氨基酸、肽和蛋白质-ok

1、第十四章第十四章氨基酸、氨基酸、肽和蛋白质肽和蛋白质 Amino Acids, Peptides and Protein本章主要内容本章主要内容一、氨基酸一、氨基酸 (Amino Acid)（重点内容）（重点内容） （一）结构特点（一）结构特点 （二）（二）20 20 种基本氨基酸种基本氨基酸 （三）氨基酸的特性（三）氨基酸的特性 （四）氨基酸的合成与拆分（四）氨基酸的合成与拆分二、肽二、肽 (Peptides)三、蛋白质三、蛋白质 (Proteins)（简述简述）一、一、Amino Acidl分子中既含有氨基，又含有羧基的化合分子中既含有氨基，又含有羧基的化合物统称为氨基酸。物统称为氨基酸。

2、l 组成肽和蛋白质的结构单元分子组成肽和蛋白质的结构单元分子 a a- amino AcidCH3CHCOOHCOOHNH2NH2NH2CH2CH2COOHNH2CH2CH2CH2COOHa a-amino acid -amino acid -amino acido-amino benzoic acid一、一、Amino Acids（一）（一）Configuration When R H, a a-C is a chiral carbon, there are two stereoisomers (D and L- a a- amino acid) The amino acids in pro

3、tein molecules are the L- a a - amino acids. 20 standard amino acids in proteinsH2NHCOOHRHNH2COOHRL-a a-amino acidD-a a-amino acid（二）（二）20 standard amino acids+H3NCOO-H+H2NCOO-H+H3NCOO-HCH3+H3NCOO-HCH(CH3)2+H3NCOO-HCH2+H3NCOO-HCH(CH3)CH(CH3)2CH2CH3Glycine (Gly)Alanine (Ala)Valine (Val)Leucine (Leu)I

4、soleucine (Ile)Proline (Pro)甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸脯氨酸1. Nonpolar, aliphalic R groups (6)一、氨基酸一、氨基酸 (Amino Acids)（二）（二）20 standard amino acidsUV 特征吸收：特征吸收：l l = 280 nm+H3NCOO-HCH2+H3NCOO-HCH2+H3NCOO-HCH2Phenylalanine (Phe)Tyrosine (Tyr)Tryptophan (Try)苯丙氨酸酪氨酸色氨酸2. Aromatic R groups (3)NHOH（二）（二）20 standard

5、 amino acids+H3NCOO-HCH2OH+H3NCOO-HCHOH+H3NCOO-HCH2SH+H3NCOO-HCH2+H3NCOO-HCH2CH2SCH3CONH2Serine (Ser)Threonine (Thr)Cysteine (Cys)Methionine (Met)Asparagine (Asn)Glutamine (Gln)丝氨酸苏氨酸半胱氨酸甲硫氨酸（蛋氨酸）门冬酰胺谷氨酰胺3. Polar, uncharged R groups (6)CH3+H3NCOO-HCH2CH2CONH2一、一、Amino Acids（二）（二）20 standard amino ac

6、idsAcidic amino acidscontaining two carboxylic groups+H3NCOO-HCH2COO-Aspartate (Asp)Glutamate(Glu)门冬氨酸谷氨酸+H3NCOO-HCH2CH2COO-4. Negatively charged R groups (2)（二）（二）20 standard amino acidsBasic amino acids containing two amino groups+H3NCOO-HCH2CH2Lysine (Lys)Arginine (Arg)赖氨酸精氨酸+H3NCOO-HCH2CH2CH25.

7、Positively charged R groups (3)CH2CH2NH3+NHCNH2NH2+H3NCOO-HH2CHNNHguanidinoimidazoleHistidine组氨酸Histidine (酸碱催化中的重要氨基酸酸碱催化中的重要氨基酸)COOHCH2H3NCOOHH2CH3NpKa=6.00HNNNNHCOOHH2CH3NHNNH+COOHH2CH3N+HNNHH+-H+Essential amino acidslThe amino acids that must obtain from our diets because we either cannot synthe

8、size them at all or cannot synthesize them in adequate amountsl10 essential amino acids: Val, Leu, Ile, Thr, Met, Lys, Arg, Phe, His, Try一、一、Amino Acids（三）（三）Properties of Amino Acids旋光性旋光性 (optical activity)酸碱性酸碱性 (acid-base properties) (1) 氨基酸既是酸又是碱氨基酸既是酸又是碱+H3N C HCOO-R物理性质：物理性质： 高熔点固体；高熔点固体； 易溶于

9、水，不溶于非极性溶剂。易溶于水，不溶于非极性溶剂。氨基酸在结晶状态或在接近中性的溶液中，是氨基酸在结晶状态或在接近中性的溶液中，是以两性离子以两性离子 (dipolar ion) 的形式存在的。是一的形式存在的。是一种内盐种内盐 (inner salt)。 Amino acid act either as an base (proton acceptor)R C COO-NH3+HR C COO-NH2H+H+R C COO-NH3+HR C COOHNH3+H+H+Amino acids are ampholytes (两性电解质两性电解质)。2. 酸碱性（酸碱性（Acid-Base Pro

10、perties）(1) 氨基酸既是酸又是碱氨基酸既是酸又是碱 Amino acid act either as an acid (proton donor)2. 酸碱性（酸碱性（Acid-Base Properties） (2) Isoelectric Point (氨基酸的等电点氨基酸的等电点)如果在某一如果在某一pH 值下，氨基酸所带正电荷的数目值下，氨基酸所带正电荷的数目与负电荷的数目正好相等，即与负电荷的数目正好相等，即净电荷为零净电荷为零，则，则称该称该 pH 值为该氨基酸的值为该氨基酸的等电点等电点 (pI)。R C COO-NH3+HI11+R C COO-NH2HIII1Low

11、 pHHigh pHOH-H+K1R C COOHNH3+HII1OH-H+K2k 等电点时，等电点时，amino acids 几乎全部以两性几乎全部以两性离子离子 I 的形式存在的形式存在, 并伴以极少量、严格并伴以极少量、严格相等的相等的 II 和和 III。 处于等电点的氨基酸，其溶解度最小。处于等电点的氨基酸，其溶解度最小。 pI 与解离常数与解离常数 pK间的关系间的关系 Neutral amino acids: pI = (pK1 + pK2)/2 Acidic amino acids : pI = (pK1 + pKRCOOH)/2 Basic amino acids : pI

12、= (pK1 + pKRNH2)/22.酸碱性（酸碱性（Acid-Base Properties） (2) Isoelectric PointTitration Curve and pICalculation of pI (1)HCCOOHNH3HCCOONH2HCCOOpK1pK2low pHpIhigh pH电荷1111编号H3NCH3CH3CH3Calculation of pI (2)N+H3CH2CH2CH2CH2CHCOOHNH3pK1N+H3CH2CH2CH2CH2CHCOO-NH3pK2N+H3CH2CH2CH2CH2CHCOO-NH2pKNH2NH2CH2CH2CH2CH2C

13、HCOO-NH222 11 11Calculation of pI (3)HOOCCH2CH2CHCOOHNH3pK1HOOCCH2CH2CHCOO-NH3pKCOOH-OOCCH2CH2CHCOO-NH3pK2-OOCCH2CH2CHCOO-NH222 11 11 (2) Isoelectric Point pH pI, 样品带样品带负电荷负电荷，样品点向，样品点向阳阳极移动极移动 pH = pI, 样品样品不带电荷不带电荷，样品点，样品点不移动不移动纸电泳纸电泳 (Paper electrophoresis) (2) Isoelectric Point例题与习题例题与习题现在有四个氨基酸：

14、苯丙氨酸现在有四个氨基酸：苯丙氨酸pI=5.5、脯氨酸、脯氨酸pI=6.3、门冬、门冬氨酸氨酸pI=2.8和赖氨酸和赖氨酸pI=9.7，请问在以下，请问在以下pH条件下进行电条件下进行电泳，各氨基酸的主要存在形式是什么？在外电场作用下，泳，各氨基酸的主要存在形式是什么？在外电场作用下，移向阳极还是阴极？移向阳极还是阴极？ 苯丙氨酸苯丙氨酸 脯氨酸脯氨酸 门冬氨酸门冬氨酸 赖氨酸赖氨酸（1）pH=7.0（2）pH=6.0（3）pH=5.0（4）pH=2.0正正 阴极阴极 正正 阴极阴极 负负 阳极阳极 正正 阴极阴极负负 阳极阳极 负负 阳极阳极 负负 阳极阳极 正正 阴极阴极正正 阴极阴极 正

15、正 阴极阴极 正正 阴极阴极 正正 阴极阴极负负 阳极阳极 正正 阴极阴极 负负 阳极阳极 正正 阴极阴极Chemical Reactions of Amino Acids1) a a-氨基酸的特殊反应：氨基酸的特殊反应： 分子间失水分子间失水 茚三酮反应茚三酮反应 （鉴别反应鉴别反应）OOOHOHRCCOO-NH3+HOONO-O+Ninhydrina a-amino acidPurple product (or yellow for Pro)H3CNH2COOHHOONH2CH3+HNNHOOH3CCH3+ 2 H2O3. Chemical Reactions of Amino Acids

16、 2) 合成中的合成中的a a-氨基酸的保护反应：氨基酸的保护反应： 羧基的保护羧基的保护H2NCOOprolineCH2PhOHHCl(气体)H2NCOOCH2PhCHH3NCH2PhCOOCH2PhH2， PdCHH3NCH2PhCOOH3C+phenylalamine benzyl esterphenylalaminetoluene 氨基的保护氨基的保护3. 氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应2) 合成中的合成中的a a-氨基酸的保护反应：氨基酸的保护反应：CHH2NCH2CH(CH3)2COOHleucineCOClPhCH2OCHHNCH2CH(CH3)2COOHCOPhCH2ON-b

17、enzyloxycarbonyl leucineCH2O CONHCHCCH3OVal PheNH2CHCCH3OVal Phe+ CO2+CH3H2/Pd4. Synthesis of Amino acid还原氨化法还原氨化法a a-卤代酸的氨化卤代酸的氨化Gabriel-丙二酸酯合成法丙二酸酯合成法Strecker合成法合成法消旋产物消旋产物4. Synthesis of Amino acid还原氨化法还原氨化法实际是一步完成，又称为仿生合成实际是一步完成，又称为仿生合成CROCOOa a-酮酸(a a-ketoacid)+ NH3(过量)CRCOONHNH4亚胺(imine)H2/PdC

18、HRNH2COO(D，L)-a a-amino acidCPhCH2COOHO3-phenyl-2-oxopropanoic acidNH3，H2/PdCHPhCH2NH2COO NH4(D，L)-phenylalanine(ammonium salt)(30%)CHOOCCH2CH2COOO+NH4NHHCNH2sugar2-ketoglutaric acid+O+ HenzymeCHHOOCCH2CH2NH3COO+L-glutamic acidNHsugarNH2ONAD+ H2ONADH与生物与生物合成极合成极为相似为相似4. Synthesis of Amino acid2 2）-卤

19、代酸的氨化卤代酸的氨化 采用大大过量的氨采用大大过量的氨邻位羧基的影响，降低了邻位羧基的影响，降低了-氨基的亲核性能氨基的亲核性能因此，反应可以得到很好地控制因此，反应可以得到很好地控制CRH2COHOcarboxylic acid(1)Br2/PBr3(2)H2OCRHCOHOBra a-bromo acidNH3(大大过量)(D，L)-a a-amino acid(ammoniusm salt)CHCOORNH2NH44. Synthesis of Amino acid3 3）Gabriel-丙二酸酯合成法丙二酸酯合成法 用这种方法可以得到其他合成方法难以得到的用这种方法可以得到其他合成方

20、法难以得到的-氨基酸，如甲硫氨酸（蛋氨酸）氨基酸，如甲硫氨酸（蛋氨酸）CHCOOC2H5COOC2H5BrNNOOKOOCHCOOEtCOOEtNOOCCOOEtCOOEtR(1)OH-(2)RXH+， H2OCCOOHCOOHRH3NCO2加热CHH3NRCOOH(L，D)-a a-amino acid4. Synthesis of Amino acid4 4）Strecker合成法合成法 最早发现的合成方法最早发现的合成方法CH3CHO + NH3+ HCNH2OCH3CHCNNH2H3O+CH3CHCOOHNH3(D，L)-alamine(60%)反应机理如下：反应机理如下：CRHO+N

21、H3aldehydeH+imine- H2OCRHN HHCNCRHNHHCNCRHCNNH2a a-amino nitrileH3O+CRCOOHHNH3（D，L）-a a-amino acid(acidic form)5. Resolution of D- and L-Amino acidsL-amino acidD-amino acid+ 纯手性碱(或酸)L-氨基酸盐D-氨基酸盐分离(重结晶，色谱法等)COOHH2NRHHNH2RCOOHL-AAD-AACOOHHRH3CCHNHCOOHNHCCH3ROOacylaseCOOHH2NRHCOOHHRNHCCH3L-AAacetyl-D-A

22、AOracemic amino acid(CH3CO)2O化学法化学法非对映异构体非对映异构体酶法酶法酰基转移酶酰基转移酶6. Asymmetric Synthesis of D- and L-a a-Amino acidsNYXH2NO H*NYXNCCOOR*HydrogenationNYXNCCOOHRH*HydrogenolysisH2N CHRCO O H*+NYXHO H*HydrazonolactoneOptical pure amino acid.C CO ORO HH2O例例1：Corey 法法利用不对称前体合成方法利用不对称前体合成方法6. Asymmetric Synth

23、esis of D- and L-a a-Amino acids例例2：利用铑催化剂的不对称催化氢化反应：利用铑催化剂的不对称催化氢化反应OPPh2OPPh2Rh+BF4R3COOR1NHR2H2催化剂R3COOR1NHR2*H, H2O+R3COOHNH2蒋氏催化剂*讨论题：讨论题：查阅文献，了解手性纯氨基酸的合成研究查阅文献，了解手性纯氨基酸的合成研究 进展，小结主要的不对称合成途径。进展，小结主要的不对称合成途径。二、肽二、肽 (Peptides)Peptides 由两个以上氨基酸通过肽由两个以上氨基酸通过肽键（酰胺键）连接起来的化合物。键（酰胺键）连接起来的化合物。二肽（二肽（dipe

24、ptide）：）：2 amino acid residues寡肽（寡肽（oligopeptide ）：）：210 amino acid residues多肽（多肽（polypeptide ）：）： 10 amino acid residues蛋白质（蛋白质（protein ）：）：molecular weight 10 Kd二、肽二、肽 (Peptides)自然界存在多种肽类物质，如：自然界存在多种肽类物质，如： 青霉素青霉素 短杆菌肽短杆菌肽SNHOOCHNROOSPenicillineL-ValD-Cys脑啡肽脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu leucine enkephali

25、nTyr-Gly-Gly-Phe-Met methionine enkephalinL-ValD-OrnL-proD-PheL-LeuL-OrnL-ValL-ProL-PheL-Luegramicidin S肽的结构特征：肽的结构特征：Peptide bond 一分子一分子氨基酸的羧基与另一分子氨基酸的氨基失去氨基酸的羧基与另一分子氨基酸的氨基失去一分子水而形成的酰胺键。一分子水而形成的酰胺键。H2NCCOHHR1ONHCCOOHHR2HH2NCCHR1OHNCCOOHHR2peptide bondH2O二、肽二、肽 (Peptides)任何羧酸的羧基与任何胺的氨基形成的酰胺键是肽键吗？任何羧

26、酸的羧基与任何胺的氨基形成的酰胺键是肽键吗？Peptide Bonds肽键的平面特征肽键的平面特征二、肽二、肽 (Peptides)n 肽链的氨基酸顺序与命名肽链的氨基酸顺序与命名思考题：思考题：Are Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu and Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser same peptides?+H3NHCC NHCH2C NHCHC NHCHCNHCHCOO-OCH3OCH2CH2OOHOH2CCH(CH3)2OHSerGlyTyrAlaLeuN-terminateC-terminate命名以命名以C-端氨基酸为母体端氨基酸为母体丝氨酰丝氨酰-甘氨酰甘氨酰-色氨酰色氨

27、酰-丙氨酰丙氨酰-亮氨酸亮氨酸二硫键二硫键Disulfide bond The S-S bond in disulfide.二、肽二、肽 (Peptides)R SH2氧化硫醇二硫化物RS SRDisulfide BondsHair:Straight or curly?烫发的过程是一个旧二烫发的过程是一个旧二硫键还原打开而后又氧硫键还原打开而后又氧化形成新的二硫键过程化形成新的二硫键过程nDetermining the structure of peptides 1. 氨基酸组分分析氨基酸组分分析 2. 氨基酸顺序分析氨基酸顺序分析二、肽二、肽 (Peptides)纯多肽或蛋白质二硫键的拆分各

28、条肽链选择性水解(至少两种方法)小肽段氨基酸顺序分析各肽段的氨基酸顺序(至少两组)叠加法肽链的氨基酸顺序肽中氨基酸组分分析肽中氨基酸组分分析 The number and kinds of amino acids 6 N HCl, heating at 100oC for 24 h automated amino acid analyzerAmino Acids Analyzer肽中氨基酸顺序分析肽中氨基酸顺序分析 从从N-端测序：端测序：Edman降解法：可用于自动测序降解法：可用于自动测序N C SPITCNHCHHR1CONH CHR2CO+N-端氨基酸第一步CHNNHSPhCHR1C

29、NHOCHR2COHNCCHNHR1CSOPhNH CHR2COHNCH CNSR1ONHHCHPhR2COHNCHNSOPhR1+CHNh2R2CO第二步第三步PTH=苯乙内酰硫脲 (phenylthiohydrantoin)PTH-氨基酸PITC=异硫氰酸苯脂(phenyl isothiocyanate)HFH+适用于适用于50肽肽肽中氨基酸顺序分析肽中氨基酸顺序分析 C-端氨基酸残基的分析：羧肽酶端氨基酸残基的分析：羧肽酶羧肽酶是肽链外切酶（羧肽酶是肽链外切酶（exopeptidase），即它专门），即它专门催化水解肽链末端（即催化水解肽链末端（即C-端）的肽键。端）的肽键。CHHNR1

30、C NHOCHR2C NHOCHR3C OO羧肽酶断裂位点羧肽酶羧肽酶A水解断裂那些不是水解断裂那些不是Arg和和Lys的的C-端氨基酸端氨基酸羧肽酶羧肽酶B则仅水解断裂则仅水解断裂C-端为端为Arg或或Lys的氨基酸的氨基酸肽中氨基酸顺序分析肽中氨基酸顺序分析 多肽链的选择性水解：酶法和化学法多肽链的选择性水解：酶法和化学法化学法化学法溴化氰水解法，选择性切割甲硫氨酸的羧基溴化氰水解法，选择性切割甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。所形成的肽键。CHHNCH2CCH2NHOSH3CCHRCO+CBrN+-S CNH3C-Br-+H2OHCH2CH2COCHNHCHNNH CHRCO+CHH3NRCO

31、高丝氨酸内酯(homoserine lactone)CHHNCH2CCH2NHOSH3CCHRCOC NOO肽中氨基酸顺序分析肽中氨基酸顺序分析 采用重叠法得出整个肽链的氨基酸顺序采用重叠法得出整个肽链的氨基酸顺序T-1T-2T-3T-4GASMALIKNGAAWHDFNPIDPRQCVHSDWLIACGPMTKT-2T-3placed at N-terminuspalced at C-terminusC-1C-2C-3NGAAWHDFNPIDPRGASMTKQCVHSDALIKWLIACGPMNGAAWHDFNPIDPRGASMALIKWLIACGPMTKQCVHSDN-terminusC-

32、terminusT-2T-3T-4T-1C-1C-3C-2disulfide二、肽二、肽 (Peptides)Preparation of PeptidesThere are three ways to obtain a peptides: Purification from tissuekk Genetic engineering Direct chemical synthesis（化学合成）（化学合成） to synthesize Asp-Phe-OMe (Aspartame or NutraSweet, 150 sweeter than sucrose)Asp+PheDCC1. Asp-

33、Phe2. Phe-Asp3. Asp-Asp4. Phe-Phe -Asp-PheChemical Synthesis of Peptides 经典合成法经典合成法 N-端氨基保护端氨基保护 羧基的活化羧基的活化 与第二个氨基酸偶联与第二个氨基酸偶联 再活化羧基再活化羧基 与第三个氨基酸偶联与第三个氨基酸偶联 .去保护去保护benzyl choroformateCH2O COCl +CHH2NCH3COOHAlaCH2OCONH CHCH3COHO+ HCl氯代甲酸苄基酯(Z-Cl)Z-Ala苄氧羰基(carbobenzoxy group)，简称Cbz或ZNHCHZCH3COO+NHCHZC

34、H3COONCHNprotontransferDCC亚胺酯(imidate)protectedactivatedCNNCNNHNHCHZCNCHNOCH3CHNH(H3C)2HCCOOO Htetrahedral intermediateNHCHZCCH3ONHCHCOCH(CH3)2O+HNCHNOZ-Ala-Valdicyclohexylureanew peptide bondOCCHNH2OCH(CH3)2+.Chemical Synthesis of Peptides Solid-Phase Peptide Synthesis (1962, R. Bruce Merrifield)CH

35、2ClCH2OOCCHNH-tBocCHNHR1-OOCtBocR1cold CF3COOHCH2OOCCHNH3+R1CH2OOCCHNHCOCHNH-tBocR1CHNHR2-OOCtBocR2cold CF3COOHHF Hydrolysis-OOCCHNHCOCHNHCOR1R2(From C-terminate to N-terminate)Insoluble polystyrene beadChemical Synthesis of Peptides Solid-Phase Peptide Synthesis (1962, R. Bruce Merrifield)ABCDE固相合成

36、示意图固相合成示意图Chemical Synthesis of Peptides组合合成法：一次合成多种肽的混合物（多肽库）组合合成法：一次合成多种肽的混合物（多肽库）混合裂分法混合裂分法三次合成就得到三次合成就得到27个三肽的三种混合物库个三肽的三种混合物库Chemical Synthesis of Peptides组合合成法：一次合成多种肽的混合物（多肽库）组合合成法：一次合成多种肽的混合物（多肽库）光印迹法（光控合成法或光定向法）紫外光照后后切除保护基，得到的自由氨基可以紫外光照后后切除保护基，得到的自由氨基可以进一步反应进一步反应光印迹法（光控合成法或光定向法）采用蒙板覆盖控制采用蒙板覆盖控制UV灯照射区灯照射区域，则在定点区域发生反应域，则在定点区域发生反应光印迹法（光控合成法或光定向法）多次改换蒙板覆盖区域，则得到不同区域的不同的多次改换蒙板覆