生物化学第二章 蛋白质教材

1、第二章 蛋白质3.1 氨基酸的两性解离性质及等电点氨基酸的两性解离性质及等电点3.2 氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质3.3 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构3.4 蛋白质测序的基本方法路线蛋白质测序的基本方法路线2.1 氨基酸的两性解离性质及等电点氨基酸的两性解离性质及等电点o氨基酸分子既含有酸性的羧基(-COOH)，又含有碱性的氨基(-NH2)。其-COOH能放出质子(H)，而变成-COO；其-NH2 能接受质子，而变成-NH3+。因此，氨基酸是两性电解质(ampholyte)。+ 通过改变溶液的通过改变溶液的pHpH，可使氨基酸分子的解离状态发生改变。，可使氨基酸分子的解离状态发生改变。

2、 氨基酸在氨基酸在酸性环境酸性环境中，主要以中，主要以阳离子阳离子的形式存在，在的形式存在，在碱性环境碱性环境中，主要以中，主要以阴离子阴离子的形式存在。的形式存在。pH = pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷为负净电荷为负CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3+ + H+ OH- + H+ OH-(pK 1)(pK 2) 当氨基酸溶液在某一定当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的

3、pH值即为值即为该氨基酸的该氨基酸的等电点等电点(isoelctric point)。两个概念两性离子:同一分子上带有正负两种离子等电点:净电荷为零时的pH值(用pI表示) 等电点是氨基酸的特征常数等电点是氨基酸的特征常数o氨基酸的两性解离符合氨基酸的两性解离符合Bronsted Lowry的酸碱质的酸碱质子理论，即氨基酸在水溶液中的偶极离子既起酸子理论，即氨基酸在水溶液中的偶极离子既起酸（质子供体），又起碱（质子受体）的作用。氨基（质子供体），又起碱（质子受体）的作用。氨基酸完全质子化时，可以看成是多元酸酸完全质子化时，可以看成是多元酸.侧链不解离的侧链不解离的中性氨基酸可看作二元酸，酸性氨

4、基酸和碱性氨基中性氨基酸可看作二元酸，酸性氨基酸和碱性氨基酸可视为三元酸。酸可视为三元酸。o 在这里同样可以利用在这里同样可以利用Handerson Hasselbalch公式进行公式进行pH或氨基酸各种离或氨基酸各种离子浓度比例的计算：子浓度比例的计算：o 质子受体质子受体o pH=pK+lg-o 质子供体质子供体o pK为表观解离常数的负对数，可用为表观解离常数的负对数，可用测定滴定曲线的实验方法求得。其拐点处测定滴定曲线的实验方法求得。其拐点处PH值即为值即为PK等电点的计算公式:对于一氨基一羧基和一氨基二羧基氨基酸,其公式为: pI=(pK1+Pk2)/2对于二氨基一羧基氨基酸,其公式

5、为: pI=(pK2+pK3)/2等电点的主要用途:1.分离氨基酸(离子交换,电泳等).2.氨基酸制备(等电点沉淀法,电泳等).等电点计算公式的推导：在氨基酸完全质子化时，各等电点计算公式的推导：在氨基酸完全质子化时，各种不同氨基酸的等电点可由下面的方法推导出来：种不同氨基酸的等电点可由下面的方法推导出来： 对于中性氨基酸（一氨基一羧基氨基酸）：以对于中性氨基酸（一氨基一羧基氨基酸）：以R表示带电情况，则：表示带电情况，则： R+ R0 + H+ K1=R0H+/R+ 则 R+ = R0H+/ K1 R0 R- + H+ K2=R-H+/R0 则 R-= R0 K2/ H+ 当在等电点时， R

6、+ = R- 则有： H+2 = K1 K2 即 H+= （K1 K2）1/2 等式两边取负对数得： pH=1/2（pK1+pK2） 也就是pI= 1/2（pK1+pK2） K1 K2同样对于三个可解离的氨基酸例如天冬氨酸和赖氨酸来说，只要写出它的解离公式，然后取两性离子两边的pK值的平均值，则得其 等电点。如天冬氨酸的解离如下： R+ R0 R- R2- 则 pI= 1/2（pK1+pK2） 而赖氨酸的解离如下： R2+ R+ R0 R- 则 pI= 1/2（pK2+pK3） pK1pK2pK3pK1pK2 pK3举例将含有将含有Asp，Gly，Thr，Leu和和Lys的的pH3.0的缓冲的

7、缓冲溶液，加到预先用同样缓冲溶液平衡过的溶液，加到预先用同样缓冲溶液平衡过的Dowex50阳离子交换树脂中，然后用该缓冲溶液洗脱，这阳离子交换树脂中，然后用该缓冲溶液洗脱，这5中中氨基酸洗脱顺序如何？并说明原因。氨基酸洗脱顺序如何？并说明原因。 怎么办Asp Thr Gly LeuLys 小小 结结1.1.某氨基酸的等电点即为该氨基酸某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两性离子两边的两边的pKpK值和的一半。值和的一半。2.2.在氨基酸等电点以上任何在氨基酸等电点以上任何pHpH，AAAA带净的负带净的负电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电点以下任何电点以

8、下任何pHpH，AAAA带净的正电荷，在电带净的正电荷，在电场中向阴极移动。场中向阴极移动。3.3.在一定在一定pHpH范围中，溶液的范围中，溶液的pHpH离离AAAA等电点愈等电点愈远，远，AAAA带净电荷愈多。带净电荷愈多。举例例1: 甘氨酸的pK1=2.34,pK2=9.60.问该氨基酸在pH为5.0时在电场中的移动方向.怎么办解:先求出甘氨酸的等电点,再根据等电点与pH的关系,判断其所带电荷,从而可得到答案. GlypI=(pK1+Pk2)/2=(2.34+9.60)/2=5.97 因为等电点(5.97)大于pH(5.0),故而带正电荷,所以在电场中向负极移动.怎么办例2:LyspK1

9、=2.18,pK2=8.59,pK3=10.53,问在pH为4.0和在11.5时各带何种电荷,并说明在电场中的移动方向.怎么办例3：计算0.1mol/L的谷氨酸溶液在等电点时主要的离子浓度？2.2 氨基酸的化学性质2.2.1 有氨基参与的反应2.2.1.1 与亚硝酸的反应R-CH-COOH+HO-ONN2+H2O+R-CHCOOH | | NH2 OH此性质为Van Slyke氨基氮测定方法的原理.2.2.1.2 与甲醛的反应：氨基酸是一种两性电解质，但不能直接用酸或碱来进行定量测定。这是因为氨基酸的酸、碱滴定的等电点pH过高（12-14）或过底（1-2），没有适当的指示剂可被选用。但如果加入

10、过量的甲醛，生成二羟甲基氨基酸后即可降低氨基的碱性，而增加羧基的酸性，使其PK值减少2-3个pH单位。这时即可用标准的NaOH溶液滴定。作用: 氨基酸的甲醛滴定（formol titration）法是氨基酸测定的一种常用方法。当氨基酸溶液存在1摩尔/升甲醛时，滴定终点由pH12左右移至9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域，这就是Srensen甲醛滴定法的基础。2.2.1.3 与酰化试剂反应： 氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化。例如与苄氧（苯甲氧）甲酰氯（carbobenzyloxychlorride）反应：这里-NH2中的一个H被苄氧甲酰基（可简写为Cbz）取代生成C

11、bz-氨基酸。除了苄氧甲酰氯外，酰化试剂还有叔丁氧甲酰氯，对-甲苯磺酰氯以及邻苯二甲酸酐等。这些酰化试剂在多肽的蛋白质的人工合成中被用作氨这些酰化试剂在多肽的蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂。基的保护试剂。 另一个酰化试剂是丹磺酰氯（dansyl chloride），它是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯的简称，被用于多肽链用于多肽链NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。 用途用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸末端氨基酸.DNS +DNS + AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白弱碱弱碱DNS-DNS-AA AA 多

12、肽多肽 蛋白蛋白酸酸DNS-AA +DNS-AA +游离游离AAAA（乙醚抽提，有荧光）（乙醚抽提，有荧光）2.2.1.4 氨基酸与氨基酸与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反应的反应（sangersanger反应）反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色黄色)+ HF弱碱中弱碱中氨基酸氨基酸作用：作用：多肽及蛋白质的N-末端氨基酸上面的游离氨基也能与2,4-二硝基氟苯作用.所以此反应常用于蛋白质一级结构氨基末端的测定.2.2.1.5 2.2.1.5 氨基酸与苯异硫氰酯（氨基酸与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应）的反应（Edm

13、anEdman反应）反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）弱碱中弱碱中(400 C)(硝基甲烷硝基甲烷 400 C)H+用途用途：是鉴定多肽是鉴定多肽N-N-端氨基酸的重要方法端氨基酸的重要方法。CH2CH2ClS:R1S+R1CH2CH2ClH2NCH COO-R2R1SCH2NHCH(R2)COO-2.2.1.6 烃基化反应烃基化反应2.2.1.7 形成西佛碱反应：氨基酸的-氨基能与醛类化合物反应生成弱碱，即所谓西佛碱（Schiffs base）。 R R R

14、R | | -H2O | | C=O + H2N-C-COOH- C=N-C-COOH | | | | H H H H 醛 氨基酸 西佛碱 西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的中间物。2.2.1.8 与荧光胺反应：荧光胺可与-氨基酸中的氨基反应生成产荧光的化合物，且反应非常灵敏。它具有特定的激发波长（390纳米）和发射波长（475纳米），读取发射光的荧光强度即可测定氨基酸的含量。2.2.1.9 脱氨基反应：见氨基酸代谢。 氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸的碱金属盐能溶于水的碱金属盐能溶于水, ,而重金属盐则不溶于而重金属盐则不溶于水水。（1

15、1）成盐反应）成盐反应（2 2）形成酯的反应）形成酯的反应用途用途：是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体。R2OH+RCHCOO-NH3+ H2ORCHCOOR2NH2.HCl（3 3）形成酰卤的反应）形成酰卤的反应用途用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。PCl3, PCl5 or SO Cl2R CHCO O-NH PGRCHCOClNHPG用途用途：常作为多肽合成活性中间体。常作为多肽合成活性中间体。（5 5）脱羧反应脱羧反应用途用途：酶催化的反应酶催化的反应。CO2+H+RCH2NH2RCHCOO-NH3+(1)(1

16、)与茚三酮反应与茚三酮反应用途用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。2.2.3 - -氨基和羧基共同参与的反应氨基和羧基共同参与的反应CCCOOO茚三酮茚三酮CCCOOOHOHH2OH2O水合茚三酮水合茚三酮CO2NH2RCHO+CCCOOHOHH2NCHCOOHRCCCOOOHOH+2NH3CCCOOCCCOO-NH4+NH2O2+CCCOOOCCCOOHHO用途用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。2.2.3 - -氨基和羧基共同参与的反应氨基和羧基共同参与的反应H2NCR1HCOHOH NHCCOOHR2H+H2ONHCCO

17、OHR2HH2NCR1HCO-肽键(1) (1) 巯基（巯基（-SH-SH）的性质）的性质作用：作用：这些反应可用于巯基的保护这些反应可用于巯基的保护。CH2Cl-OOCCHCH2SHNH3+-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+ICH2CNH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+2.2.4 侧链基团的化学性质侧链基团的化学性质CH2OCClO作用：作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒与金属离子的螯合性质可用于体内解毒。-OOCCHCH2SHNH3+COO-HO-Hg+-OOCCHCH2SNH3+Hg+COO-(1) 巯基（巯基（-SH）的性质

18、）的性质2.2.4 侧链基团的化学性质侧链基团的化学性质作用：作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或端裂端裂。-OOCCHCH2SHNH3+-OOCCHCH2SHNH3+-OOCCHNH3+CH2SSCH2NH3+CH-OOC胱氨酸胱氨酸(1) 巯基（巯基（-SH）的性质）的性质2.2.4 侧链基团的化学性质侧链基团的化学性质作用：作用：可用于可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量。H3NCHCH2S-COO-+SSNO2NO2CO2HCO2H+COO-H3NCHCH2SCO2HNO2-S-NO2COO-HS-+硝基苯甲酸二硫化合物硝基苯甲酸二硫化合

19、物(DTNB(DTNB)(1) 巯基（巯基（-SH）的性质）的性质2.2.4 侧链基团的化学性质侧链基团的化学性质作用：可用于修饰蛋白质。作用：可用于修饰蛋白质。-OOCCHCH2OHNH3+FPOCH(CH3)2OOCH(CH3)2+-OOCCHCH2ONH3+POCH(CH3)2OOCH(CH3)2二异丙基氟磷酸酯二异丙基氟磷酸酯(2) 羟基的性质羟基的性质2.2.4 侧链基团的化学性质侧链基团的化学性质 组氨酸含有咪唑基，它的组氨酸含有咪唑基，它的p pK K2 2值为值为6.06.0，在生，在生理条件下具有缓冲作用。理条件下具有缓冲作用。 组氨酸中的咪唑基能够发生多种化学反应。组氨酸中

20、的咪唑基能够发生多种化学反应。可以与可以与ATPATP发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。从而使酶活化。 组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应。生成组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或丧失烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或丧失(3)(3)咪唑基咪唑基的性质的性质2.2.4 侧链基团的化学性质侧链基团的化学性质2.2.5 2.2.5 氨基酸的化学合成氨基酸的化学合成 o目前氨基酸的合成方法有目前氨基酸的合成方法有5 5种：种：o（1 1）直接发酵法；）直接发酵法；o（2 2）添加前体发酵法；）添加前体发酵法；o（3 3

21、）酶法；）酶法；o（4 4）化学合成法；）化学合成法；o（5 5）蛋白质水解提取法。）蛋白质水解提取法。o通常将直接发酵法和添加前体发酵法统称为通常将直接发酵法和添加前体发酵法统称为发酵法发酵法。3.2.6 氨基酸的应用氨基酸的应用1 1、医药工业、医药工业o（1 1）氨基酸输液）氨基酸输液o 必需氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、必需氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸蛋氨酸o 半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸是幼儿半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸是幼儿所必需的。所必需的。治疗药剂治疗药剂o（1 1）精氨酸：对治疗高氨血症、肝机

22、能障碍等）精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果；疾病颇有效果；o（2 2）天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗）天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。o（3 3）半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治）半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等；疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等；o（4 4）组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心）组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。绞痛，心功能不全等疾病的治疗。2 2、化学工业、化学工业o（1 1）维生素）维生素B B6 6

23、: :可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。o（2 2）叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。o（3 3）氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基-L-L-赖氨赖氨酰酰-L-L-赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰-L-L-精氨酸乙酯盐酸等具有精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。o（4 4）聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基处理剂；

24、聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等。3 3、食品工业、食品工业o营养强化剂；营养强化剂；o谷氨酸钠味精；谷氨酸钠味精；o天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口；凉感并使香味浓厚爽口；o天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素APMAPM4 4，农业，农业o（1 1）杀虫剂：刀豆氨酸、）杀虫剂：刀豆氨酸、5-5-羟色氨酸可使南方毛羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二

25、硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果；衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果；o（2 2）杀菌剂：）杀菌剂：N-N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病； -1-1，4 4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等；环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等；o（3 3）除草剂：如除草剂：如N-3,4N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；等；5、化妆品工业o氨基酸能调节皮肤氨基酸能调节皮肤pHpH的变动，对细菌的防护作用，也可的变动，对细菌的防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。

26、o防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。o在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。可防止皮肤老化。2.3 蛋白质的分子结构o蛋白质（蛋白质（protein）：由氨基酸首尾相连）：由氨基酸首尾相连而成的共价多肽链，是一类高分子化合物；而成的共价多肽链，是一类高分子化合物；o是生物体的主要组成物质之一，是生命活是生物体的主要组成物质之一，是生命活动的基础，是生命的体现者。动的

27、基础，是生命的体现者。o蛋白质是具有特定分子结构的高分子化合物。蛋白质是具有特定分子结构的高分子化合物。o蛋白质的分子结构可人为划分为一、二、三、蛋白质的分子结构可人为划分为一、二、三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构，即四级结构均属于空间结构，即构象构象。o构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）非共价键（次级键）来维来维系。系。蛋白质结构的主要蛋白质结构的主要层次层次一级结构一级结构四级结构四级结构二级结构二级结构三级结构三级结

28、构primary structuresecondary structureTertiary structurequariernary structure超二级结构超二级结构结构域结构域 supersecondary structureStructure doman2.3.1 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构o蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中是指蛋白质多肽链中通过肽键连接起来的氨基酸的排列顺序，通过肽键连接起来的氨基酸的排列顺序，即多肽链的线状结构。即多肽链的线状结构。o维系蛋白质一级结构的主要化学键为维系蛋白质一级结构的主要化学键为肽肽键键。o胰岛素（胰岛素（InsulinI

29、nsulin）由）由5151个氨基酸残基组成，个氨基酸残基组成，分为分为A A、B B两条链。两条链。A A链链2121个氨基酸残基，个氨基酸残基，B B链链3030个氨基酸残基。个氨基酸残基。A A、B B两条链之间通过两条链之间通过两个两个二硫键二硫键联结在一起，联结在一起，A A链另有链另有一个链内二硫键一个链内二硫键。 肽键的一些特性：肽键的一些特性： 1 1）显示部分双键的性质；）显示部分双键的性质； 2 2）不能旋转）不能旋转; ;肽单位呈刚性平面结构；肽单位呈刚性平面结构； 3 3）呈反式构型）呈反式构型;(;(有有ProPro参与时例外参与时例外) )。 它在多肽和蛋白质折叠形

30、成特定的构象过程中起着它在多肽和蛋白质折叠形成特定的构象过程中起着非常重要的作用。非常重要的作用。o肽平面肽平面（peptide plane）即酰胺平面（即酰胺平面（amide plane）由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。为肽键平面或肽单元。2.3.2 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构o蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链主链原子是指蛋白质多肽链主链原子局部的空间结构，但不包括与其他肽段的相互局部的空间结构，但不包括与其他肽段的相互

31、关系及侧链构象的内容。维系蛋白质二级结构关系及侧链构象的内容。维系蛋白质二级结构的主要化学键是的主要化学键是氢键氢键。2.3.2.1 蛋白质立体结构原则：蛋白质立体结构原则： 1. 1. 由于由于C=OC=O双键中的双键中的电子云与电子云与N N原子上的未原子上的未共用电子对发生共用电子对发生“电子共振电子共振”，使，使肽键具有部肽键具有部分双键的性质分双键的性质，不能自由旋转。，不能自由旋转。 2.2.与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构，与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构，即即肽单元或肽键平面肽单元或肽键平面。但由于。但由于-碳原子与其他碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平

32、面原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转。可以作相对旋转。2.3.2.2 蛋白质二级结构的类型：蛋白质二级结构的类型：o蛋白质的二级结构主要包括蛋白质的二级结构主要包括- -螺旋，螺旋，- -折迭，折迭，- -转角及无规卷曲转角及无规卷曲等几种类等几种类型。型。1. -螺旋螺旋：o-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象，其结构特征为：成的有规律的螺旋构象，其结构特征为： 为一为一右手螺旋右手螺旋； 螺旋每圈包含螺旋每圈包含3.63.6个氨基酸残基，个氨基酸残基， 螺距为螺距为5.445.44埃；埃；每个残基偏转每个

33、残基偏转100; 螺旋以螺旋以氢键氢键维系。维系。一个残基的一个残基的C=O氧与后面第氧与后面第四个四个(隔隔3个个)残基的残基的NH的氢之间形成氢键。氢键的氢之间形成氢键。氢键与螺旋轴近乎平行与螺旋轴近乎平行; o影响影响- -螺旋稳定的因素有：螺旋稳定的因素有： 极大的侧链基团（存在空间位阻）极大的侧链基团（存在空间位阻）如多个如多个侧链较大的氨基酸侧链较大的氨基酸(Ile,Trp,Phe(Ile,Trp,Phe等等) ) ； 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应）；残基（同种电荷的互斥效应）； 有有ProPro等亚氨基酸存在（不能形

34、成氢键等亚氨基酸存在（不能形成氢键, ,且且- - C C原子参与吡咯环的形成原子参与吡咯环的形成, ,环内环内C-C-N N和和C-NC-N键不能旋转）。键不能旋转）。 2 -2 -折迭：折迭：o-折迭是由若干肽段或肽链排列起折迭是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象，其结构来所形成的扇面状片层构象，其结构特征为：特征为： 由若干条肽段或肽链平行或反平行由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成排列组成片状结构片状结构； 主链骨架伸展呈主链骨架伸展呈锯齿状锯齿状； 借相邻主链之间的借相邻主链之间的氢键氢键维系。维系。- -折迭包括平行式和反平行式两种类型折迭包括平行式和反平行式两种类型

35、3. 3. -转角：转角：o-转角转角（ U形转折,发夹结构）：是多肽链是多肽链180180回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为： 主链骨架本身以大约主链骨架本身以大约180180回折回折; ; 回折部分通常由四个氨基酸残基构成回折部分通常由四个氨基酸残基构成; ; 构象依靠第一残基的构象依靠第一残基的-CO-CO基与第四残基的基与第四残基的-NH-NH基基之间形成氢键来维系。之间形成氢键来维系。 (4) 主要有两种类型：主要有两种类型：I 型和型和II型；二者主要差别型；二者主要差别是中央肽基旋转了是中央肽基旋转了1800， (5) 一些氨基酸

36、如一些氨基酸如Pro、Gly经常出现在经常出现在 -转角中；转角中； II型型 -转角中的第三个氨基酸残基总是转角中的第三个氨基酸残基总是Gly。 3.3.2.5 3.3.2.5 无规卷曲：无规卷曲：o无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。曲构象。o约占球蛋白分子结构的一半；蛋白质（酶）的功约占球蛋白分子结构的一半；蛋白质（酶）的功能部位常常位于这种构象之中。能部位常常位于这种构象之中。RNaseRNase的分子结构的分子结构-螺旋螺旋-折迭折迭-转角转角无规卷曲无规卷曲o在蛋白质分子中，若干具有二级结构的肽段在空在蛋白质分子中，若干具有二

37、级结构的肽段在空间上相互接近，形成具有特殊功能的结构区域，间上相互接近，形成具有特殊功能的结构区域，称称模序模序（motif)motif)或超二级结构。或超二级结构。o主要有以下三种基本形式：主要有以下三种基本形式：测定蛋白质的一级结构的主要意义：测定蛋白质的一级结构的主要意义：o 一级结构是研究高级结构的基础。一级结构是研究高级结构的基础。o 可以可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系。关系。o 可以为生物进化理论提供依据可以为生物进化理论提供依据o 可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。3.4 蛋白质测序蛋白质测序o在镰刀

38、状红细胞贫血患者中，由于基因突在镰刀状红细胞贫血患者中，由于基因突变导致变导致血红蛋白血红蛋白-链第六位氨基酸残基链第六位氨基酸残基由谷氨酸改变为缬氨酸由谷氨酸改变为缬氨酸，血红蛋白的亲水，血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集，使红细胞变性明显下降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状。为镰刀状。 测多肽链数测多肽链数拆分多肽链拆分多肽链断开链内二硫键断开链内二硫键氨基酸组成分析氨基酸组成分析鉴定鉴定N N末端和末端和C C末端残基末端残基裂解多肽链裂解多肽链测各肽段氨基酸序列测各肽段氨基酸序列“片段重叠片段重叠”法推出一级结构法推出一级结构二硫键定位二硫键定位基本步骤基本步骤3.4.1 蛋白质

39、测序的基本方法路线 氨基酸顺序分析氨基酸顺序分析o 蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要包括以下几个步骤：结构的测定，主要包括以下几个步骤： 1. 1. 分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品。分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品。 2. 2. 取一定量的样品进行完全水解，再用氨基酸取一定量的样品进行完全水解，再用氨基酸自动分析仪，测定蛋白质的氨基酸组成。自动分析仪，测定蛋白质的氨基酸组成。 基本步骤：纯化蛋白质纯化蛋白质密封真空管内水解（密封真空管内水解（6 N HCl，1100C，24 h） 离子交换分离得到的离子交换分离得到的氨基酸氨基酸用茚三酮（用茚三酮（ninhydrin）或荧光胺）或荧光胺（fluorescamine）等试剂显色）等试剂显色定性和定量定性和定量（与同样处理的标准氨基酸比较）。（与同样处理的标准氨基酸比较）。 3. 3. 采用特异性的酶（如胰蛋白酶）或采用特异性的酶（如胰蛋白酶）或化学试剂（如溴化氰）将蛋白质裂解成为化学试剂（如溴化氰）将蛋白质裂解成为长短不一的若干条肽段（必须作两套）。长短不一的若干条肽段（必须作两套）。 BrCNBrCN的裂解作用的裂解作用多肽裂解专一试剂：多肽裂解专一试剂：胰蛋白酶胰蛋白酶糜蛋白酶胃蛋白酶溴化氰胰蛋白酶（胰蛋白酶（t