玉环疾病预防控制中心作业指导书

1、玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第1页1目的与适用范围本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。2 染色液配制及染色法2.1 革兰氏染色法（可按成品试剂上的说明操作）2.1.1 结晶紫染色液结晶紫1g95%乙 醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。2.1.2 革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300mL。2.1.3 沙黄复染液沙黄0.25g95%乙 醇

2、10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。2.1.4 染色法2.1.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。2.1.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。2.1.4.3 滴加95%乙醇脱色，约 30s ;或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。2.1.4.4 水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。2.1.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注：亦可用1: 10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。2.2吉氏染色法（可按成品试剂上的说明操作）吉氏粉0.5g中性甘油25mL甲醇25mL将染

3、粉加少量甘油研磨，边研边加，至甘油加完为止，倾入100mL玻塞瓶内，加入甘油，塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温下35天，即为原液，临用时稀释。2.2.4 染色法2.2.4.1 将血片用甲醇固定约1 min。2.2.4.2 滴加10%染液染45 min。水洗，待干，镜检。2.3 硼砂美蓝染色法玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第2页2.3.1 硼砂3g2.3.2 美蓝2g置研钵内，边研边加水，待溶解后冲入瓶中，加蒸馏水100mL配成原液，过滤后备用.染色时取原液 5mL,加清水配成稀释液。2.3.3 染色法血片染35 min，使血

4、膜呈天蓝色，水洗，待干，镜检。2.4 耐酸性染色法（萎倪二氏法）（可按成品试剂上的说明操作）2.4.1 石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95%乙 醇10mL5%酚水溶液90mL将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。2.4.2 3%盐酸乙醇浓盐酸3mL95%乙 醇97mL2.4.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。2.4.4 染色法2.4.4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。2.4.4.2 滴加盐酸乙醇脱色，直至无红色脱落为止（所需时间视涂片厚薄而定，一般为13min），水洗。2.4.4

5、.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染30s1min，水洗，待干，镜检。2.4.5 结果：耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。3 生化试验培养基和试剂3.1生理盐水氯化钠8.5g蒸馏水1000mL溶解后，分装121C高压灭菌 20min。3.2 磷酸盐缓冲液3.2.1 储存液磷酸二氢钾34g1mol/L氢氧化钠溶液175mL蒸馏水825mL3.2.2 制法先将磷酸盐溶解于500mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH7.2后，再用蒸馏水稀释至 1000mL。3.2.3 稀释液：取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL。分装每瓶 100mL或每管10mL, 121C 高压灭

6、菌15min。3.3 75% 乙醇玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第3页95%乙 醇790mL蒸馏水210mL混匀后备用。3.4蛋白胨水（靛基质试验用）（可用微量发酵管）3.4.1成分蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH7.43.4.2制法按上述成分配制，分装小试管，121C高压灭菌15min。343靛基质试剂（可按成品试剂上的说明操作）343.1 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。343.2 欧波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇

7、内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。3.4.4试验方法挑取小量培养物接种，在 36 ± 1C培养12d ,必要时可培养 45d。加入柯凡克试剂 约0.5mL,轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧波试剂约 0.5mL,沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可 使用。3. 5尿素琼脂（可用微量发酵管）3.5.1 成分蛋白胨1g氯化钠5g葡萄糖1g磷酸二氢钾2g0.4%酚红溶液3mL琼脂20g蒸馏水1000mL20%尿素溶液100mLpH7.2± 0.13.5.2制法将除尿素和琼脂以外

8、的成分配好，并校正pH,加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。 121C高压灭菌15min。冷至5055C,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%,最终pH应为7.2 ± 0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。3.5.3 试验方法挑取琼脂培养物接种，在36± 1C培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第4页3.6 氰化钾（KCN）培养基（可按成品试剂上的说明操作或者用微量发酵管）361成分蛋白胨10g氯化钠5g磷酸二氢钾0.225g磷酸氢二钠5

9、.64g蒸馏水1000mL0.5%氰化钾溶液20mLpH7.63.6.2 制法将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121C高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入 0.5%氰化钾溶液2.0mL（最后浓度为1 : 10000），分 装于 12mmc 100mm灭菌试管，每管约4mL,立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在4C冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。3.6.3 试验方法将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾 （KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在 36 ± 1C培养12d,观察结果

10、。如有细菌生长即为阳 性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性 （抑制）。注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在 冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出， 以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。3.7 氨基酸脱羧酶试验培养基（可用微量发酵管）3.7.1 成分蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸馏水1000mL1.6%滇甲酚紫一乙醇溶液1mLL氨基酸或 DL氨基酸0.5或1g/100mLpH6.83.7.2 制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL,分别加入各种氨基酸：赖氨酸、

11、精氨酸和鸟氨酸。L 氨基酸按 0.5%加入，DL氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL,上面滴加一层液体石蜡，115C高压灭菌 10min。3.7.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36 ± 1C培养1824h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄 色。对照管应为黄色。3.8 糖发酵管（可用微量发酵管）玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第5页pH7.43.8.2制法3.8.1 成分

12、牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠3g磷酸氢二钠（NazHPO 12出0）2g0.2%滇麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mL3.8.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121 °C高压灭菌15min。3.8.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL, 121C高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。3.8.3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36 ±

13、1 C培养，一般观察23d。迟缓反应需观察1430d。3.9 ONPG培养基（可用微量发酵管）3.9.1 成分邻硝基酚 3 - D-半乳糖昔（ONPG）60mg(0 Nitrophe nyl 3 D galactopyra no side)0.01mol/L 磷酸钠缓冲液 (pH7.5)10mL1%蛋白胨水(PH7.5)30mL3.9.2 制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mrhC 75mm试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。3.9.3 试验方法自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于 36± 1C培养13h和24h观察结果。如果3 半乳糖苷酶产生，则于1

14、3h变黄色，如无此酶则24h不变色。3.10 丙二酸钠培（可用微量发酵管）3.10.1成分酵母浸膏1g硫酸铵2g磷酸氢二钾0.6g磷酸二氢钾0.4g氯化钠2g丙二酸钠3g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH6.8玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第6页3.10.2 制法先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，121C高压灭菌15min。3.10.3 试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于36± 1C培养 48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。3.11 葡葡糖铵培养基(可按成品

15、试剂上的说明操作)3.11.1 成分氯化钠5g硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.2g磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾1g葡萄糖2g琼脂20g蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mLpH6.83.11.2制法先将盐类和糖溶解于水内，校正pH,再加琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均405g0.2g1g1g5g20g1000mL40mLpH,再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后匀后分装试管，121C高压灭菌15min，放成斜面。3.11.3 试验方法用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊， 以每一接种环内含菌数在20100之间为宜。将接种环灭菌后挑取

16、菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于36 ± 1C培养24h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的 菌落生长；阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的 菌落可视为阴性结果。注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞, 干热灭菌后使用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。3.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基(可用微量发酵管)3.12.1 成分氯化钠硫酸镁(MgSO4 7H2O)磷酸二氢铵 磷酸氢二钾 柠檬酸钠 琼脂蒸馏水0.2%溴麝香草酚蓝溶液pH6.83.12.2 制法先将盐类溶解于水内，校正玉环县疾病预

17、防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第7页分装试管，121C高压灭菌15min。放成斜面。3.12.3试验方法挑取少量琼脂培养物接种，于36 ± 1C培养 4d,每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。3.13 氧化酶试验（可用纸片法）3.13.1 试剂3.13.1.1 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。3.13.1.2 1%a -萘酚乙醇溶液。3.13.2 试验方法3.13.2.1 取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现 粉红色，并逐渐加深；再加 a -

18、萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两 分钟内不变色。3.13.2.2 以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。3.14甲基红（MR）试验（可按成品试剂上的说明操作）自琼脂斜面挑取少量培养物接种缓冲葡萄糖蛋白胨水中，于36± 1 C培养 25d，哈夫尼亚菌则应在 2225C培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色 为阴性。甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于 30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。3.15 V P试验（可按成品试剂上的说明操作）用琼脂培养物接种缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基中，于36± 1C培养24d。哈夫尼

19、亚菌则应在2225C培养。加入 6%a 萘酚乙醇溶液 0.5mL和40%氢氧化钾溶液 0.2mL ,充 分振摇试管， 观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36± 1C下培养4h再进行观察。3.16 0.25% 氯化钙氯化钙2.5 g蒸馏水1000 mL3.17 缓冲葡萄糖蛋白胨水（可用微量发酵管）3.17.1 成分磷酸氢二钾5g多胨7g葡萄糖5g蒸馏水1000mLpH7.03.17.2 制法溶化后校正 pH,分装试管，每管1mL, 121C高压灭菌15min。3.18 3% 过氧化氢溶液30%过氧化氢溶液临用时稀释10倍。3.19 20%碳酸钠溶液碳酸钠20g

20、灭菌蒸馏水100mL3.20 甘露醇发酵培养基（可用微量发酵管）玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第8页牛肉膏5g甘露醇10g蛋白胨10g氯化钠5g0.2%麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mL3.20.2制法将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，校正pH7.4后，加入甘露醇和3.20.1 成分指示剂，分装试管，121C高压灭菌20min。3.21 1.5%硫代硫酸钠硫代硫酸钠15g蒸馏水1000mL121 C高压灭菌20min。3.22 10%硫代硫酸钠硫代硫酸钠100g蒸馏水1000mL121 C高压灭菌2

21、0min。3.23 0.1% 硫代硫酸钠肉汤硫代硫酸钠1g肉汤1000mL121 C高压灭菌20min。3.24 3%(W/V)吐温80和0.3%卵磷脂肉汤吐温8030g卵磷脂3g肉汤1000mL121C高压灭菌20min。3.25 0.3% 甘氨酸肉汤甘氨酸3g肉汤1000mL115 C高压灭菌15min。3.26 3%(W/V)吐温80吐温8030g肉汤1000mL121C高压灭菌20min。4 一般培养基和专用培养基4.1 营养琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.1.1成分蛋白胨10g牛肉膏3g玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2

22、版，共26页第9页氯化钠5g琼脂1520g蒸馏水1000mL4.1.2 制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL,校正pH至7.27.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121C高压灭菌15min。注：此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面。如用于菌落计数，琼 脂量为1.5% ;如作成平板或斜面，则应为 2%4.2 乳糖胆盐发酵管（可按成品试剂上的说明操作）4.2.1 成分蛋白胨20g猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g乳糖10g0.04% 滇甲酚紫水溶液25mL蒸馏水1000mLpH7.44.2.2 制法10mL,并放入将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，

23、校正pH,加入指示剂，分装每管个小倒管，115C高压灭菌15min。注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。PH,分装于烧瓶内，121 C高压灭菌 5055 C,加入伊红和美蓝溶液，摇4.3 伊红美蓝琼脂（EMB）（可按成品试剂上的说明操作）4.3.1成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂17g2%伊红Y溶液20mL0.65%美蓝溶液10mL蒸馏水1000mLpH7.14.3.2制法将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正 15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至 匀，倾注平板。4.4 乳糖发酵管（可用微量发酵管）4.4.1 成分蛋白胨20g乳糖10g0.04% 溴甲

24、酚紫水溶液25mL蒸馏水1000mL玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第10页pH7.4442制法将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH,加入指示剂，按检验要求分装 30mL、10mL或3mL，并放入一个小倒管，115C高压灭菌15min。注：双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用， 验用。4.5 EC肉汤（可按成品试剂上的说明操作）3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试4.5.1 成分胰蛋白胨20g3号胆盐（或混合胆盐）1.5g乳糖5g磷酸氢二钾4g磷酸二氢钾1.5g氯化钠5g蒸馏水

25、1000mL4.5.2 制法将上述成分混合，溶解后，分装有发酵倒管的试管中, 为 6.9 ± 0.2。4.6 缓冲蛋白胨水（BP）（可用微量发酵管）121C高压灭菌15min，最终pH4.6.1 成分蛋白胨I0g氯化钠5g磷酸氢二钠（NazHPQ 12H2O）9g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mLpH7.24.6.2 制法按上述成分配好后以大烧瓶装，121C高压灭菌 注：本培养基供沙门氏菌前增菌用。15min。临用时无菌分装每瓶225mL。4.7氯化镁孔雀绿增菌液（MM）（可按成品试剂上的说明操作）4.7.1 甲液胰蛋白胨5g氯化钠8g磷酸二氢钾1.6g蒸馏水1000mL4.7.2

26、 乙液氯化镁（化学纯）40g蒸馏水100mL4.7.3 丙液玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第11页0.4%孔雀绿水溶液。4.7.4 制法分别按上述成分配好后，121C高压灭菌15min备用。临用时取甲液90mL、乙液9mL、丙液0.9mL，以无菌操作混合即可。注：本培养基亦称Rappaport 10（R 10）增菌液。4.8亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）（可按成品试剂上的说明操作）4.8.1成分蛋白胨5g乳糖4g亚硒酸氢钠4g磷酸氢二钠5.5g磷酸二氢钾4.58L-胱氨酸0.01g蒸馏水1000mL4.8.2 1%L-胱

27、氨酸氢氧化钠溶液的配法：称取L 胱氨酸 0.1g（或DL胱氨酸0.2g），力口 1mol/L氢氧化钠1.5mL，使溶解，再加入蒸馏水 8.5mL即成。4.8.3 制法：将除亚硒酸氢钠和L胱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸馏水中，加热煮沸，俟冷备用。另将亚硒酸氢钠溶解于100mL蒸馏水中，加热煮沸，候冷，以无菌操100mL,作与上液混合。再加入1%L肮氨酸-氢氧化钠溶液1mL。分装于灭菌瓶中，每瓶pH 应为 7.0 ± 0.1。4.9 SS琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.9.1 基础培养基5g5g3.5g17g1000mL15min，保存备用。牛肉膏脙胨三号胆盐琼脂蒸馏水再将两液

28、混合，121C高压灭菌4.9.2完全培养基基础培养基100mL乳糖10g柠檬酸钠8.5g硫代硫酸钠8.5g10%柠檬酸铁溶液10mL1%中性红溶液2.5mL0.1%煌绿溶液0.33mL加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均匀，校正至48h内使用。pH7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。注：制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于10d以内使用。煌绿溶液配好后应在玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第12页可以购用 SS琼脂的干燥培养基。4.10 三糖铁琼脂（换用方法）（可按成品试剂上的说明操作）1

29、5g5g3g3g10g10g1g5g0.2g0.3g 12g0.025g1000mL4.10.1 成分蛋白胨脙胨牛肉膏酵母膏乳糖蔗糖葡萄糖氯化钠硫酸亚铁硫代硫酸钠琼脂酚红 蒸馏水pH7.44.10.2 制法将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶121C高压灭菌15min，放置高层斜面备用。4.11半固体琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.11.1成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠0.5g琼脂0.35 0.4g蒸馏水100mLpH7.44.11.2制法按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分装小试管。121C高压灭菌15min。直立H抗原位相变异试验等用。

30、（可按成品试剂上的说明操作）化琼脂。加入 0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底 层。凝固备用。注：供动力观察、菌种保存、4.12 亚硫酸铋琼脂 （BS）4.12.1成分蛋白胨10g牛肉膏5g葡萄糖5g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4g玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第13页煌绿0.025g柠檬酸铋铵2g亚硫酸钠6g琼脂18 20g蒸馏水1000mLpH7.54.12.2制法4.12.2.1将前面5种成分溶解于 300mL蒸馏水中。4.12.2.2将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50mL蒸馏水

31、溶解。4.12.2.3将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，冷至80C4.12.2.4将以上三液合并，补充蒸馏水至1000mL,校正 pH,.冷至 5055C,倾注平皿。加0.5%煌绿水溶液 5mL,摇匀。注：此培养基不需高压灭菌。制备过程不宜过分加热.以免降低其选择性。应在临用前天制备，贮存于室温暗处。超过48h不宜使用。4.13 GN增菌液（可按成品试剂上的说明操作）4.13.1 成分胰蛋白胨20g葡萄糖1g甘露醇2g柠檬酸钠5g去氧胆酸钠0.5g磷酸氢二钾4g磷酸二氢钾1.5g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH7.04.13.2 制法按上述成分配好，加热使溶解，校正pH。分装每瓶 225mL

32、, 115C高压灭菌15min。4.14 麦康凯琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.14.1 成分蛋白胨脙胨猪胆盐（或牛、羊胆盐氯化钠琼脂蒸馏水乳糖0.01%结晶紫水溶液0.5%中性红水溶液17g3g)5g5g17g1000mL10g10mL5mL玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第14页4.14.2 制法4.1421将蛋白胨、胆盐和氯化钠溶解于 400mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121C高压灭菌15min备用。4.14.2.2 临用时加热溶化琼脂，趁热加

33、入乳糖，冷至5055C时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。4.15 葡萄糖半固体发酵管（可按成品试剂上的说明操作）4.15.1 成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1mL葡萄糖1g琼脂0.3g蒸馏水100mLpH7.44.15.2 制法将蛋白胨、牛肉膏和氯化钠加入于水中，校正pH后加入琼脂加热溶解，再加入指示剂和葡萄糖，分装小试管，灭菌121C 15 min。4.16 5%乳糖发酵管（可按成品试剂上的说明操作）4.16.1 成分蛋白胨0.2g氯化钠0.5g乳糖5g2%溴麝香草酚蓝水溶液1.2mL蒸馏水100

34、mLpH7.44.16.2 制法除乳糖以外的各成分溶解于50mL蒸馏水内，校正 pH。将乳糖溶解于另外50mL蒸馏水内，分别灭菌 121C 15min，将两液混合，以无菌操作分装于灭菌小试管内。注：在此培养基内，大部分乳糖迟缓发酵的细菌可于1d内发酵。4.17 营养肉汤（可按成品试剂上的说明操作）4.17.1成分蛋白陈10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH7.44.17.2制法玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第15页按上述成分混合，溶解后校正pH,分装烧瓶，每瓶225mL, 121C高压灭菌15min葡萄糖5g

35、牛胆盐20g磷酸氢二钠8g磷酸二氢钾2g煌绿0.015g蒸馏水1000mL4.18.2制法按上述成分配好，加热使溶解，校正pH7.2。分装每瓶 30mL, 115C高压灭菌15min。4.19 氯化钠结晶紫增菌液（可按成品试剂上的说明操作）4.19.1成分蛋白胨20g氯化钠40g0.01%结晶紫溶液5mL蒸馏水1000mLpH 9.04.19.2制法除结晶紫外，其他按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧化钾溶液4.5mL，校正加热煮沸，过滤。再加入结晶紫溶液,混合后分装试管。121 C咼压火菌15min。4.20 氯化钠蔗糖琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.20.1成分蛋白胨10g牛肉膏1

36、0g氯化钠50g蔗糖10g琼脂18g0.2%溴麝香草酚蓝溶液20mL蒸馏水1000mLpH7.84.20.2制法将牛肉膏、蛋白胨及氯化钠溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热溶解，过滤。10g备用。临用前在 100mL培养基内加入pH。4.18肠道菌增菌肉汤（可按成品试剂上的说明操作）4.18.1 成分蛋白胨1加入指示剂，分装烧瓶100mL。121C高压灭菌 15mi n蔗糖1g,加热溶化并冷至50 C，倾注平板。4.21嗜盐菌选择性琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.21.1 成分蛋白胨20g40g氯化钠玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号

37、：第 2版，共26页第16页琼脂17g0.01%结晶紫溶液5mL蒸馏水1000mLpH8.74.21.2 制法除结晶紫和琼脂外，其他按上述成分配好，校正pH。加入琼脂，加热溶解。再加入结晶紫溶液，分装烧瓶，每瓶100mL。4.223.5%氯化钠三糖铁琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.22.1 成分三糖铁琼脂1000mL氯化钠30g4.22.2 制法按4.10配制三糖铁琼脂，再加入氯化钠30g，分装试管，121C高压灭菌15min。放置高层斜面备用。4.23嗜盐性试验培养基4.23.1成分蛋白胨2g氯化钠按不同量加蒸馏水100mLpH7.74.23.2制法配制2%蛋白胨水，校正pH,共配制5瓶

38、，每瓶100mL。每瓶分别加入不同量的氯化钠： 不加；（2）3g ; （3）7g ; （4）9g ; （5）11g。待溶解后分装试管。121C高压灭菌 15min。4.24 3.5%氯化钠生化试验培养基（可按成品试剂上的说明操作）4.24.1 成分及制法根据所需糖的种类按3.8配制。只是将氯化钠含量改为3.5% , pH为7.74.25 7.5%氯化钠肉汤（可按成品试剂上的说明操作）4.25.1 成分蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠75g蒸馏水1000mLpH7.44.25.2 制法将上述成分加热溶解，校正pH,分装试管，121C高压灭菌15min。4.26 血琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.

39、26.1 成分pH7.47.6豆粉琼脂100mL脱纤维羊血（或兔血）510mL4.26.2 制法玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第17页加热溶化琼脂，冷至50 C，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可分装灭菌试管，置成斜面。亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂。4.27 Baird Parker氏培养基（可按成品试剂上的说明操作）4.27.1 成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母膏1g丙酮酸钠10g甘氨酸12g氯化锂（LiCI 6H 2O）5g琼脂20g蒸馏水950mLPH7.54.27.2 增菌剂的配法30%

40、卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚蹄酸钾溶液 10mL混合，保存于冰箱内。4.27.3 制法将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解。冷至25C,校正pH。分装每瓶95mL,121C高压灭菌 15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50C,每95mL加入预热至 50C的卵黄亚蹄酸钾增菌剂5mL,摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。4.28 3.8%柠檬酸钠溶液4.28.1 成分柠檬酸钠3.8g蒸馏水100mL4.28.2 制法取柠檬酸钠 3.8g，加蒸馏水到 100mL,溶解后过滤，装瓶，121C高压灭菌15min。注：兔（人）血浆制备：取3.8%柠檬酸钠溶液一

41、份加兔（或人）全血四份，混好静置之,则血球下降，即可得血浆进行试验。4.29葡萄糖肉汤4.29.1成分牛肉膏5g氯化钠5g蛋白胨10g葡萄糖10g蒸馏水1000mLpH7.2 /7 7.44.29.2制法将上述成分溶于蒸馏水中，调pH,加热溶解，分装试管,121C高压灭菌 15min后备用。玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第18页4.30 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.30.1 成分蛋白胨牛肉膏甘露醇氯化钠琼脂蒸馏水0.2%酚红溶液50%卵黄液多粘菌素B10g1g10g10g15g1000mL13

42、mL50mLpH7.44.30.2制法100国际单位/mL将前面五种成分加入于蒸馏水中，加热溶解，校正pH，加入酚红溶液。分装烧瓶，每瓶100mL, 121C高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50C，每瓶加入 50%卵黄液5mL及多粘菌素 B10000国际单位，混匀后倾注平板。4.31硝酸盐蛋白胨水培养基（可按成品试剂上的说明操作）4.31.1 成分蛋白胨酵母浸膏硝酸钾亚硝酸钠 蒸馏水4.31.2 制法将蛋白胨与酵母浸膏加到蒸馏水中，加热溶解，校正,分装到加有小倒管的试管中，10g3g2g0.5g1000mL入硝酸钾和亚硝酸钠溶解均匀4.32pH7.2。煮沸过滤后补足液量，加115

43、C高压灭菌 20min 。4.32.1蛋白胨牛肉膏明胶蒸馏水4.32.2明胶培养基（可按成品试剂上的说明操作）成分5g3g120g1000mL制法将上述成分混合，置流动蒸气灭菌器内，加热溶解，校正滤。分装试管，121C灭菌 15min，备用。4.33孟加拉红培养基（虎红培养基）（可按成品试剂上的说明操作）4.33.1 成分pH至7.07.2，用绒布过蛋白胨5g葡萄糖10g磷酸二氢钾1g玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第19页硫酸镁(MgSO 7H2O)0.5g琼脂20g1/3000孟加拉红溶液100mL蒸馏水1000mL

44、氯霉素0.1g4.33.2制法上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加 入培养基中，分装后，121C灭菌20min。4.33.3 用途分离霉菌及酵母。4.34 煌绿肉汤增菌液4.34.1 成分肉浸液肉汤（或牛肉膏汤）1000mL磷酸氢二钾1g2%煌绿溶液0.510mL4.34.2 制法4.34.2.1 将肉浸液肉汤加入磷酸氢二钾（原已有磷酸氢二钾者可不加），校正pH,分装烧瓶，每瓶 100mL, 121 °C高压灭菌20min。4.34.2.2 2%煌绿水溶液于临用前配制。4.34.2.3 按比例见 GB 4789.19 94食品卫生微生物学检验蛋与

45、蛋制品检验于肉汤内加入煌绿溶液，摇匀，备用。注：加入煌绿溶液时，肉汤温度不宜过高，一般以放冷为宜。煌绿的纯度不应低于93%4.35 （ T-M）培 养基 （按成品试剂上的说明操作）用途：淋球菌培养4.36 SF（按成品试剂上的说明操作）用途：沙门菌增菌4.37 乳糖蛋白胨培养液（可按成品试剂上的说明操作）4.37.1 成份蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L ） 1ml蒸馏水1000ml4.37.2 制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.27.4，再加入1ml溴甲酚紫乙醇溶液 （16g/L ），充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115 C

46、高压灭菌 20min ,储存于冷暗处备用。4.38亮绿乳糖培养液（BGB （可按成品试剂上的说明操作）标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第20页4.38.1 成分蛋白胨10g乳糖10g牛胆盐2g亮绿0.0133g蒸馏水1000ml4.38.2 制法除亮绿外，将其他成分溶于蒸馏水中，调pH到7.2,加入亮绿,混匀，分装到带有倒管的试管中,每管10ml,115C 20min 火菌。4.39 SCDLP液体培养基（可按成品试剂上的说明操作）4.39.1 成分酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐温807g蒸馏水1000ml4.39.2 制法将各种成分混

47、合 （如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨可用日本多价胨代替）,加热溶解，调pH至7.27.3,分装,121C火菌20min,摇匀，避免吐温80沉于底部冷至 25 C后使用。玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-0014.40十六烷三甲基溴化铵培养液（可按成品试剂上的说明操作）4.40.1 成分牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g十八烷三甲基溴铵0.3g琼脂20g蒸馏水1000ml4.40.2 制法除琼脂外，上述各成分混合加热溶解,调pH至7.47.6,然后加入琼脂,115 C灭菌20min,冷至55 C左右，倾注平皿。4.41绿脓菌素测定用培养基斜面（可按成品试剂上的说明操作）4.4

48、1.1 成分蛋白胨20g氯化镁1.4g硫酸钾10g琼脂18g甘油（化学纯）10g玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2版，共26页第21页蒸馏水加至1000ml4.41.2 制法将蛋白胨 氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加热溶解，调pH至7.4,加入琼脂和甘油，加热溶解，分装试管,115 C灭菌20min,制甩斜面备用。4.42沙氏琼脂培养基（可按成品试剂上的说明操作）4.42.1 成分蛋白胨 葡萄糖 琼脂蒸馏水4.42.2 制法10g40g20g1000ml用700ml蒸馏水将琼脂溶解,300ml蒸馏水将葡萄糖与蛋白胨溶解,混合上述两部分，摇0.1g/L的氯霉素或者匀后分装，115 C灭菌15min,即可。使用前，用过滤除菌方法加入0.03g/L 的链霉素。4.43碱性蛋白胨水（碱胨水）（可按成品试剂上的说明操作）4.43.1 成份蛋白胨10g氯化钠10g蒸馏水1000mlPH 8.64.43.2 制法混匀后分装试管,15磅20分钟高压蒸汽灭菌。80-营养琼脂培养基（可按成品试剂上的说明操作）20g5g15g3g1g7g1000ml4.44 4号琼脂（按成品试剂上的说明操作）4.45卵磷脂、吐温4.45.1 成分蛋白胨氯化钠琼脂牛肉膏卵