天然药物化学实验-讲义

1、前 言天然药物化学是一门实践性很强的学科，实验教学在天然药物化学教学中占据着重要的地位。天然药物化学实验是天然药物化学课程的重要组成部分，是配合天然药物化学理论课教学的不可或缺的手段。其主要目的是：(1 通过天然药物化学实验课的开设，可以使学生进一步理论联系实际，检验在课堂上所学的理论知识，加深对天然药物化学的基本理论和基本知识的认识和理解。(2 通过实验，训练学生的基本操作技能，在实验过程中，培养学生的创新能力、动手能力以及自学能力，提高学生分析和解决问题能力，养成严谨科学态度和良好工作作风，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练，为将来从事天然药物化学的研究工作奠定基础。在实验中，重

2、点是要加强对学生基本操作技能的训练。天然药物化学实验要求学生掌握以下技能：(1 提取分离方面要求掌握常用的经典方法的原理及操作。其中包括液-固提取法（浸渍、渗漉、回流提取等）、液-液萃取法（简单萃取法、梯度萃取法、反流分布法）、重结晶法等。掌握纸色谱、柱色谱（包括吸附柱、离子交换柱等）的原理和基本操作。(2 鉴定方面化学方法 掌握一般定性反应在鉴定中的应用。 掌握重要衍生物（乙酰化物、甲基化物生物碱盐类等）的制备方法及其在结构鉴定中的应用。光谱方法了解UV 、IR 、NMR 、MS 在天然物结构测定中的应用。要求学生掌握黄酮类化合物的UV 、NMR 波谱。目录天然药物化学实验须知·&

3、#183;·················································&

4、#183;·················································&

5、#183;··2 实验一 芦丁的提取及鉴定·············································

6、;··················································

7、;·41.1 芦丁的提取分离、精制、定性反应·············································

8、83;·······························51.2 芦丁的酸水解及糖的纸层析···············

9、3;·················································

10、3;·······················61.3 芦丁的十乙酰化、聚酰胺薄层层析及定性反应······················

11、83;··································8 实验二 氧化苦参碱的提取分离和鉴定············&#

12、183;·················································&#

13、183;···········121.1 氧化苦参碱的提取····································

14、··················································

15、·················131.2 氧化苦参碱的分离纯化······························&#

16、183;·················································&#

17、183;··············151.3 氧化苦参碱的精制·································

18、··················································

19、····················16 附录一 常用显色剂的配制及显色方法··························

20、3;·················································18天然

21、药物化学实验须知在天然药物化学实验中，所用的药品多数是挥发性、易燃、有毒、有腐蚀性、刺激性、甚至爆炸性药品，试验操作又常在加温加压等情况下进行，需要各种热源、电器或其他仪器，操作不慎易造成火灾、爆炸、中毒、触电等事故。但只要加强爱护国家财产和保障人民生命安全的责任心，提高警惕，消除隐患，注意实验规则，事故是可以避免的。实 验 规 则一、 试验前必须预习实验内容，了解原理和操作规程。随时记录试验应记的项目，以作正式报告。二、试验前应清点并检查仪器是否完整，装置是否正确，合格后方可进行试验。试验时不准做无关的事情，严禁吸烟，不得擅自离开，并应随时注意反应情况，仪器有否漏气，破裂等。三、药品仪器都是

22、国家财产，须节约爱护使用，公用物品，用完后立即放回原处。不可调错瓶塞，以免污染，仪器要洗刷干净。四、操作易燃性有机溶剂，回流、蒸馏、减压蒸馏时，不能明火直接加热，要放沸石或一端封死的毛细管，若在加热时发现无沸石则应冷却后再加，防止爆沸冲出。减压系统应装有安全瓶。加液时应停火或远离火源，一般无漏气开口，冷凝水要通畅。起封易挥发溶剂瓶盖时，脸面要避免开瓶口慢慢启开，以防气体冲脸上。五、有毒具腐蚀药品应妥善保管，操作后要立即洗手。勿粘及五官和创口，以免中毒。六、实验中，有毒气或腐蚀性气体发生适应在通风橱中进行操作。必要时可戴好防护用具进行工作。七、若将玻管插入塞中时，可在塞孔中涂些水和甘油等润滑剂，

23、用布包住波管使其旋转而入，防止折断割伤。八、试验台上不放无用的药品、仪器，在实验时要做到水槽、仪器、桌面、地上清洁整齐。九、试验结束时，应将门、窗、水、电、煤气关好，室内打扫干净，并清点仪器后方可离去。安 全 防 火 须 知一、实验室存放易燃性有机溶剂时要远离火源，不得超过500ml 。二、在进行易燃性有机溶剂实验时，一定要按着操作规程进行。不可将易挥发、易燃性有机溶剂倒入水槽或废液缸内。三、烘箱内不能烘盛有易燃性溶剂的器皿。四、消防器材，沙箱、石棉布、灭火器等应放在方便固定的地点，不能随意移动，均应处于备用状态。五、万一不慎着火，要沉着冷静积极抢救，应立即切断室内电源和火源，用石棉布将着火部

24、位盖严，使其断绝空气而熄灭。或是火势情况选用适当灭火器材进行灭火。在实验室使用二氧化碳灭火器较好，它具有不腐蚀不导电之优点。在实验室中常发生的事故如下，应予以特别注意：(1 蒸馏或回流加热时，发现未放沸石，未等溶液冷却就补加沸石，结果溶液冲出瓶外于是引起火灾。(2 蒸馏易燃物时，忘记通冷凝水，大量蒸汽逸出亦易引起火灾。(3 蒸馏易燃物时塞子漏气引起火灾。(4 使用真空干燥器时，用完就直接开干燥器的放气阀，结果使泵内的机油被吸到干燥器中，样品被污染。实验一 芦丁的提取与定性反应概述黄酮类化合物广泛存在于自然界，是一类重要的天然有机化合物。从天然生物中分离获得此类化合物的技术，文献调研显示，变化不

25、是很大。一般而言黄酮类化合物的提取分离可根据待研究的化合物性质进行，如：黄酮苷类以及极性稍大的苷元(如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等 ，通常采用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。其中用得最多的是甲醇-水(1:1或甲醇。一些多糖苷类则可以用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸(如0.1%盐酸 。而大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂，如用氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取，而对多甲氧基黄酮的游离苷元，甚至可用苯进行提取。其分离方法主要有重结晶、柱色谱、纸色谱、制备性薄层色谱、葡聚糖凝胶色谱(Sephadex、高效液相(HPLC色谱等。通过本实验希望同学们能进一步了解并掌握

26、黄酮类化合物的提取、精制、分离、结构鉴定等方面的技术和方法。芦丁(Rutin广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米(为植物Sophora japonica的未开放的花蕾和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由槲皮素(Quercetin 3位上的羟基与芸香糖(Rutinose 为葡萄糖(Glucose 与鼠李糖(Rhamnose 组成的双糖脱水形成的苷。芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174178，无水物188190。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇

27、1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。提取芦丁的方法有很多，目前我国多采用碱提取酸沉淀的方法，其提取原理是：因芦丁的结构中含有酚羟基，与碱成盐后溶于水中，向此盐溶液中加入酸，调节溶液O OHO OH的pH 值，则芦丁又重新游离析出，从而获得粗制芦丁。除此方法之外，还可以采用沸水提取或醇提法。芦丁具有维生素P 样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。多作口服，亦可用作注射用。1.1 芦丁的提取分离、精制、定性反应实验目的与要求 通过芦丁的提取与精制，掌握碱-酸法提

28、取黄酮类化合物的原理及操作。 了解NMR 在黄酮结构鉴定中的应用。 实验流程图实验步骤 1芦丁的提取(1称取槐花米15g ，置于干燥的研钵中用钵棒挤压成粗粉。(2称取11.5g的石灰粉(CaO，置于干净的小研钵中，加入10 ml水后研成乳液槐花米粗粉（15g ）加水300ml ，用石灰乳调节pH 值至89；直火加热至微沸，维持pH 值至30分钟；趁热抽滤。残渣（弃去）滤液放置，冷至6070，用浓HCl 调至pH 45，静置1小时，抽滤滤液（弃去）沉淀（粗制芦丁）重结晶残渣（弃去）滤液静置，过滤, 在6070干燥芦丁(精制品备用。(3将粉碎的槐化米置于500ml 烧杯中，加水300ml ，在搅拌

29、下加入上述制备的石灰乳，调节pH 值至89，加热至微沸，维持pH 值至30分钟，趁热抽滤。(4弃去滤渣，冷至6070，用浓HCl 调至pH 45，静置1小时，析出粗制芦丁，抽滤，弃去滤液，收集粗制芦丁。(5向粗制芦丁按照1：50比例加入蒸馏水，沉淀悬浮于蒸馏水中，加热煮沸15分钟，然后趁热抽滤，弃去不溶物，充分静置，过滤，收集芦丁结晶，在6070干燥，得精品芦丁。1.2 芦丁的酸水解及糖的纸层析实验目的与要求通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 掌握苷类的常用水解方法以及通过纸层析鉴定糖的方法。 实验流程图 实验步骤 1、芦丁的水解(1取上一次实验所制备的精制芦丁的1/2量，

30、按照1：70的量加入2% 硫酸溶液，精制芦丁（取1/2量）按1：70加入2硫酸溶液(V/V,加热40分钟，放冷，静置，抽滤至干沉淀（苷元）滤液（用于糖的鉴定）红外灯下干燥槲皮素（保存备用）取5ml，用Ba(OH2乳（1.5克Ba(OH2加10ml水，研磨），调至中性，折叠滤纸过滤沉淀（弃去）滤液转移到磁蒸发皿中，水浴蒸干，放冷，加入1ml95%乙醇溶液纸层析样品备用加热40分钟，放冷静置，抽滤；(2所得沉淀用少许水洗除酸；沉淀在红外灯下烤干，干燥称重。 2、糖的纸层析鉴定 原理本实验方法为糖的径向水平纸层析。原理为液-液分配层析。分配层析法是利用混合物的各个组分，在两相互不相溶的溶剂中的分配系

31、数不同而达到分离的一种层析方法。在以水做固定相的纸层析中，一般极性大的化合物，保留时间长，R f 值小；极性小的化合物，保留时间短，R f 值大。层析图谱中，样品中某斑点与对应的标准品斑点的Rf 值以及性状、颜色相同，说明该样品溶液中含有此标准品成分。 样品制备(1 取上述水解母液5ml 小心用Ba(OH2 乳(大约11.5g，并预先用10ml 水调至成乳液 中和至中性，用折叠滤纸过滤出生成的BaSO 4沉淀；(2 滤液转移到磁蒸发皿中，热水浴蒸干，放冷，用1ml 95%乙醇溶液溶解，得到水解后的糖样品溶液，供点样用； 标准品 葡萄糖乙醇溶液；鼠李糖乙醇溶液 展开剂 用正丁醇-醋酸-水(4:1

32、:5上层溶液 显色剂 邻苯二甲酸苯胺 纸层析操作(1 取一对直径15cm 的表面皿，内置一个小层析槽，装上展开剂，密闭； (2 剪1张面积略大于表面皿的圆形滤纸, 以圆心为中心，用铅笔画出通过圆心的三条直线将滤纸等分为6份；(3 在圆心处画半径1.5cm 左右的圆，作为点样线；(4 采用对角点样法两次将样品、葡萄糖、鼠李糖标准品点于点样线上, 挥干溶剂(如下图所示 ；(5 另外取一小长条滤纸卷成纸卷，从滤纸的圆心处穿进去，插入层析槽的展开剂中，密闭上下表面皿。借助滤纸芯的毛细作用作径向展开；(6 当展开至原点56cm时取出，将滤纸在红外灯下烘干，喷显色剂后，再在红外灯下加热数分钟，至显出斑点为

33、止，观察结果并记录。 注：为确定点样量，应先做纸斑反应。方法为：取一长条滤纸，用毛细管分别点不同量的样品溶液，红外灯下烘干，喷显色剂，再烘干显色为止。确定最佳点样量。1.3 芦丁的十乙酰化、聚酰胺薄层层析及定性反应实验目的与要求通过芦丁酰化实验，了解衍生化法在结构研究中的意义及方法。 掌握聚酰胺薄层色谱法的特点及使用方法。掌握定性反应的方法：盐酸镁粉反应，Molish 反应。 此次为本实验的最后一次实验，通过3次实验，最终要求1要获得三个化合物：芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。2能够根据化学试验及UV 、NMR 数据初步推断出芦丁的结构。并对黄酮类化合物的结构测定有一般性的了解。 实验流程图

34、精制芦丁(0.1mg置于干燥的50ml茄形瓶中，加入2ml无水吡啶溶解，再加入8ml醋酐反应液水浴上回流30分钟，放冷，将反应液倒入70ml水中，一直搅拌到油滴消失，白色沉淀析出为止反应液抽滤，干燥反应物实验步骤1、芦丁的乙酰化：取芦丁100 mg，置于干燥的50ml 锥形瓶中，加8ml 醋酐和2ml 吡啶振摇使之完全溶解，接上空气冷凝管，水浴上加热三十分钟，放冷，在搅拌下将反应液倾入70ml 冰水中一直搅拌至油滴消失为止，抽滤并洗涤沉淀，干燥得芦丁的乙酰化物。 2、聚酰胺薄层色谱原理 聚酰胺薄层色谱的原理为氢键吸附。聚酰胺分子中含有多个酰胺基，在水溶液中能与酚羟基通过氢键而被吸附。化合物分子

35、中酚羟基数目越多，被吸附的越强。 样品制备 分别取少量芦丁、槲皮素、和芦丁十乙酰化物，用1ml95%乙醇溶解，其溶液供点样用。 展开剂 75%乙醇显色剂 氨水，2% AlCl3无水乙醇溶液 操作(1 取聚酰胺薄层板，分别点上芦丁、芦丁十乙酰化产物及槲皮素样品，同时以标准品(或已知对照品 芦丁、槲皮素作为对照(2 用75% 乙醇液进行展开，待上行展开距离顶端1cm 时，取出吹干 (3 分别在日光、紫外灯下观察样品斑点的颜色与荧光，并记录， (4 再将薄层板用氨蒸气熏一下，并观察颜色和荧光变化，(5 再次用2% AlCl3对薄层板进行显色，观察样品斑点的颜色和荧光变化，将结果添入下表，并对化合物颜

36、色、紫外特征与结构的关系；聚酰胺分离黄酮类化合物的原理和引起待分离组分Rf 差异的原因等进行讨论。NH 3 2% AlCl 3 日光 紫外日光紫外 日光紫外芦丁 槲皮素 全乙酰化芦丁3、芦丁、槲皮素的定性反应样品制备 取芦丁、槲皮素各少许，分别加入95%乙醇56ml使其溶解，取上清液，各均分成三份作下述实验。(1盐酸-镁粉反应：取芦丁、槲皮素醇溶液各一份，分别滴加几滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。必要时刻加热，记录现象。(2 -萘酚反应(Molishs Reaction:取芦丁、槲皮素醇溶液各一份，然后分别加入等体积的10%-萘酚乙醇溶液，倾斜试管，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意

37、观察两液面产生的颜色变化。记录现象。(3 2%二氯氧化锆-柠檬酸反应：A ：取芦丁醇溶液一份，滴加2%二氯氧化锆甲醇溶液，摇匀，观察颜色变化；将溶液均分成2份，向其中一份滴加2%柠檬酸甲醇溶液，另一份加入等量乙醇溶液，对比两试管，注意观察颜色变化情况，记录现象。B ：槲皮素的反应操作同上，记录现象。实验小结1实验报告要求记录如下内容： 碱-酸法提取芦丁的原理。 定性反应的反应机理。 黄酮类UV 和NMR 的特点。 详细记录定性反应结果。 绘制色谱结果模拟图，并计算R f 值。 2思考题 苷类结构的检识大体程序如何？ 苷类水解有几种催化方法？ 怎样确定芦丁结构中糖基是连接在槲皮素3-O-上？ 怎

38、样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖基一个鼠李糖？ 苷元的结构是怎样确定的？ 怎样确定苷键的构型？ 芦丁的全乙酰化物的制备与苷元乙酰化物(槲皮素的制备有何不同？为什么？芦丁的全乙酰化物的制备过程中为什么要保证无水条件？实验二 氧化苦参碱的提取分离和鉴定概述生物碱是一类广泛分布于自然界的重要的天然有机化合物，许多具有重要的生物活性，现在天然界中发现的生物碱已达10000多种。许多重要的天然药物如鸦片、麻黄、三尖杉、乌头、长春花、苦参、洋金花、金鸡纳、秋水仙等都主要含有生物碱类成分。生物碱又是天然有机化学的重要研究领域之一，在生物碱研究中创立和发现了不少的新技术、方法和反应，对天然有机化学的发展有着重

39、要的促进作用。通过本章的实验，希望同学们能够进一步掌握生物碱类化合物的提取分离方法及性质。 中药苦参是豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait的干燥根，有清热燥湿、杀虫、利尿之功效。苦参在临床上用于杀虫、治疗痢疾、肝炎、荨麻疹、湿疹、气管炎等。药理实验证明苦参总生物碱有抗心律失常及抗癌活性等。苦参中主要含生物碱和黄酮类成分。苦参中主要生物碱有：苦参碱、氧化苦参碱、槐定、槐果碱，结构如图1。氧化苦参碱有抗癌、抗衰老等作用。苦参碱 氧化苦参碱 槐定碱 槐果碱主要苦参生物碱的理化性质中英名称 分子式性状 mp( 旋光溶解度苦参碱(matrine C 15H 24N 2O白色针状结晶

40、 76 +39.11°易溶于醇、氯仿，溶于乙醚、苯，难溶于水氧化苦参碱(oxymatrine C 15H 24N 2O 2 白色方晶207208+47.7°易溶于水、乙醇、甲醇、氯仿，不溶于乙醚、苯槐定碱(sophoridine C 15H 24N 2O 白色棱晶106108槐果碱(sophocarpineC 15H 22N 2O白色棱晶8081 -29.44°同上从苦参中提取生物碱一般用水、酸水或醇提法，粗提物用树脂法或酸碱法纯化，分离方法多用氧化铝或硅胶柱色谱。4891.1 氧化苦参碱的提取实验目的与要求掌握渗漉法的原理、操作与影响因素。掌握用离子交换树脂法提

41、取分离生物碱的原理和方法。 原理：AlK + H+/H2O AlKH+RSO 3-H + + AlKH+ RSO3AlKH + + H+洗脱：吸附树脂用NH 4OH 碱化后，反应如下：RSO 3AlKH + + NH4+OH RSO3 NH 4+ + AlK(游离生物碱 + H2O掌握生物碱特征定性反应； 实验流程图实验步骤1离子交换树脂的预处理(1 将60g 聚苯乙烯磺酸型树脂(交联度3%，放入烧杯中，加200ml 80的蒸馏水溶胀30分钟；用750ml 的0.2%HCl，以6-8ml/min速度渗漉药渣（弃去）酸水液粉碎后的苦参根（150g ）加入250ml 的0.2%HCl充分润湿，放置

42、20分钟渗漉筒1）通过阳离子交换树脂柱（动态装柱）；2）调整渗漉速度，以6-8ml/min流速进行渗漉和离子交换；3）测定交换液PH 值，画出时间与PH 值曲线图；酸水交换后树脂将树脂倒入烧杯中，水洗至澄明；抽滤至干，倒入培养皿树脂（室温风干）(2 倾出蒸馏水后加入2N 盐酸300ml ，充分搅拌，放置半小时(静态转型 ； (3 将树脂装入，并使全部酸水溶液通过树脂柱(动态转型 ，流出液的速度以液滴不成串为宜；(4 用蒸馏水洗树脂至中性，待用。注意从装柱到洗涤过程中始终保持液面高于树脂床。2氧化苦参碱的提取(1 将粉碎后的苦参根(150g放入500ml 烧杯中，向烧杯中加入250ml 0.2%

43、 的盐酸，使药材充分湿润，搅匀，放置20分钟后，将药材装入渗漉筒；装渗漉筒方法：在渗漉筒底部，放一块用水润湿的脱脂棉，然后将润湿的药材分次加入，分层填压，待药材全部装完后，顶部盖一张滤纸，在滤纸上压上一个洁净的重物。(2 另取一个1000ml 锥形瓶，放入750ml 的0.2%HCl，以6-8ml/min速度渗漉，要下口有溶液流出且筒内无气泡；(3 装树脂柱( 取一根色谱柱(2cm×100cm，在其底部垫上脱脂棉； ( 将已经用蒸馏水处理好的树脂悬浮起来，倒入色谱柱；( 等树脂颗粒沉降后，在其柱面上盖一层棉花或一张滤纸，以免加入液体时，破坏树脂表面柱床；注意：在整个操作过程中，树脂的

44、上部都要覆盖少量液体，以免空气进入，影响交换效果。( 将树脂柱表层多余的液体由底部活塞放出，待液面下降至树脂表面时，关闭活塞；(4 将渗漉筒与树脂柱相连，使渗漉下来酸水液加入到树脂柱上，打开树脂柱底部活塞，开始渗漉；(5 调整渗漉速度，以6-8ml/min流速进行渗漉和离子交换，测定交换液在0，1，2，3，5，10，15，20，30，60分钟时间时的PH 值，画出时间与PH 值曲线图；(6 待酸水液全部交换后，停止渗漉，将树脂倒入烧杯中，用蒸馏水洗树脂至中性，树脂澄明，倒出蒸馏水；(7 将树脂抽滤至干，倒入培养皿中，铺平，空气中晾干。3、生物碱的特征定性反应(1 取渗漉液1ml ，加入改良碘化

45、铋钾试剂(Dragendroffs Reagent数滴，观察变化，记录；(2 取渗漉液1ml ，加入碘-碘化钾试剂(Wagners Reagent数滴，观察变化，记录；(3 取渗漉液1ml ，加入碘化汞钾试剂(Mayers reagent数滴，观察变化，记录；(4 取渗漉液1ml ，加入硅钨酸试剂(Bertrads reagent数滴，观察变化，记录。1.2 氧化苦参碱的分离纯化实验目的与要求掌握连续回流提取法的原理、特点及仪器的使用方法。学习粗提物的纯化方法，学会分析纯化过程中所应用的原理。实验流程图实验步骤1、树脂的碱化(1 向培养皿中风干后的树脂中加入14% 的氨水8-10ml ，使树脂

46、湿润，加盖，静置20分钟；(2 在空气中，挥散多余氨气，最终状态树脂能够自由滑动；(3 将树脂装入沙氏提取器事先制好的滤纸筒中，用150ml 氯仿回流提取生物碱1.5小时；(4 停止实验后，将树脂回收，氯仿提取液回收浓缩至近干。 风干后的树脂(1加氨水(8-10ml湿润，加盖，静置20分钟(2挥散多余氨气(3装入沙氏提取器，用150ml 95% 氯仿回流1.5小时树脂氯仿液回收氯仿近干，加入6ml 丙酮，6ml 乙醚，2.5gNa 2SO 4，重结晶回收后的氯仿结晶2、氧化苦参碱的重结晶(1 向浓缩近干的氯仿烧瓶中，加入6ml 丙酮，将样品转移至50ml 锥形瓶中；(2 向上锥形瓶中再加入6m

47、l 乙醚和2.5gNa2SO4，充分振摇10分钟；(3 过滤沉淀，滤液置于另一个50ml 锥形瓶中，加盖放置，析出结晶。1.3 氧化苦参碱的精制实验目的与要求学习半制备HPLC 的使用方法以及在分离纯化中的应用。掌握中性氧化铝薄层色谱软板制备方法。进一步理解对粗品进行检识的意义及方法，掌握薄层检识以及显微熔点测定方法。实验操作1、学习半制备HPLC 的使用方法以及在分离纯化中的应用 半制备HPLC 的主要部件及使用方法； 半制备HPLC 与常规分析性HPLC 的主要区别； 半制备HPLC 常用的色谱柱及检测器；4 半制备HPLC 在分离生物碱方面的应用。2中性氧化铝薄层色谱软板制备方法选用一根

48、直径约为1-1.2厘米的玻璃管或大试管，根据薄层的厚度在玻璃管两端绕几圈胶布，胶布的厚度视薄层厚度而异，常用的为0.41毫米，把干的吸附剂倒在玻璃板上，玻璃板的一端固定，防止玻璃管推时移动，用玻璃管压在玻璃板上，把吸附剂顺一个方向推动，即形成薄层。制成的薄层必须光滑、平整、厚度均匀，才能得到好的分离效果。3、氧化苦参碱的结构鉴定1. 纯度检查：用TLC 法，条件自选。原理：吸附层析。吸附剂：中性氧化铝，展开剂：氯仿/石油醚2. 用显微熔点仪测定mp 。三、思考题1. 叙述酸水法及离子交换法提取纯化生物碱的原理。2. 应如何检查(1渗漉液中是否含有生物碱？(2渗漉液中生物碱是否被交换在树脂上？(

49、3离子交换树脂是否已饱和？3. 简述沙氏提取器提取原理及特点。4. 制备性薄层色谱的特点是什么？5. 简述提取、分离和鉴定生物碱的程序并分析所测氧化苦参碱的各种波谱数据。附录 常用显色剂的配制及显色方法一、通用显色剂1碘检查物质：含有杂原子、双键、芳环等的一般有机化合物。方法：（1）在密闭色谱缸或其它密闭容器内预先放入少许碘结晶，然后放入展开后晾干的色谱，数分钟后，大部分有机化合物呈现棕色斑点（对于不含杂原子、双键、叁键、芳环等的有机化合物显色较困难）。为了增加碘的饱和蒸汽，加快碘的显色速度，色谱缸可在恒温水浴上适当加热（在色谱缸内放一盛水的小杯，增加缸内的湿度，也可提高显色的灵敏度）放置时间

50、过长时整个色谱会呈现棕色。该方法为一种可逆性显色，显色后的色谱暴露于空气中一段时间后，显色的斑点可褪去颜色。（2）在色谱上喷洒5碘的氯仿溶液或将置入具有碘蒸气的色谱缸中的色谱放置5分钟后取出，置于空气中待过量的碘蒸气全部挥发后，喷洒1淀粉的水溶液，显蓝色斑点。2硫酸检查物质：含有羟基、双键等的一般有机化合物。喷洒剂的配制方法：5的浓硫酸乙醇溶液，或15浓硫酸的正丁醇溶液，或浓硫酸正丁醇的1:1溶液。方法：在色谱上喷洒显色剂后，置于空气中干燥15分钟，再在110以上加热直至出现颜色或荧光（对于不含双键、叁键、羟基等的化合物显色较困难）。3重铬酸钾硫酸检查物质：一般有机化合物。喷洒剂的配制方法：将

51、5克重铬酸钾溶于100毫升40的硫酸中。方法：在色谱上喷洒显色剂后，置于150加热直至斑点显色，不同的化合物会显不同的颜色。4高锰酸钾检查物质：含有双键和叁键的不饱和化合物。喷洒剂的配制方法：将0.5克高锰酸钾溶于100毫升蒸馏水中。方法：在色谱上喷洒显色剂后，在淡红色背景上显黄色斑点。5碱性高锰酸钾溶液检查物质：含有双键和叁键的不饱和化合物。喷洒剂的配制方法：溶液I 将1克高锰酸钾溶于100毫升水中；溶液II 将5克碳酸钠溶于100毫升水中。将溶液I 和溶液II 等量混合即可方法：同上6硝酸银高锰酸钾试剂检查物质：具有还原性的化合物。喷洒剂的配制方法：溶液I 0.1mol的硝酸银溶液，2mo

52、l 的氢氧化铵溶液，2mol 氢氧化钠溶液的1:1:2的混合液（临用前配制）；溶液II 将0.5克高锰酸钾和1克碳酸钠溶于100毫升水中。临用前将溶液I 和溶液II 等量混合即可。方法：在色谱上喷洒显色剂后，还原性物质在蓝绿色背景上立即显黄色。7荧光素溴检查物质：含有双键和叁键的不饱和化合物。喷洒剂的配制方法：将0.1克荧光素溶于100毫升乙醇中。5克溴溶于10毫升四氯化碳中。方法：在色谱上喷洒荧光素溶液后，将其置于含有溴溶液的色谱缸中，用荧光灯检测荧光，荧光素与溴反应形成曙红（Eosin ），曙红无荧光，而不饱和化合物则与溴形成溴加成物，保留了原来的荧光。如果点样量较大，则呈黄色斑点，红色背

53、景。8其它荧光显色剂检查物质：普通有机化合物。喷洒剂的配制方法：（1）0.2的2，7-二氯荧光素乙醇溶液。（2）0.01的荧光素乙醇溶液。（3）0.1的桑色素乙醇溶液。（4）0.05的罗丹明B 乙醇溶液。方法：在色谱上喷洒任何一种显色剂后，不同的物质在荧光背景上显示黑或其它颜色的荧光斑点。9铁氰化钾三氯化铁试剂检查物质：具有还原性的化合物，特别是那些含有单个酚羟基又有吸电基团取代的酚类化合物（这类化合物往往与三氯化铁不显色）。喷洒剂的配制方法：溶液I 将1克铁氰化钾溶于100毫升水中；溶液II 将2克三氯化铁溶于100毫升水中。临用前将溶液I 和溶液II 等量混合即可方法：在色谱上喷洒显色剂后

54、，还原性物质显蓝色。如再喷2mol 盐酸溶液，则会使蓝色加深，纸色谱可用稀盐酸洗去喷洒液。102,4-二硝基苯肼检查物质：含有羰基的化合物。喷洒剂的配制方法：取2,4-二硝基苯肼1克和浓盐酸10毫升，加1000毫升乙醇溶解。 方法：在色谱上喷洒显色剂后，显黄色斑点。11硝酸银氢氧化铵（Tollen s-Zaffaroni ）试剂检查物质：具有还原性的化合物。喷洒剂的配制方法：溶液I 0.1mol的硝酸银水溶液；溶液II 5mol的氢氧化铵水溶液。临用前溶液I 与溶液II 以1:5混合即可（注意：久放则能形成具有爆炸性的叠氮化银）。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于105加热510分钟，显深黑色斑点

55、。12磷钼酸检查物质：具有还原性的化合物、类脂体、生物碱、甾体等。喷洒剂的配制方法：将5克磷钼酸溶于100毫升乙醇中。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于120（烘箱、吹风机、红外灯均可）加热直至出现斑点，还原性物质显蓝色，再用氨气熏，则背景变为无色。13硅钨酸检查物质：具有还原性的化合物、类脂体、生物碱、甾体等。喷洒剂的配制方法：将20克磷钼酸溶于100毫升乙醇中。沉淀试剂的配制方法：将1克硅钨酸溶解于20毫升水中，用10盐酸调至强酸性。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于120（烘箱、吹风机、红外灯均可）加热直至出现斑点，还原性物质显蓝色。14四唑兰试剂检查物质：具有还原性的化合物。喷洒剂的配制方法：

56、溶液I 将0.5克四唑兰溶于100毫升甲醇中。溶液II 6mol的氢氧化钠水溶液。临用前将溶液I 和溶液II 等量混合即可。方法：在色谱上喷洒显色剂后，微热或在室温下显紫色斑点15碘碘化钾溶液检查物质：普通有机化合物。喷洒剂的配制方法：见生物碱部分方法：在色谱上喷洒显色剂后，很多有机化合物呈黄色斑点16碱式醋酸铅试剂检查物质：普通有机化合物。喷洒剂的配制方法：取醋酸铅22克，加入蒸馏水70毫升，溶解后备用。另取氧化铅14克，置于乳钵中，加蒸馏水10毫升，研磨成糊状后，倒入玻璃瓶中，乳钵用10毫升蒸馏水洗涤，洗液并入瓶中，加入上述醋酸铅溶液70毫升，用力振摇5分钟后，时时振摇，放置7天，过滤，并

57、自滤器中添加适量新煮沸过的冷蒸馏水使成100毫升即得（本试剂既可做喷雾剂，也可做沉淀试剂）。方法：在色谱上喷洒显色剂后，很多有机化合物均可呈现颜色。二、糖类显色剂1茴香醛硫酸试剂检查物质：各种糖。喷洒剂的配制方法：在50毫升1的茴香醛乙醇溶液中加入1毫升浓硫酸（需临用前配制）。 方法：在色谱上喷洒显色剂后，在100105下烘烤，各种糖显不同的颜色。21,3-二羟基苯酚硫酸试剂检查物质：各种糖。喷洒剂的配制方法：方法：先将色谱板在110预热，然后喷洒显色剂，几分钟后在白色的背景上显不同的颜色。继续加热，颜色加深，背景也变深。3苯胺二苯磷酸试剂检查物质：各种糖。喷洒剂的配制方法：取二苯胺4克、苯胺

58、4毫升、85的磷酸20毫升，溶于200毫升丙酮中。方法：于85烘烤10分钟，各种糖显不同颜色。4茴香醛邻苯二甲酸试剂检查物质：各种糖。喷洒剂的配制方法：0.1mol 对茴香胺乙醇溶液和0.1mol 邻苯二甲酸乙醇溶液的等量混合液。 方法：在色谱上喷洒显色剂后，于100烘烤10分钟，戊糖显红紫色，糠醛酸显棕色，己糖和6去氧糖显色。5苯胺邻苯二甲酸试剂检查物质：各种糖。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于105110烘烤10分钟，通常五碳醛糖和2-己酮糖酸呈红色，六碳醛糖和5-己酮糖酸呈棕色。6-萘酚硫酸试剂检查物质：各种糖。喷洒剂的配制方法：取15-萘酚乙醇溶液21毫升、浓硫酸13毫升、乙醇87毫升及

59、水8毫升混合后即得 。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于100烘烤36分钟，多数糖显蓝色71,3-二羟基萘磷酸试剂检查物质：各种糖。喷洒剂的配制方法：0.2的1,3-二羟基萘酚乙醇溶液100毫升与85磷酸溶液10毫升的混合溶液。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于105烘烤510分钟，酮糖显红色，醛糖显淡蓝色。 8百里酚硫酸试剂检查物质：各种糖。喷洒剂的配制方法：取百里酚0.5克、浓硫酸5毫升，溶于95毫升乙醇中方法：在色谱上喷洒显色剂后，于120烘烤1520分钟，大多数糖在白色背景上显暗红色，继续加热则变成浅紫色。9双甲酮磷酸试剂检查物质：各种酮糖。喷洒剂的配制方法：取双甲酮30毫克，溶于90毫升乙醇

60、中，慢慢加入10毫升85磷酸。所制得的试剂放置于冷处能用几星期，但新配置的效果较好方法：在色谱上喷洒显色剂后，于110烘烤1520分钟，酮糖显暗绿灰色。10Keller-Kiliani 试剂检查物质：2-去氧糖（详见强心苷项下）。113,5-二氨基苯甲酸磷酸试剂检查物质：2-去氧糖喷洒剂的配制方法：取3,5-二氨基苯甲酸二盐酸盐1克，溶于25毫升80的磷酸中，加水稀释至60毫升。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于100烘烤15分钟，2-去氧糖在日光下显棕色，在紫外光下显黄绿色荧光。12酚硫酸试剂检查物质：各种糖喷洒剂的配制方法：取苯酚3克、浓硫酸5毫升，溶于95毫升乙醇中。方法：在色谱上喷洒显色剂

61、后，于100烘烤1015分钟，糖显棕色。13对硝基苯胺过碘酸试剂检查物质：去氧糖喷洒剂的配制方法：溶液I 取饱和偏高碘酸1份，加入2份水稀释；溶液II 1对硝基苯胺的乙醇溶液4份与盐酸1份的混合液。方法：在色谱上显喷洒溶液I ，放置10分钟，再喷洒溶液II ，去氧糖显黄色，紫外光下显强荧光；再喷洒5氢氧化钠的乙醇溶液，颜色转为绿色，乙二醇同样也显色。检查物质：还原糖和其它还原性物质喷洒剂的配制方法：溶液I 42,3,5-Triphenyl-tetrazolium chloride的甲醇溶液。溶液II 1mol氢氧化钠的水溶液。临用前溶液I 和溶液II 等体积混合即可。方法：在色谱上喷洒显色剂后

62、，于100烘烤510分钟，显红色斑点。15费林试剂（Fehling ）检查物质：还原糖显色剂的配制方法：溶液I 取69.3克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中；溶液II 取349克酒石酸钾钠、100克氢氧化钠，溶于1000毫升水中。临用前溶液I 和溶液II 等体积混合即可。方法：取样品溶液1毫升，加入试剂，在沸水浴上加热数分钟，产生红色的氧化亚铜沉淀。如果反应为阴性，加酸水解后反应为阳性，则可能为苷或非还原糖。16-萘酚试剂（Molish 试剂）检查物质：糖类、苷类。显色剂的配制方法：取10克-萘酚，用100毫升乙醇溶解即得。方法：取1毫升样品的稀乙醇或水溶液，加入试剂数滴，再沿管壁加入少量浓硫酸

63、，与浓硫酸的接触面产生紫红色的环（反应很灵敏，有少量滤纸纤维或中药材粉末均可为阳性反应）。17氨性硝酸银试剂检查物质：还原糖类。显色剂的配制方法：0.1mol 硝酸银溶液和5mol 氨水的等量混合液。方法：同费林试剂。 18间苯二胺试剂检查物质：糖类。显色剂的配制方法：0.2mol 间苯二胺的70乙醇溶液。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于105烘烤5分钟，显黄色荧光斑点。三苯丙素类显色剂1对氨基苯磺酸、重氮盐试剂（Pauly 试剂）检查物质：香豆素、酚类、芳香胺类、及能偶合的杂环类化合物。喷洒剂的配制方法：取4.5克对氨基苯磺酸，加热溶于45毫升12mol 的盐酸中，用水稀释至500毫升。取10

64、毫升稀释液用冰冷却，加10毫升冷的4.5亚硝酸钠水溶液，在0放15分钟（此试剂在0可保存3天），用前加等体积的1碳酸钠水溶液。方法：在色谱上喷洒显色剂后，香豆素显黄、橙、红、棕紫等颜色。2重氮化对硝基苯胺试剂检查物质：香豆素、酚类、芳香胺类、及能偶合的杂环类化合物。喷洒剂的配制方法：取0.7克对硝基苯胺，加热溶于9毫升12mol 的盐酸中，用水稀释至100毫升，将此溶液逐渐滴加到冰冷的5毫升1亚硝酸钠水溶液中，再用冰冷的水稀释到100毫升，需临用时新配。方法：香豆素显黄、橙、红、棕紫等颜色（试管反应显色剂）。34-胺基安替比林铁氰化钾（Emerson 反应）试剂检查物质：香豆素、酚类化合物。喷

65、洒剂的配制方法：溶液I 24-胺基安替比林的乙醇溶液；溶液II 8铁氰化钾的水溶液（或用0.94-胺基安替比林的乙醇溶液和5.4铁氰化钾的水溶液也可以）。方法：在色谱上先喷洒溶液I ，然后再喷洒溶液II 即显色，或再放入密闭缸内，缸内放25氢氧化铵水溶液，即产生黄、橙、红、棕紫等颜色。4稀氢氧化钠试剂检查物质：香豆素、酚类化合物。喷洒剂的配制方法：5氢氧化钠的甲醇溶液方法：在色谱上先喷洒显色剂后，在短波长的紫外光下观察荧光，比较喷洒前和喷洒后荧光的变化。5异羟肟酸铁试剂检查物质：酯和内酯类化合物。喷洒剂的配制方法：溶液I 取盐酸羟胺5克，溶于12毫升水中，再用乙醇稀释到50毫升，置于冷处保存备

66、用；取氢氧化钾10克，用很少量水溶解，再用乙醇稀释到50毫升，置于冷处保存备用；将盐酸羟胺备用液和氢氧化钾备用液以1:2混合，滤去氯化钾沉淀即得（所得滤液在冰箱中放置，可保存两星期）。溶液II 取三氯化铁（FeCl 36H 2O ）10克，用20毫升浓盐酸溶解，加入200毫升乙醚，振摇溶解，得均匀溶液，密塞储存可长期使用。方法：在色谱上先喷洒溶液I ，置于室温干燥后，再喷洒溶液II ，可显淡红色斑点。6间硝基苯试剂（Zimmermann s ）检查物质：酯、内酯、强心苷等。喷洒剂的配制方法：试剂I 2间硝基苯的乙醇溶液；试剂II 2.5mol的氢氧化钾水溶液。 方法：在色谱上先喷洒试剂I ，置

67、于室温干燥后，再喷洒试剂II ，于70100烘烤，显紫红色斑点。四、醌类显色剂1无色亚甲蓝试剂（leucomethylene blue）检查物质：苯醌类和萘醌类。喷洒剂的配制方法：取100毫克亚甲蓝溶于100毫升乙醇中，加入1毫升冰醋酸及1克锌粉，缓缓振摇直至蓝色消失即可。方法：在色谱上喷洒显色剂后，在白色背景上显蓝色斑点。2醋酸镁检查物质：蒽醌类、黄酮类喷洒剂的配制方法：取0.5克醋酸镁溶于100毫升甲醇中。方法：在色谱上喷洒显色剂后，于100烘烤510分钟，显红色至紫色斑点（蒽醌类化合物A 、B 环上羟基取代方式不同，呈现的颜色不同）3氢氧化钾检查物质：香豆素类、蒽醌类、黄酮类等。喷洒剂的

68、配制方法：取5克氢氧化钾溶于100毫升甲醇中（其它碱性试剂如3的氢氧化钠或碳酸钠溶液，50哌啶的苯溶液，饱和碳酸锂溶液，饱和硼砂溶液等也可使用）。方法：在色谱上喷洒显色剂后，在日光和紫外灯下检视斑点。4牢固兰B 试剂检查物质：香豆素类、蒽醌类、黄酮类、能偶氮化的酚类及芳胺类等喷洒剂的配制方法：溶液I 取0.5克牢固兰B 盐溶于100水中。溶液II 0.1mol氢氧化钠溶液方法：在色谱上先喷洒溶液II （也可喷洒氢氧化锂、钾等碱），再喷洒溶液I ，此时原来显荧光的斑点在可见光下显棕、紫或绿色。也可先喷洒溶液I ，然后再喷洒溶液II 。五、黄酮类显色剂1碱试剂检查物质：具有酚羟基的黄酮类等。喷洒剂的配制方法：氨水；10氢氧化钠或氢氧化钾溶液；1或5碳酸钠溶液等。方法：在色谱上喷洒显色剂后（可直接用氨水熏，不必喷洒），观察日光下和紫外灯下斑点喷洒显色剂前后的变化。2三氯化铝试剂检查物质：具有酚羟基的黄酮类等喷洒剂的配制方法：1或5三氯化铝的乙醇溶液。方法：在色谱上喷洒显色剂后（必要时可在红外灯下烘烤），观察日光下和紫外灯下斑点喷洒显色剂前后的变化。3醋酸镁试剂检查物质：具有酚羟基的黄酮类等。喷洒剂的配制方法：2醋酸镁的甲醇溶液。方法：在色谱上喷洒显色剂后（必要时可在红外灯下烘烤