通脉口服液对实验性糖尿病肾病模型大鼠肾脏病理及转化生长因子β1的阻碍

1、通脉口服液对实验性糖尿病肾病模型大鼠肾脏病理及转化生长因子B1的阻碍【摘要】【目的】观看通脉口服液对实验性糖尿病肾病（DN）模型大鼠肾脏病理及转化生长因子B1（TGFB1）的阻碍。【方式】选用SD雄性大鼠，随机分为正常对照组（8只），腹腔注射等剂量无菌柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液，饲一般饲料；其他动物（32只）为造模组给予链服佐菌素（STZ,剂量为55mg/kg）单次腹腔注射，隔日饲高脂饲料；4周后挑选DN成模大鼠共21只，随机分为模型组（11只）、通脉组（10只）。通脉组给予通脉口服液（剂量为g-kg-1-d-1）,正常对照组及模型组给予生理盐水灌胃，饲料同前。6周后处死大鼠取肾组织，光学显微镜及

2、电子显微镜下观看肾脏组织形态及超微结构转变，测量肾小球截面积（AMG）、细胞外基质截面积（AMM）、肾小球基底膜（GBM）厚度,计算AMM/AMG比值；同时采纳免疫组化法测定肾组织TGFP1蛋白表达。【结果】肾组织病理形态学：通脉组系膜区增宽、基底膜增厚及肾小管上皮细胞空泡变性等均较模型组明显减轻；通脉组AMM/AMG值较模型组降低；GBM厚度较模型组变薄（均PV）；TGF81要紧定位在肾小管及间质处，肾小球表达较弱，通脉组免疫组化染色面密度及积分光密度均较模型组降低（P）。【结论】益气活血中药复方通脉口服液可能通过抑制肾组织TGF81表达，减轻肾脏病理损害，发挥对DN的肾脏爱惜作用。【关键词

3、】通脉口服液/药理学；糖尿病肾病/中药疗法；肾组织/病理学；肾组织/超微结构；疾病模型，动物；大鼠糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最多见的慢性并发症之一。在我国DN约占终末期肾病的15%,且以每一年8%-10%的速度递增lo有关DN的防治研究一直是医学研究的重点。DX的要紧病理学改变是肾小球基底膜(GBM)增厚及系膜区基质增生，这些转变的组织学基础是细胞外基质(ECM)不适当的积聚2o转化生长因子B(TGF8)是DN发生、进展中最重要的一个细胞因子，在人类肾脏中以81为主。TGFB1能够在基因表达、转录及其他多方面调剂ECM成份的生成及降解，诱导肾脏肥大3。本

4、实验观看了通脉口服液对DN模型大鼠肾脏病理及TGF31蛋白表达的阻碍，现报导如下。1材料与方式动物SPF级雄性SD大鼠40只，体质量260280g(广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0017114)。药物、试剂与仪器通脉口服液为广东省中医院自制制剂，批号：06080709；链服佐菌素（STZ）由美国Sigma公司提供，历时以L（pH无菌柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配制成10mg/L的STZ溶液，即配即用；免疫组化SP二步法测大鼠肾组织TGFB1用试剂盒由博士德生物工程提供；EICACUT型超薄切片机为德国LEICA公司产品；EclipseE800型光学显微镜为日本Nikon公司产品；JEM1

5、200EX型透射电镜为日本电子株氏会社产品；HMIAS2000型高清楚度彩色病理图文分析系统为武汉千屏影像技术有限责任公司产品。糖尿病肾病大鼠模型的复制4取SPF级SD雄性大鼠40只，自由饮水和进食3d以适应环境后随机分为正常对照组（8只）、造模组（32只）。造模组在禁食不由水24h条件下，单次腹腔注射STZ（剂量为55mg/kg）,禁食不由水6h,72h后尾静脉取血测血糖，取空肚血糖（FBG）值2L大鼠继续造模，隔日饲以高脂饲料；正常对照组一样条件下腹腔注射一样剂量无菌柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液，饲以一般饲料。4周末于尾静脉采血测血糖,代谢笼法测24h尿蛋白定量，以FBG值2L,24h尿蛋白定量

6、220mg判定为D大鼠造模成功。分组与给药共有21只大鼠达到DN模型标准。随机分为模型组11只、通脉组10只。造模进程中，大鼠共死亡4只，缘故考虑为STZ毒性及高血糖。大鼠的用药量依照成人经常使用药量及人体与大鼠体表面积换算。正常对照组、模型组以生理盐水10mL-kg-l-d-l剂量灌胃；通脉组以通脉口服液-kg-l-d-l剂量灌胃（历时以生理盐水稀释浓度为mL）。观看指标干与6周后共存活大鼠：正常对照组7只，模型组6只，通脉组7只。光学显微镜检查及形态学检测结果判定标准每组随机抽取6只大鼠肾组织制备标本，行过碘酸一雪夫反映（PAS）染色，光镜下观看肾脏的组织形态学转变，400倍视野下，每张切

7、片随机搜集20个肾小球图像，导入病理图文分析系统，测量肾小球截面积（AMG：肾小球在切片中的横截面积）、细胞外基质截面积（AMM：肾小球横截面中PAS阳染面积），计算细胞外基质截面积/肾小球截面积比值（p二AMM/AMGX100%）o透射电子显微镜检查及GBM厚度测定标准每组随机抽取3例标本，每例标本随机挑选3个肾小球行电镜检测。电镜下观看肾脏的组织形态学转变，20000倍视野下，随机搜集图像导入病理图文分析系统，选取与上皮细胞足突垂直处的肾小球毛细血管基底膜测量GBM厚度。每一个小球随机测量30处，以平均厚度纳入统计。TGF81蛋白表达系统定标，显微摄像系统400倍视野下，每张标本随机选取1

8、0个视野采图，将图像导入图像分析系统，选取免疫组化分析模块进行分析，以均值计算每例标本的阳性目标面积（A阳性目标）、面密度（p二A阳性目标/A统计场X100%）、积分光密度（D积分二D平均XA阳性目标）。统计学处置采纳统计软件包成立数据库，并进行统计分析。采纳双侧查验（Q二，多组间均数比较应用单因素方差分析。2结果各组DN大鼠肾组织形态与比较正常对照组见肾小球体积、细胞形态和结构正常，间质未见炎细胞浸润及纤维化，各级肾小管及集合管结构清楚，肾小管管腔、刷状缘、细胞浆颗粒及细胞核均未发觉明显异样改变；模型组见肾小球体积增大，大小不均，系膜区增宽，球内部份PAS染色阳性区域成团块状，基底膜不均一性

9、增厚；通脉组见肾小球体积轻度增大，系膜区轻度扩大，部份肾小球仍存在毛细血管基底膜不均一增厚，但较模型组有所改善，结果见图1。各组细胞外基质截面积/肾小球平均截面积转变模型组AMM/AMG比值较正常对照组增加，通脉组AMM/AMG比值较模型组降低，组间比较不同均有显著性意义（P,结果见表1。表1各组形态学指标比较统计方式：单因素方差分析；P,与正常对照组比较；P,与模型组比较各组大鼠肾组织超微结构比较正常对照组见肾小球和小管结构完好，系膜基质无增多,GBM结构完好，无电子致密物沉积；模型组可见GBM模糊、非均质增厚，基膜呈电子密度不均匀的絮状，系膜区弥漫增宽，系膜基质增多，系膜细胞突起和系膜基质

10、向毛细血管襟的周边部扩展，足细胞突起时期性融合；通脉组见肾小球和肾小管变性状态、系膜区及GBM结构均较模型组明显改善，系膜区内系膜基质轻度向周边扩展，足细胞突起仅有时期性融合，结果见图2。各组肾小球基底膜厚度转变模型组GBM较正常对照组明显增厚，不同有显著性意义（P<；通脉组GBM较模型组明显变薄，不同有显著性意义（PV结果见表2o表2各组肾小球基底膜厚度转变统计方式：单因素方差分析；PV,与正常对照组比较；P,与模型组比较各组对实验性DN大鼠肾组织TGF81蛋白表达的阻碍正常对照组在肾小管及间质处有弱阳性表达，肾小球内有极少量表达；模型组在肾小管及间质区内有强阳性表达，呈铁锈色，肾小球

11、内表达较弱；通脉组在肾小管及间质区内有阳性表达，肾小球内表达较弱，染色面积及积分光密度均较模型组降低，不同有显著性意义（P）,结果见表3、图3。表3各组TGF81免疫组化染色面密度统计方式：单因素方差分析；：P,与正常对照组比较；：P,与模型组比较3讨论灵枢五变云：“五脏皆柔弱者，善病消瘴”，由“消渴”迁延而至发生肾病，外虽多责之于饮食不节，将养失宜，但正气不足是其发病关键。消渴之初，阴虚燥热；久那么失于将养，耗气伤津，气阴两伤；阳能化气，阴阳互根，再进那么气伤、阳损。纵观步入肾病后的发病进程，气虚占了主导地位。病久入络，血脉滞涩，临床患者多见舌有瘀斑，脉细涩等；现代有关研究也证明，DN常伴有

12、高凝状态和高脂血症，可加重微血管病变、致使肾血管硬化。瘀由虚生，又常阻络，变生诸症，是贯穿病程始终的重要邪实兼证。故针对DN防治,杨霓芝教授提出：初期发觉、初期医治、初期防变是阻断DN进展的关键，宗“治未病”思想，对DN及早干与；“气虚血瘀”可涵盖早、中期DN的大体病机，故益气活血是早、中期DN的大体医治大法。临证选药方面，杨霓芝教授以“益气活血”为组方原那么，研制出了院内纯中药制剂“通脉口服液”，动物实验及体外细胞培育初步证明通脉口服液能够抑制系膜细胞及细胞外基质(ECM)的增生，延缓肾小球硬化，阻断肾小球系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路中信号调剂激酶(ERK)通路，对炎症及细胞

13、因子网络进行调控可能是其要紧的作用机制5-7。DN的大体病理改变是肾小球系膜区无细胞性增宽和肾小球基底膜(GBM)弥漫性增厚，渐至肾小球硬化，和慢性肾炎病理有相似的地方，临床应用通脉口服液医治早、中期DN,也符合祖国医学“异病同治”的理论。DX肾脏病理学改变的组织学基础是ECM不适当的积聚。糖尿病肾病时通太高血糖、肾脏高滤过、肾素一血管紧张素活性亢进、血脂代谢异样等因素致使TGF81表达上调，作用于肾小球硬化形成的诸多环节8o该致肾脏硬化作用要紧通过下述几方而实现：增进ECM的产生；调剂基质金属蛋白酶/金属蛋白酶抑制物(MMPs/TIMPs)系统，降低MMPs的活性，合成及增进TIMPs的产生

14、，作用于己合成的ECM,减少其降解；刺激细胞表达与细胞组分相结合的受体，阻碍细胞与基质的彼此作用，调剂靶细胞产生ECM；通过作用于细胞周期相关蛋白调剂细胞周期，使肾小球固有细胞的增生受到抑制，诱导其肥大3o多项研究说明在肾脏局部存在TGFP1表达异样，参与DX的病理转变8o本研究显示：实验性DN模型大鼠经通脉口服液干与后，肾组织病理形态学见系膜区增宽、基底膜增厚及肾小管上皮细胞空泡变性等转变均较模型组明显减轻；定量测量AMM/AMG比值降低，GBM变薄，TGFP1免疫组化染色面密度及积分光密度均较模型组降低,不同有显著性意义(P。能够以为通脉口服液能够降低TGF81在实验性DN模型大鼠肾脏中的

15、表达，改善其肾脏病理损害。通脉口服液以“益气活血”为组方原那么，要紧成份为黄黄、田三七等。黄黄化学成份众多，要紧含有皂甘类、黄酮类、多糖类等有效成份。田三七要紧有效成份是三七总甘，其中又包括了20多种单体成份，以人参皂件Rb一、Rgl为主，另外还含有黄酮、氨基酸、糖类及各类微量元素等，成份复杂，药理作用普遍。多项临床及实验研究说明：黄茂、以黄茂为要紧组方成份的复方及以黄苗要紧成份提取制备的注射剂可有效减轻DN患者尿蛋白，爱惜肾功能，降低实验性糖尿病肾脏动物的血糖、血脂9T1；田三七可降低糖尿病肾病患者尿蛋白，改善并发的血液高凝状态。肾间质纤维化是决定肾脏病进展的重要因素，研究显示:12-13：

16、田三七能够明显抑制肾成纤维细胞及肾小管上皮细胞的异样增殖及表型转化，减少ECM沉积，具有抗肾间质纤维化的活性。通脉口服液可能通过其要紧成份，降低TGF81在肾组织中的表达，从而改善实验性DN模型大鼠肾脏病理损害，这可能是其发挥DN肾爱惜作用的机制之一。【参考文献】1王海燕.肾脏病学M.北京:人民卫生出版社,1995:949.2肖谦，汪恕萍.基质金属蛋白酶及其抑制因子与糖尿病肾病研究进展研.现代医药卫生，2003,19(12)：1555.3LaihoM,DecapiroJA,LudlowJW,etal.GrowthinhibitionbyTGFPlinkedtosuppressionofreti

17、noblastomaproteinphosphorylationj.Cell,1990,62(1):175.4郭啸华，刘志红，李恒，等.实验性2型糖尿病大鼠模型的成立J.肾脏病与透析肾移植杂志，2000,9(4):351.5钟丹，毛炜，杨霓芝，等.中药复方通脉口服液对IL1B诱导肾小球系膜细胞ERK通路活化的阻碍J.辽宁中医杂志，2007,34(8):1053.6杨霓芝，包良，王立新，等.通脉口服液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学研究J.广州中医药大学学报，2000(4):332.7杨霓芝,包鼠王立新,等.通脉口服液对大鼠慢性肾炎气虚血瘀证模型的组织形态学阻碍J.中国中医药信息，2001,8(3):31.8韩晓芳，潘时中.转化生长因子B与糖尿病肾病J.医学综述,2005,11(6)：509.9邱假设旗，王桂玲.黄芭注射液对糖尿病肾病患者尿白蛋白及TGFB1的阻碍J.中国老年学杂志，2006,2