嗜热脂肪土芽孢杆菌AAP7919,该菌株含有降解蒽的质粒, 在高温下对蒽具有较好的降解效果Emtiazi等人发现假单胞菌(Pseudomonas sp)可以分解烯烃Chang-Hyun Chang等人从石油污染过的土壤中得到Staphylocollus, sp. KW-07菌株,该菌株对于土壤中的多环芳经(PAH)具有极好的降解效果2022-6-1133不动杆菌BS3 16S rRNA序列分析2022-6-1134Ribosomal RNA Sequences核糖体RNA序列与进化（1）具有重要且恒定的生理功能；（2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具

14、有适当的保守性；（3）分子量大小适中，在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)（4）高度保守、中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。小核糖体亚单位RNA（16S rRNA， 5S rRNA ，23S rRNA）BS3具有脂肪烃分解能力2022-6-1136pH对BS3烷烃降解的影响2022-6-11372022-6-11382022-6-11392022-6-11402022-6-1141烷烃碳链长度影响2022-6-1142BS3对芳香烃的降解2022-6-1143BNF1的降解能力2022-6-11442022-6-1145Acinetobacter

15、sp.BS3-C23O基因工程菌 将C230基因重组到自杀性质粒pUT/mini-Tn5转座子载体中,构建转基因载体pUT/mini-Tn5-C23O利用三亲结合转移技术将C2JO基因插入到受体菌BS3的染色体中,并筛选到一株转基因工程菌Acinetobacter sp.BS3-C23O2022-6-1146基因重组BS3-C23O邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活性测定2022-6-11472022-6-11482022-6-11492022-6-11502022-6-11512022-6-1152实验室模拟应用情况2022-6-1153污染土壤玉米发芽率2022-6-1154井场原位修复实验20

16、22-6-1155农药一农药是人类向环境投放规模最大的化学品我国年产农药160万多吨，使用量约100万吨农药生产企业1800多家二农药也是单位面积投放量最大的化学品2013年国土资源部统计公布，全国耕地13538.5万公顷园地1481.2万公顷、林地25395.0万公顷、草地28731.4万公顷三农药不同于其他化学品，其具有明显生物效应2022-6-1156四人类会直接或间接通过食物链摄入农药化学品 我国人均每年的农药使用量约1.2kg五农药连续重复使用，在环境中具有很强的持久性 农药对农作物、非靶标生物、土壤、水体、大气都造成严重的污染，对 生态系统和人类健康境造成严重威胁六、高毒的有机磷农

17、药还常常被检出，滥用造成巨大危害农药2022-6-1157有机磷农药有机磷农药（OPS）是我国使用广泛、用量最大的杀虫剂。作用位点为乙酰胆碱酯酶受体主要包括敌敌畏、对硫磷（1605）、甲拌磷（ 3911）、内吸磷（1059）、乐果、敌百虫、马拉硫磷（4049）等。急性有机磷农药中毒（AOPP）是指有机磷农药短时大量进入人体后造成的以神经系统损害为主的一系列伤害，临床上主要包括急性中毒患者表现的胆碱能兴奋或危象，其后的中间综合征（IMS）以及迟发性周围神经病（OPIDPN）。每年全世界有数百万人发生AOPP，其中约有30万人口死亡，且大多数发生在发展中国家。2022-6-1158水胺硫磷2022

18、-6-11592022-6-11602022-6-11612022-6-1162节杆菌sc1-2 水胺硫磷污染的土壤采自江苏南通长期受水胺硫磷农药污染的土壤2022-6-1163节杆菌sc1-2对水胺硫磷的降解2022-6-1164苯线磷降解产物2022-6-1165甲基对硫磷2022-6-1166降解相关的基因和酶 水解酶基因oph 水解酶OPD2022-6-1167大肠杆菌中提取的OPD对10mg/L水胺硫磷降解曲线2022-6-1168基因工程菌的构建2022-6-1169三株基因工程菌 恶臭假单胞菌 (P.putida KT2440-mpd-oph) 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.BHC-mpd-oph) 副球菌