第11章 DNA文库的构建和目标基因的筛选

1、洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程基因文库基因文库(gene library)： 指某一生物分离的全部基因的集合。指某一生物分离的全部基因的集合。基因组基因组DNA文库：文库： 指将是指某个生物的基因组指将是指某个生物的基因组DNAD

2、NA与适当的载体在体外重与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落( (或或噬菌体噬菌体) )，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。cDNA文库：文库： 指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的转录的mRNA经逆转录形成的经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合。体细胞而形成的克隆的集合。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工

3、程程噬噬菌菌斑斑菌菌落落洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程第一节第一节 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建第二节第二节 cDNAcDNA基因文库的构建基因文库的构建第三节第三节 基因克隆的筛选策略基因克隆的筛选策略第四节第四节 DNADNA文库的保存文库的保存 洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程8第一节第一节 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建一、基因组一、基因组DNA文库的类型文库的类型1、质粒文库：、质粒文库：容纳片段小于容纳片段小于10kb，以菌落的形式保存和筛选，以菌落的形式

4、保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。2、噬菌体文库：、噬菌体文库：一般用一般用噬菌体载体，插入型容纳片段小于噬菌体载体，插入型容纳片段小于7kb，适合于构建，适合于构建cDNA文库，置换型容纳文库，置换型容纳9-25kb，适合于，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程95、亚基因组文库：、亚基因组文库：文库的对象只是基因组的一部分，可用染文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、特定色体显微切割、

5、特定YAC富集等方法而产生，用于针对特定富集等方法而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。目标基因对大片段文库的深入研究。4、人工染色体文库：、人工染色体文库：BAC、YAC、PAC等文库，最大插入片等文库，最大插入片段分别为段分别为300kb、1000kb和和150kb，是大片段文库，主要用，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱构建。于基因组测序和图谱构建。6、基因组文库的发展：略、基因组文库的发展：略3、粘粒文库：、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比比噬菌体文库略长，达噬菌体文库略长，达45kb左右。左右。洛阳洛阳师范

6、师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程10二、文库的代表性和随机性二、文库的代表性和随机性 为保证能从基因组文库中筛选到某个特定的基因，基因为保证能从基因组文库中筛选到某个特定的基因，基因组文库必须有一定的代表性和随机机。组文库必须有一定的代表性和随机机。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程11代表性：指文库中所有克隆所携带的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可片段重新组合起来可 以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。 代表性代表性意味着文

7、库要有意味着文库要有完备性，完备性，是指在构建的基因文库是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率。中任一基因存在的概率。 它与基因文库最低所含克隆数它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )。P ： 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f ：克隆片段的平均大小：克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小生物基因组的大小 。例：假如重组片段大小为例：假如重组片段大小为20kb，要使文库包含该基因组任一片，要使文库包含该基因组任一片段的概率达到段的概率达到99%，

8、则，则N(E. coli)=ln(1-0.99)/ln(1-20/4600)=1057N(人人)=ln(1-0.99)/ln(1-20/(3109)=6.9105洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程随机性：随机性： 既表示构建文库时要从基因组既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程基因文库的质量标准基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个

9、理想的基因文库应具备除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下下列条件列条件： 1 1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 2 2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； 3 3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查；排序和染色全步查； 4 4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆； 5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失

10、真度小。重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程 1基因组基因组DNA文库的载体制备文库的载体制备 载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。三、基因组三、基因组DNA文库的构建流程文库的构建流程 2高质量大相对分子量基因组高质量大相对分子量基因组DNA的提取和部分酶切的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA相对分子相对分子质量

11、要求不同，一般所提取的质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的最终平均插入片段长度的35倍。倍。 洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程 3外源外源DNA的连接转化或包装侵染的连接转化或包装侵染 一般在构建大片段基因组一般在构建大片段基因组DNA文库时，大量连文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的感受态细胞和最佳的转化条件或效价高效率高的感受态细胞和

12、最佳的转化条件或效价高且质量稳定的包装蛋白。且质量稳定的包装蛋白。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程5、文库的质量检测、文库的质量检测 克隆子数目要足够多，覆盖度要足够高克隆子数目要足够多，覆盖度要足够高(4-6倍或更高倍或更高)。 覆盖倍数覆盖倍数 = 平均插入片段长度平均插入片段长度 克隆数克隆数 / 基因组基因组DNA的的长度。长度。 或：或： 覆盖倍数覆盖倍数=所有探针筛选到的阳性克隆子数所有探针筛选到的阳性克隆子数 / 总探针数。总探针数。 另外，植物基因组文库中叶绿体另外，植物基因组文库中叶绿体DNA的比例：小于的比例：小于5%。洛阳洛

13、阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程一、一、cDNAcDNA文库的特征文库的特征1 1、基因特异性：基因特异性： 1 1）cDNAcDNA只含有对应于成熟只含有对应于成熟mRNAmRNA的转录区，不含启动子、终止的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。子、内含子、基因间隔区等。 2 2）cDNAcDNA一般较短，平均长度一般较短，平均长度1.5kb1.5kb左右，多数为左右，多数为100bp100bp至至10kb10kb。2 2、器官特异性器官特异性3、代谢或发育特异性、代谢或发育特异性4、表达量不均匀性、表达量不均匀性洛阳洛阳师范师范学院学院

14、生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程二、二、cDNAcDNA文库的构建步骤文库的构建步骤： 1、细胞总、细胞总RNA的提取和的提取和mRNA分离；分离；2、第一链、第一链cDNA合成；合成；3、第二链、第二链cDNA合成；合成；3、双链、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。宿主中繁殖。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程cDNA文库构建流程图文库构建流程图洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程1 1、RNARNA的分离的分离 mRNAmRNA是构

15、建是构建cDNAcDNA文库文库的起始材料。由于的起始材料。由于mRNAmRNA在在总总RNARNA中所占比例很小，因中所占比例很小，因此从总此从总RNARNA中中富集富集mRNAmRNA是构是构建建cDNAcDNA文库的一个重要步文库的一个重要步骤。通过降低骤。通过降低rRNArRNA和和tRNAtRNA含量，可大大提高筛选到含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。目的基因的可能性。利用利用Poly(APoly(A) )尾巴纯化或直接提尾巴纯化或直接提取取mRNAmRNA。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程2 2、第一链、第一链cDNAcDNA的

16、合成的合成 由由mRNAmRNA到到cDNAcDNA的过程称为的过程称为反转录反转录，由，由反反转录酶转录酶催化。催化。反转录酶：反转录酶： AMVAMV和和Mo-MLVMo-MLV。合成合成DNADNA是需要引物引导：是需要引物引导： oligo(dToligo(dT) )引物；随机引物。引物；随机引物。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程2 2、第一链、第一链cDNAcDNA的合成的合成 由由mRNAmRNA到到cDNAcDNA的过程称为的过程称为反转录反转录，由，由反转反转录酶录酶催化。催化。反转录酶：反转录酶： AMVAMV和和Mo-MLVM

17、o-MLV。合成合成DNADNA是需要引物引导：是需要引物引导： oligo(dToligo(dT) )引物；随机引物。引物；随机引物。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程3 3、第二链、第二链cDNAcDNA的合成的合成 cDNAcDNA第二链的合成就是将上一步形成的第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-mRNA-cDNAcDNA杂交双链变成互补双链杂交双链变成互补双链cDNAcDNA的过程。的过程。 自身引导合成法自身引导合成法：置换合成法置换合成法：引导合成法引导合成法：引物引物- -衔接头合成法：衔接头合成法： 第一链合成后直接采用末端转移

18、酶（第一链合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链）在第一链 cDNA 的的 3-端加上一段端加上一段 Poly（dC）的尾巴，然后用一段）的尾巴，然后用一段带接头序列的带接头序列的 Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的）短核苷酸链作引物合成互补的 cDNA 链链 。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程244 4、双链、双链cDNAcDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖繁殖 由于平端连接效率低，由于平端连接效率低，双链双链 cDNA 在和在和载体连接之前，要经过一系列处理，如同聚物加尾、载体连接之前，

19、要经过一系列处理，如同聚物加尾、加接头和分级分离。加接头和分级分离。 总总cDNAcDNA的分级分离的分级分离：采用排阻层析柱，去除过：采用排阻层析柱，去除过大和过小的大和过小的cDNAcDNA分子，保留分子，保留500bp500bp至至8kb8kb的总的总cDNAcDNA，以提高连接后文库的质量。以提高连接后文库的质量。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程25三、三、cDNAcDNA文库的均一化处理文库的均一化处理1 1、基因组、基因组DNADNA饱和杂交法饱和杂交法 mRNA mRNA水平上，基因之间丰度差异极大。水平上，基因之间丰度差异极大。

20、基因组水平，基因之间拷贝数差异不大。基因组水平，基因之间拷贝数差异不大。 将随机打断的基因组总将随机打断的基因组总DNADNA片段标记为探针，与总片段标记为探针，与总cDNAcDNA单链饱和杂交，弃除未杂交的总单链饱和杂交，弃除未杂交的总cDNAcDNA，从，从cDNAcDNA-DNA-DNA杂交体上杂交体上变性释放除均一化后的总变性释放除均一化后的总cDNAcDNA，转化宿主。，转化宿主。2 2、基于复性动力学、基于复性动力学(second-order kinetics)(second-order kinetics)原理的均一化处理原理的均一化处理 浓度大的浓度大的DNADNA复性所需时间短

21、，浓度越小复性越迟。复性所需时间短，浓度越小复性越迟。 控制复性时间，使高丰度控制复性时间，使高丰度cDNAcDNA呈双链状态，低丰度呈双链状态，低丰度cDNAcDNA呈单链状态，利用羟基磷灰石柱将单链和双链呈单链状态，利用羟基磷灰石柱将单链和双链cDNAcDNA分开，保分开，保留单链留单链cDNAcDNA后转化宿主。后转化宿主。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程26四、扣除杂交四、扣除杂交cDNAcDNA文库文库 利用分子杂交原理，去除非差异表达基利用分子杂交原理，去除非差异表达基因的因的cDNA，保留差异表达的基因的，保留差异表达的基因的cDN

22、A用于制备文库。用于制备文库。tester: 待测样本的总待测样本的总cDNA。driver: 表达谱背景一致但不含目的基因的总表达谱背景一致但不含目的基因的总 cDNA。tester与过量的与过量的driver杂交，去除二者共同表杂交，去除二者共同表达的达的cDNA，保留差异表达基因。，保留差异表达基因。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程SSHSSH原理原理洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程2 2、mRNA-mRNA-cDNAcDNA杂交杂交： 过量的驱动总过量的驱动总mRNA（末端生物素标（末端生物

23、素标记）与总记）与总cDNA杂交，利用生物素磁珠法将杂交，利用生物素磁珠法将公共表达基因去除。公共表达基因去除。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程29五、全长五、全长cDNAcDNA文库文库 cDNA不完整的原因：不完整的原因：mRNA的降解、第二链合成中的降解、第二链合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反转录酶与聚合酶的外切核酶活性、反转录酶与mRNA模板的脱离模板的脱离(主要受主要受mRNA复杂结构影响复杂结构影响)。1 1、SMARTSMART全长全长cDNAcDNA文库的构建方法文库的构建方法 为为Clontech公司的专利试剂盒原理，应用广

24、泛，其独特公司的专利试剂盒原理，应用广泛，其独特的反转录酶具有末端转移酶活性，的反转录酶具有末端转移酶活性， RTase自动在反转录得到自动在反转录得到的全长的全长cDNA第一链的第一链的3末端加上末端加上oligo(dC)，利用具，利用具oligo(dG)的接头引导第二链的合成。由于的接头引导第二链的合成。由于oligo(dC)比较短，比较短，因此较短的因此较短的oligo(dG)容易介导合成假全长容易介导合成假全长cDNA。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程SMART技术构建全长技术构建全长cDNA文库的原理文库的原理洛阳洛阳师范师范学院学院生

25、命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程312 2、Cap-TrapperCap-Trapper法构建全长法构建全长cDNAcDNA文库文库 在在mRNA的两端均打上生物素标记，合成的两端均打上生物素标记，合成cDNA第一第一链时用链时用dm5 CTP代替代替dCTP，用，用RNase消化单链消化单链RNA。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程3 3、 TAP法构建全长法构建全长cDNAcDNA文库文库 Invitrogen公司的试剂盒公司的试剂盒原理，首先利用碱性磷酸酶处原理，首先利用碱性磷酸酶处理使非全长理使非全长mRNA无效化。用

26、无效化。用处理以移去全处理以移去全长长mRNA的帽子结构，然后为的帽子结构，然后为脱帽后的全长脱帽后的全长mRNA的的5末端末端接上人工接头，利用具接上人工接头，利用具oligo(dT)的人工接头进行反的人工接头进行反转录，得到的全长转录，得到的全长cDNA第一第一链的两端就打上了特别设计的链的两端就打上了特别设计的人工接头，可用人工接头，可用PCR法对全法对全长总长总cDNA进行放大，酶切后进行放大，酶切后与载体连接。与载体连接。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程33六、其它六、其它cDNAcDNA文库文库表达表达cDNAcDNA文库：文库： 用

27、表达载体构建全长用表达载体构建全长cDNAcDNA文库，文库的每一个克隆子可文库，文库的每一个克隆子可以表达出蛋白，利用蛋白对克隆子进行筛选。以表达出蛋白，利用蛋白对克隆子进行筛选。双杂交全长双杂交全长cDNAcDNA文库：文库： 将表达文库与酵母双杂交系统结合使用，利用酵母作宿将表达文库与酵母双杂交系统结合使用，利用酵母作宿主，通过融合蛋白的酵母双杂交对克隆子进行筛选，用于鉴主，通过融合蛋白的酵母双杂交对克隆子进行筛选，用于鉴定可与特定蛋白相互作用的基因，主要为转录因子定可与特定蛋白相互作用的基因，主要为转录因子。重组酶克隆策略的重组酶克隆策略的cDNAcDNA文库：文库： 将重组酶的特异识

28、别序列将重组酶的特异识别序列attP1attP1和和attP2attP2构建到每个构建到每个cDNAcDNA的两端，在非消化情况下实现与载体的重组连接，避免了基的两端，在非消化情况下实现与载体的重组连接，避免了基因被切断。因被切断。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程34第三节第三节 基因克隆的筛选策略基因克隆的筛选策略 大型基因组大型基因组文库文库一般由数十万甚至上百万个重一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成，从其中筛选分离出某一个特定基因并组克隆组成，从其中筛选分离出某一个特定基因并不是件简单的事。不是件简单的事。一、表型筛选法一、表型筛选法 一

29、些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以赋予宿主特定性基因、结合蛋白编码基因等）可以赋予宿主特定的表型，可以采用特殊的正选择筛选的表型，可以采用特殊的正选择筛选程序（如程序（如抗药抗药性筛选法性筛选法等）直接筛选，宿主多为突变体。等）直接筛选，宿主多为突变体。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程35二、杂交筛选和二、杂交筛选和PCR筛选筛选 1、杂交筛选、杂交筛选 洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程362、PCR筛选法：筛选法： 将文库

30、贮存于多个将文库贮存于多个96或或384孔板中，首先通过孔板中，首先通过PCR确定目标基因所在的特定确定目标基因所在的特定PCR板板(主混合池筛选主混合池筛选)，然，然后通过后通过PCR确定目标基因在确定目标基因在特定特定PCR板上的特定行和列板上的特定行和列(行混合池筛选和列混合池筛行混合池筛选和列混合池筛选选)，最后通过逐个克隆的，最后通过逐个克隆的PCR确定目标基因所对应的确定目标基因所对应的克隆子。克隆子。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程37三、免疫筛选三、免疫筛选 首先制备和纯化得到目标基因的抗体，然后利用抗体来首先制备和纯化得到目标基因的抗体，然后利用抗体来筛选目标基因所在的表达文库，得到目标基因所对应的克隆筛选目标基因所在的表达文库，得到目标基因所对应的克隆子。子。 方法有原位检测和免疫沉淀检测。方法有原位检测和免疫沉淀检测。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程1、原位检测法、原位检测法滤滤膜（固定抗体）膜（固定抗体）+洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程2、免疫沉淀检测法、免疫沉淀检测法菌落菌落沉淀素沉淀素洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因