王亚文——白假丝酵母菌临床分离株的病性及耐药结果分析

1、1 1王亚文王亚文 20082008级级 临床五年制临床五年制 2 2 一、立项依据与设计思路一、立项依据与设计思路 二、技术路线与方案二、技术路线与方案 三、可行性与创新性三、可行性与创新性3研究对象研究对象白假丝酵母菌白假丝酵母菌菌群失调菌群失调机体免疫力降低机体免疫力降低异位定植异位定植白假丝酵白假丝酵母菌感染母菌感染4临床难题临床难题 诊断难，作为正常寄生菌，诊断难，作为正常寄生菌，致病性的检测具有重要意致病性的检测具有重要意义，现有的检测方法耗时义，现有的检测方法耗时耗力。耗力。治疗难，耐药菌住的产生。治疗难，耐药菌住的产生。 5研究进展研究进展 1粘附因子粘附因子2酸性蛋白酸性蛋白

2、酶酶Candida Candida A Albicanslbicans aciacid d P Proteinaseroteinase 3形态及表形态及表型转换型转换6实验目的实验目的验证白假丝酵母菌的酸性蛋白酶活力作为验证白假丝酵母菌的酸性蛋白酶活力作为致病性的评价指标的可行性。致病性的评价指标的可行性。了解本地区药物敏感情况，希望指导临了解本地区药物敏感情况，希望指导临 床用药。床用药。 7 7 二、二、 技术路线与方案技术路线与方案8实验设计思路实验设计思路收集、分离、鉴定收集、分离、鉴定致病性研究致病性研究药敏试验药敏试验1.收集标本2.菌落培养3.涂片镜检4.显色培养1.1.蛋白酶活

3、力实验蛋白酶活力实验2.2.粘附性实验粘附性实验药物敏感试验9病原菌分离、培养、鉴定病原菌分离、培养、鉴定白假丝酵母菌收集临床标本120例转种至显色培养基35培养 48h，依菌落颜色鉴定镜下可见G+性圆或椭圆形酵母菌，有时可见芽管分离菌落，格兰染色，高倍镜检观察菌落形态，有酵母样念珠菌生长为培养阳性。标本接于沙保弱培养基35培养24 72hA A、B B分为分为 假丝酵母菌菌落假丝酵母菌菌落C C、D D分为高倍镜下假丝酵母菌及其厚膜孢子分为高倍镜下假丝酵母菌及其厚膜孢子 初步形态学鉴定结果初步形态学鉴定结果B11 菌落呈翠绿色为白假丝酵母菌，粉红色为克柔氏假丝酵母菌菌落呈翠绿色为白假丝酵母菌

4、，粉红色为克柔氏假丝酵母菌 ，灰蓝色为热带，灰蓝色为热带 念珠菌念珠菌 。 80 80株假丝酵母菌中分离出白假丝酵母菌株假丝酵母菌中分离出白假丝酵母菌5959株，构成比最高为株，构成比最高为73.373.3图图5 念珠菌显色培养结果念珠菌显色培养结果12产酶培养基37下培养24h恢复产酶活力菌苔出现一个透明圈，测量菌落及其周围透明环直径。37下培养48h菌悬液 10l点种于YGM-牛奶培养基酸性蛋白酶活力实验酸性蛋白酶活力实验1313白假丝酵母菌产酶率为白假丝酵母菌产酶率为100%,100%,其中高活力株其中高活力株68%68%，中活力株，中活力株20%,20%,低活力株低活力株占占12%12

5、%R=R=透明环直径透明环直径/ /菌落直径菌落直径R3R3为高活力，为高活力，2R32R3为中活力，为中活力，R2R2为低活力为低活力图图6 6 酸性蛋白酶实验结果酸性蛋白酶实验结果14 小鼠尾静脉注射0.2ml菌悬液，对照组注射等量生理盐水小鼠死后做病理切片组织研磨液培养。密切观察小鼠生存情况，记录小鼠生存时间菌株经YEPD肉汤活化配制为1.8108/ml菌悬液健康小鼠随机分4组 空白对照组、高中低活力组动物实验步骤动物实验步骤15动物实验结果动物实验结果图7 鼠肾研磨液培养菌落小鼠肾脏组织研磨液涂片小鼠肾脏组织研磨液涂片白假丝酵母菌涂片白假丝酵母菌涂片图8 鼠肾研磨液显色培养图9 小鼠肾

6、、肺、脾病理镜下形态1616死亡率平均生存时间（天）高活力组100%1中活力组75%3低活力组25%8空白对照组0白假丝酵母菌的蛋白酶活力与其致病性呈正相关白假丝酵母菌的蛋白酶活力与其致病性呈正相关(p0.01)(p0.01)表表1 1 四组小鼠的死亡率与平均生存时间四组小鼠的死亡率与平均生存时间1717药敏试验药敏试验制霉菌素制霉菌素两性霉素两性霉素B B氟康唑氟康唑酮康唑酮康唑伊曲康唑伊曲康唑18药敏试验结果药敏试验结果 1 1图10 同一菌株对5种抗真菌药物的不同反应判读标准：判读标准：抑菌环直径抑菌环直径19mm 19mm 为敏感为敏感14mm 14mm 为耐药为耐药 1919药敏试验结果药敏试验结果 2 220三、可行性与创新性三、可行性与创新性21可行性与创新性可行性与创新性 实验结果提示在一定范围内酸性蛋白酶实验结果提示在一定范围内酸性蛋白酶可以作为评价白假丝酵母菌致病性的指标。可以作为评价白假丝酵母菌致病性的指标。牛奶平板法检测酸性蛋白酶活力具有简单，牛奶平板法检测酸性蛋白酶活力具有简单，省时，经济等优点，适于在基层医院推广省时，经济等优点，适于在基层医院推广使用。