无形体病标本采集运送及实验室检测

1、无形体病标本采集运送无形体病标本采集运送及实验室检测及实验室检测武汉市疾病预防控制中心微检科武汉市疾病预防控制中心微检科 曾莹春曾莹春2009.07.02，武汉，武汉标本采集运送标本采集运送n标本采集对象：标本采集对象：n疑似病例疑似病例n密切接触者或其他健康人群密切接触者或其他健康人群n疫源地可疑宿主动物（野生动物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。标本采集运送标本采集运送n标本的种类：标本的种类：n疑似病例血液疑似病例血液: 病人血液（抗凝血病人血液（抗凝血&非抗非抗凝血）凝血）n人粒细胞无形体病尸检标本人粒细胞无形体病尸检标本:病人脾脏、病人脾脏、肝脏各肝脏各1克克X3份。份。n密切接

2、触者或其他健康人群血：密切接触者或其他健康人群血：5mLX1份份n可疑野生动物及狗、羊、牛、吸血蜱、不可疑野生动物及狗、羊、牛、吸血蜱、不吸血蜱的脾脏、肝脏各吸血蜱的脾脏、肝脏各1克克X3份。份。不同标本的采集技术n无菌采集。无菌采集。n抗凝血标本：常用EDTA 抗凝管或枸橼酸盐抗凝管采集血液5ml，用于病原分离。应尽可能在病人使用抗生素前进行血液的采集。n非抗凝血标本：用标准无菌真空管，用于血清抗体及PCR 检测。采集后，应及时分离血清，将血清、血球分别保存。nPS-血清标本：不加任何抗凝剂。血清学检测需采集急性期与恢复期双份血清（至少间隔3周）。如果不能及时检测，应储存在-70或液氮中。如

3、果恢复期标本没有4倍升高，应建议医生采集第三份血（至少间隔2周）。尽量避免溶血。不同标本的采集技术采集动物体表媒介蜱，用镊子夹取，放入铺垫有潮湿滤纸或纱布的青霉素小瓶或试管中，用纱布包紧瓶口以防止蜱爬出。标本运送标本运送nB类包装n同时附流调资料、病历资料n标本运送 温度： 0- 4度标本采集的原则n检测的关键步骤检测的关键步骤n最佳采集时间、数量、种类最佳采集时间、数量、种类n广泛的思路：广泛的思路：检验人员需具备的流行病学和临床知识检验人员需具备的流行病学和临床知识n理想的信息记录：理想的信息记录：认真填写采样登记表、独立的编号规则认真填写采样登记表、独立的编号规则 n最佳保藏条件和方法：

4、最佳保藏条件和方法：带螺旋盖冻存管，带螺旋盖冻存管，4度、度、-70度度n明确责任人和联系方式明确责任人和联系方式实验室检测方法实验室检测方法n包涵体检测n血清学方法检测n分子生物学方法检测n病原体分离标本灭活、病原标本灭活、病原DNA 标本提取及病原体分离操作应在生物安全标本提取及病原体分离操作应在生物安全级实验级实验室进行。非感染性材料的检测可在生物安全室进行。非感染性材料的检测可在生物安全I 级实验室进行。级实验室进行。血细胞血细胞染色检查包涵体染色检查包涵体 厚血片法。厚血片法。 国际血液学标准化委员会推荐罗氏国际血液学标准化委员会推荐罗氏RomanowskyRomanowsky) )

5、染色为标准染色法。染色为标准染色法。 国内主要采用瑞氏（国内主要采用瑞氏（Wright)Wright)染色法、染色法、姬氏（姬氏（GiemsaGiemsa) )染色法或瑞染色法或瑞姬（姬（W-G)W-G)混混合染色法。染料加磷酸盐控制其合染色法。染料加磷酸盐控制其PHPH值，值，可克服使用瑞氏、姬氏染色中存在的缺可克服使用瑞氏、姬氏染色中存在的缺点。点。 Wright-Giemsa（中性粒细胞中可见桑葚状包涵体）（中性粒细胞中可见桑葚状包涵体） 血清学血清学检测方法间间接免疫接免疫萤萤光光实验实验(IFA)(IFA)采集急性期采集急性期与与恢恢复复期期双份双份血血清清，推荐，推荐国际国际质质量

6、量认证认证（ISOISO）的商）的商业产业产品（品（FOCUS)FOCUS)作作间间接免疫接免疫荧荧光光试验试验。FOCUS KIT微量间接免疫荧光法微量间接免疫荧光法 采集急性期与恢复期双份血清，采集急性期与恢复期双份血清，推荐推荐国 际 质 量 认 证 （国 际 质 量 认 证 （ I S OI S O ） 的 商 业 产 品） 的 商 业 产 品（FOCUS)FOCUS)作间接免疫荧光试验。作间接免疫荧光试验。IFAIFA检测检测结果按说明书进行结果按说明书进行 病人血清抗体病人血清抗体人粒细胞无形体抗人粒细胞无形体抗原原荧光标记的抗抗体荧光标记的抗抗体结果观察结果观察IFAIFA检测检

7、测HGAIgMHGAIgM抗体阳性结抗体阳性结果（感染细胞胞浆内可见果（感染细胞胞浆内可见黄绿色荧光包涵体）黄绿色荧光包涵体）IFAIFA检测检测HGAIgMHGAIgM抗体阴性结抗体阴性结果（感染细胞胞浆内无黄果（感染细胞胞浆内无黄绿色荧光包涵体）绿色荧光包涵体）间接免疫荧光法间接免疫荧光法n急性期血清：急性期血清：IgM 1:32, IgG 1:64 有参考有参考意义。意义。n恢复期双份血清恢复期双份血清: IgM或或IgG四倍增长有诊四倍增长有诊断参考意义。断参考意义。抗体交叉现象抗体交叉现象n斑点热：斑点热：n埃立克体病：埃立克体病：n嗜吞噬无形体：嗜吞噬无形体：nQ热：热：n立克次体

8、：斑疹伤寒立克次体：斑疹伤寒分类分类用途用途 血清学诊断在发病一周内往往检测不到抗血清学诊断在发病一周内往往检测不到抗体体, ,而病原分离操作复杂而病原分离操作复杂, ,且分离率十分低。以且分离率十分低。以PCR PCR 扩增及测序为主要手段的分子生物学技术扩增及测序为主要手段的分子生物学技术目前已取代病原分离作为直接诊断依据。目前已取代病原分离作为直接诊断依据。16SrRNA16SrRNA基因检测：基因检测： PCRPCR检测无形体最常用的扩增基因是检测无形体最常用的扩增基因是16SrRNA16SrRNA，该方法已在国际上普遍应用并得到良好的方法学，该方法已在国际上普遍应用并得到良好的方法学

9、评估。采用无形体及埃立克体属通用引物及种特异分型引评估。采用无形体及埃立克体属通用引物及种特异分型引物同时进行检测物同时进行检测, ,可以区分无形体与埃立克体。但要特别注可以区分无形体与埃立克体。但要特别注意意PCRPCR检测应分区进行，避免污染。检测应分区进行，避免污染。无形体无形体PCRPCR检测（巢式检测（巢式PCRPCR）为提高为提高PCR PCR 方法的特异性方法的特异性, ,目前巢式目前巢式PCR PCR 已普遍取代已普遍取代常规常规PCRPCR。如。如17KD 17KD 、gltAgltA 、ompBompB 、56KD56KD， 巢式巢式PCR PCR 分别被用来检测斑疹伤寒分

10、别被用来检测斑疹伤寒群和斑点热群、恙虫病立群和斑点热群、恙虫病立克次体、无形体。克次体、无形体。巢式巢式PCRPCR当靶基因表达量较低或常规当靶基因表达量较低或常规PCRPCR无法得到理想的扩增产物时，无法得到理想的扩增产物时，对靶基因进行第二次扩增以获得足够和特异的扩增产物对靶基因进行第二次扩增以获得足够和特异的扩增产物。外引物对外引物对内引物对内引物对无形体及埃立克体巢氏无形体及埃立克体巢氏PCRPCR检测检测16SrRNA16SrRNA基因常用引物基因常用引物通用通用引物引物埃立埃立克体克体无形无形体体无形无形体体uDNADNA抽提抽提材料材料疑似病例的全血标本疑似病例的全血标本QIAGENQIAGEN公司的公司的DNADNA