分析报告格式

1、关于微生物产品可行性分析报告论文格式：1.全文字数不少于3500字(此为毕业论文开题报告字数要求，故此数值)，插入页码。2.全文（包括参考文献部分）字体统一为5号宋体，但不同标题字号有所不同，具体看下面模板的批注部分。3.参考文献须在文中具体引用处标示出，引用方法如，1。参考文献部分格式请参考文后，不少于15篇。4.技术路线部分最好以简洁的框架形式列出，这样外人一看可以一目了然。5.关于报告部分上交时间为17周的上课时间，可交电子稿至本人邮箱，也可打印稿，但也须交电子稿一份。PPT答辩时间为16周的周一，每组一名代表即可。6.最后感谢黄丰成同学的建议，使得大家可以拿到统一格式的报告模板。包括我

2、本人十分感谢有同学提出这么好的建议，是我考虑不周的失误，也欢迎其他同学对微生物学及实验课方式、方法等提出建议或意见,可以直言，(学校邮箱容量太小，论文和建议都可发至此邮箱，谢谢)。酸性淀粉酶产生菌株的分离报告题目，小二，宋体，加粗、鉴定作者1,2,3,4(浙江大学宁波理工学院，08生物技术班)大标题下方空两行1 空半格产品研究的背景和意义此处为报告全文一级标题，四号宋体，加粗 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，广泛存在于动植物和微生物中，是最早应用于工业生产的酶制剂之一。在当今生物工艺学中，淀粉酶是最重要的一类酶，是迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂品种。特别是 20 世纪 60 年代以来，由

3、于酶法生产葡萄糖以及用葡萄糖生产果葡糖浆的大规模工业化，淀粉酶的需要量几乎占了整个酶制剂总产量的 50%以上，被应用到了很多工业生产中，如食品，发酵，纺织，造纸业，制药业和化学药品工业等，还扩展到其他领域，如临床，医学，分析化学。淀粉深加工工业是农副产品升值的重要途径，其进行的基础是淀粉质原料的水解，在传统工业中一般分为液化和糖化两个阶段进行，由于工业所采用的淀粉酶和糖化酶作用 pH 值有差异，生产过程中不但增加了生产成本，而且影响液化糖化效果，直接影响下游产品质量，研究和开发在酸性条件下能保持高活性的耐酸性淀粉酶，简化液化、糖化过程，降低淀粉深加工生产成本具有现实意义。随着工业的不断发展，淀

4、粉酶的应用领域也在不断拓宽，因此特殊的生产条件，就会需要特殊的淀粉酶种类来满足生产。耐酸性淀粉酶因其能在酸性的环境中，仍能保持较高活性，从而受到国内外众多研究者们的注意。在我国，淀粉原料的深加工工艺中，一般需要淀粉酶与糖化酶连用，先将淀粉液化然后再糖化处理。在这两种酶的连用过程中，由于液化所需的淀粉酶和糖化酶的最适 pH 不同，因此在生产工艺的操作中需要进行 pH 调节。这不但要消耗大量酸、碱，最后还需要对产品进行脱盐，这些步骤大大提高了我们的生产成本。如果淀粉酶的作用pH 范围降低为4. 0-6. 0，与糖化酶的作用 pH 相近，就可以使淀粉液化和糖化在同一条件下进行。这样既避免 pH 的调

5、节带来的麻烦，同时也减少了大量试剂的消耗，简了淀粉的深加工过程。因此开发新型的酸性淀粉酶制剂的工作显得愈发迫切正文部分为五号宋体，不加粗，1.5倍行距。2 国内外研究现状和研究趋势一级标题段前空1行淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，广泛存在于动植物和微生物中，在淀粉深加工工业、食品工业以及酿酒行业中被广泛应用，它是最早用于工业化生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂之一，广泛应用于面包的焙烤、饮料的发酵、青贮饲料的生产、制药和临床化学分析工业副产品的加工以及工业生产废品的利用和处理等领域。按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可以分为四类：-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。-淀粉酶

6、是以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开-1，4-糖苷键而使淀粉水解；-淀粉酶是从底物淀粉的非还原性末端顺次水解每相隔一个的-1，4-糖苷键而使淀粉水解成麦芽糖；葡萄糖淀粉酶是从底物淀粉的非还原性末端顺次水解-1，4-糖苷键和分枝的-1，6-糖苷键而生成葡萄糖；异淀粉酶只能水解糖原或支链淀粉分枝点-1，6-糖苷键，并切下整个侧枝1参考文献标注，1，上标。酸性淀粉酶是在酸性条件下能水解淀粉的淀粉酶。早在 1915 年法国的Boiden 等开始由枯草杆菌生产细菌淀粉酶，并在工业上用于纺织品退浆；1963年日本 Yasuji Minoda 等人2发现黑曲霉可以产酸性-淀粉酶；此后，美国、韩国、中国以及欧

7、洲国家的一些研究者都对酸性-淀粉酶进行了研究，如芬兰的研究者制备了用于高麦芽糖浆生产的酸性-淀粉酶，其最适 pH 为 5.0；日本的研究者3用白曲霉生产一种酸性-淀粉酶，最适 pH 为 3.5，适用于清酒制备中淀粉原料的加工；1987 年任天明等4完成了嗜热脂肪芽孢杆菌的高温-淀粉酶基因在大肠杆菌种的克隆和表达；1990 年金凤燮5从酒曲中分离得到生产高温-淀粉酶的菌种；2005 年，张强等从西藏温泉土壤中筛选到一株地衣芽胞杆菌活菌，酶活力达到 7.4U/ml6。近年来，随着科学技术和生产力水平的不断提高，我国淀粉年产量由1979年的28万吨提高到了2008年的达到500万吨，这推动了淀粉质原

8、料深加工工业的发展。随着淀粉加工工艺条件的改变，酶制剂行业也必须不断更新和完善淀粉酶的种类以满足工业生产的需要。目前国内外市场上两类常用的是中温型淀粉酶的和高温型淀粉酶，它们的最适 pH 范围在 7 左右，在酸性环境中酶活明显降低，不能满足一些酸性环境淀粉原料的加工，因此酸性淀粉酶的开发势在必行。3 产品目标和研究内容3.1 总体研究目标二级标题，从富含淀粉的土壤中分离筛选得到一株产生酸性淀粉酶的微生物菌株，并对该菌株进行种属的鉴定，获得的该微生物菌株可用于酸性淀粉酶的生产。3.2研究的基本内容3.2.1 目的菌株的分离，详细内容有： 采集土壤样品，采取合理的培养方法进行培养 通过测量淀粉水解

9、透明圈比值，对目的菌株进行初步筛选 通过淀粉酶活力测定的方法，对目的菌株进行复筛 目的菌株的鉴定，详细内容有：参考伯杰细菌鉴定手册（第八版）内容，对菌株进行生理生化鉴定提取目的菌株的 16S rDNA 片段，通过进行测序比对进行鉴定4研究的方法与技术路线 4.1研究方法 土样的采集选择多个富含淀粉的土壤样品地点，比如面粉厂、芋艿地、番薯地等地的土壤，取离地面 5-15cm 处的土壤，装袋，并作记录。4.1.2增殖（富集）培养从自然界中采集的样品是很多微生物的混合物，所需的目标微生物不一定是优势菌种，收集到的样品如果含所需目标菌种较多，可直接进行分离。如果样品含所需菌种少，就应该设法增加该菌种的

10、数量，进行增殖培养，以提高分离效率。本实验需要筛选的是酸性菌，利用不同种类微生物的生长繁殖对环境和营养的要求不同，主要通过调节培养基的 pH 值，使目的微生物在其最适条件下迅速生长繁殖，而非酸性菌则无法正常生长，使得酸性菌能够大量生长，满足实验需要。4.1.3菌株初筛将土样进行浓度梯度稀释处理后，采用平板划线法和涂布稀释分离法取微量样品进行在含淀粉的酸性培养基中进行培养。培养到一定时间长出菌落后，将碘液滴到菌落上，观察菌落周围是否有水解透明圈。同时测量菌落的淀粉水解透明圈直径(D)和菌落的直径(d)，通过两者的比值大小，初步筛出产酶能力相对较高（即 D/d 值较大）的菌种进行斜面保藏，用于进一

11、步的复筛。4.1.4 复筛为确定初筛得到菌种的稳定性，利用菌株产生的淀粉酶的活力大小对菌种进行进一步的筛选。将保藏的菌种培养在液体培养基中，培养一段时间后，离心取上清液，得到粗酶液，然后通过酶活力的测定比较菌株的产酶能力，从而筛选出性状稳定并且产酶能力高的菌种。淀粉酶的提取及酶活力的测定：取初步筛选出的菌种，接种到液体培养基中，进行发酵培养。培养到一定时期后，取发酵液离心，取上清液（即粗酶液），加入固体硫酸铵使得溶液饱和度达到 80%，对蛋白质进行低温盐析，静置 24h后离心溶液，收集蛋白沉淀。然后用合适的缓冲液溶解沉淀，将溶解后的蛋白溶液置于透析袋中进行透析。一段时间后取透析后的酶溶液用超滤

12、仪进行超滤浓缩，最后将得到的粗酶浓缩液进行冷冻干燥处理，磨粉后即得冻干粉。取粗酶液或是淀粉酶冻干粉进行酶活力测定：取 1.0%的可溶性淀粉底物溶液 10mL 放入试管中，在适宜温度的水浴锅中预热 10min 后加入提取的粗酶液1.0mL，混匀，准确保温10min。吸取0.5mL 反应液，加到盛有 10mL 0.1mol/L HCl的试管中终止反应。取终止反应后的溶液 0.5mL，加到盛有 10mL 碘液的试管中摇匀。用分光光度计（实验前先开启预热 30min 左右）在 600nm 下测定吸光值，计算出酶活力。酶活力（U/mL）=(D0D)/D0100稀释倍数式中 D0、D 分别为对照管和实验管

13、的吸光度，100 为系数（%）。酶活力单位：一定的实验条件下，反应 10min 使 1%淀粉溶液显蓝强度减低1%所需酶量为一个酶活力单位（U）。4.1.5 菌种的鉴定传统的方法有菌种的生理生化鉴定，现代的方法有 16S rDNA 序列鉴定等。生理生化鉴定：参考伯杰细菌鉴定手册（第八版）对菌种进行生理生化鉴定，内容包括菌种形态的观察，革兰氏染色、芽孢染色、接触酶试验等。16S rDNA 序列鉴定：16S rDNA 是原核生物染色体上编码核糖体小亚基RNA 的基因，在长期的进化过程中，分子功能几乎保持恒定，具有保守性，又具有高变性。 保守性能反映出生物物种的亲缘关系, 为系统发育重建提供线索；高变

14、性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。把待测菌种的 16S rDNA 序列测定出来，然后与数据库中的已知菌种序列进行比较，即可确定供试菌种的分类地位。提取复筛得到的产淀粉酶菌株的基因组 DNA，对16SrDNA片段进行PCR扩增。PCR 扩增产物经电泳检测完整后，采用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒割胶回收 16S rDNA片 段 。按照T-A克隆载体连接试剂盒的说明书，将 16S rDNA片段与质粒载体连接；连接后转化已制备好的大肠杆菌感受态细胞，37培养箱中过夜培养。挑取能在含有标记基因的 LB 培养基上生长的单菌落，接种，37过夜培养后提取质粒，进行 PCR 和酶切检测

15、。质粒提取操作按质粒提取试剂盒的说明书进行。电泳检测完整后送至测序公司进行基因测序。将测序结果输入美国国立生物技术信息中心数据库（ National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行BLASTn比对，根据目的菌序列与数据库中的核苷酸序列的相似度来确定分离所得到的菌株的种类。4.2 技术路线 整个实验流程及技术路线如下图：（五）预期成果（包括科研报告、论文、专利、用于实践的可能等,着重市场开发的可能）完稿后此段删除 通过本项目的研究方案，预期可获得至少1株产酸性淀粉酶菌株，撰写科研论文一篇。对该菌株进行微生物育种以及菌株发酵产生酸性淀粉酶的

16、工艺研究，可能开发出一种可应用于市场开发的酸性淀粉酶。根据市场调查，耐酸性淀粉酶在各方面都可发挥巨大作用。但目前全世界只有少数几家工厂生产而且价格较高，每公斤50左右，但还是有不少商家购买。国内只有少数单位对耐酸性淀粉酶进行了研究，但活力低，距投产尚有很大距离，因此该项目的研究尚属国内空白。一旦获得高产酸性淀粉酶菌株，将有重要应用前景。参教文献居中，与一级标题同。参考文献不少于15篇，并在文中相应引用处标出，但本模板中未完全标注正确。1 梅乐和, 岑沛霖. 现代酶工程M. 北京: 化学工业出版社, 2008: 200201.2 徐 颖. 高产-淀粉酶生产均的筛选鉴定及其酶学性质研究D. 四川:

17、 四川大学, 2007. 3 张树政. 酶制剂工业M. 北京: 科学出版社, 1984: 1820.4 Yasuji Minoda. Acid-stable -Amylase of Black Aspergilli Part J. Agr. Biol. chem, 1968, 32 （1）: 104 109.5 黄大肪, 林 敏. 农业微生物基因工程M. 北京: 科学出版社, 2001.6 任天明. 嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶基因的克隆和表达J. 生物工程学报, 1987, 3: 197.7 金凤燮, 李 瑶, 张春枝. 耐高温-淀粉酶产生菌B.sp-JF1的诱变选育J. 大连轻工业学院学报,

18、1997, 04.8 朱何东. 高温-淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究D. 四川: 四川大学, 2006.9 张丽苹, 徐 岩. 酸性-淀粉酶的研究与应用J. 酿酒科技, 2002, 29（3）: 19.10 谷 军. -淀粉酶的生产与应用J. 生物技术, 1994, 4（3）: 15.11 Bartholomew N Okolo, Lewis I Ezeogu, et a1. Production of Raw Starch Digesting Amylase by Aspergillus niger Grown of Native Starch SourcesJ. Jsci. Food A

19、gric, 1995（69）: 109.12 铃木浴治, 小岛岩夫. New -Amylase produced by Bacillus 1ieheniformis is acid-tolerant and thermostable-acid-tolerant and thermostable -amylase productionJ. Jpn Kokai Tokyo Jp, 10136979, 1996（7）: 3235.13 Kamasaka, H. , Sugimoto, K. , Takata, H. , et a1. Bacillus stearothermophilus Neopullulanase Selective Hydrolysis of Amylose to Maltose in the Presence of AmylopectinJ. Applied and environment microbiology, 2002, 68（4）. 14 Petrova, S. D. Ilieva, S. Z. , Bakalova, N. G. et a1. Prod uction and characterization of extra