植物组织培养复习大纲

1、绪论（一）植物组织培养的基本概念植物组织培养（plant tissue culture）： 在无菌条件下，利用人工培养基，对植物材料（器官、组织、细胞或原生质体等）的离体培养。 外植体 （explant）： 接入培养基，以进行离体培养的植物材料。 接种 （inoculate）： 在无菌条件下，将外植体接入培养基，以进行培养的操作。 初代培养 ： 对从植物体上分离下来的外植体，进行的最初培养，其目的是建立无菌培养系。继代培养： 将初代培养诱导产生的培养物，重新分割，转到新鲜培养基上，继续进行的培养。 脱分化 （dedifferentiation）： 细胞由成熟状态转变为分生状态的过程。 愈伤组织

2、 （callus）： 无定形、具有分生能力而无特定功能的一团无序生长的薄壁细胞。 植物细胞全能性 （plant cell totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息，和发育成完整植株的潜在能力。 （二）植物组织培养的发展简史1、探索阶段（20世纪初20世纪30年代中）20世纪初，德国植物生理学家Haberlandt： 小野芝麻和凤眼兰栅栏组织的单个细胞 虎眼万年青属的表皮细胞的单个细胞 ； Knop蔗糖； 细胞生长、胞壁加厚、淀粉形成； 细胞分裂： ？ 高度分化的细胞； 未加植物生长物质的简单培养基。 植物组织培养的先驱者植物组织培养的

3、先驱者2、奠基阶段（20世纪30年代中50年代末）20世纪30年代中，对植物生长的两个重要发现： B族维生素； 生长素。1934年，美国科学家White：番茄根尖； 培养基（原来）：无机盐酵母浸出液蔗糖；（后来）：无机盐B族维生素（吡哆醇、硫胺素、烟酸）蔗糖；建立了第一个活跃生长的无性系；White培养基。1934年，法国科学家Gautheret：山毛柳和黑杨等的形成层组织； Knop 盐酸半胱氨酸葡萄糖；（胡萝卜根形成层）B族维生素生长素；首次获得连续生长的组织培养物。1934年，Nobecourt ： 胡萝卜；也建立了类似的连续生长的组织培养物。Gautheret、White和Nobeco

4、urt：植物组织培养的奠基人20世纪40年代50年代初，Skoog（1944）；Skoog和崔徵（1951）：腺嘌呤不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素的对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成。确立了：腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。导致了激动素的发现以及利用激动素和生长素在植物组织培养中控制器官分化研究工作的开展。1941年，Overbeek et al：将椰子汁加入培养基：曼陀罗的心型期幼胚离体培养成熟。1952年，Morel和Martin：对已被病毒侵染的大丽花茎尖分生组织进行离体培养：获得脱毒植株.1953年，Muir：将万寿菊和烟草的愈伤组织转移到液体

5、培养基中，于摇床上振荡，使组织散碎，形成由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液，再经继代培养：获得了单细胞培养的初步成功；还用机械方法由细胞悬浮液和易散碎的愈伤组织中分离得到单细胞，将其置于铺在愈伤组织上面的滤纸上培养：细胞发生了分裂。此即“看护培养”技术。>1955年，Miller et al：从鲱鱼中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并将其定名为激动素（kinetin）。现将具与激动素类似活性的天然的或合成的一类化合物统称为细胞分裂素。>1957年，Skoog和Miller：提出了有关植物生长物质控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的

6、函数，通过改变培养基中这两类植物生长物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根；这一比率低时促进茎芽的分化；二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。>后来证明：植物生长物质可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些植物生长物质的内生水平不同。因而，对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源植物生长物质的水平也会有所不同。>1958年，Steward et al：以胡萝卜为材料，首次通过实验证实了先驱者Haberlandt关于细胞全能性的设想，成为植物组织培养研究历史中的一个里程碑。1958年，Reinert和Steward分别报

7、道：在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道，很多物种都能形成体细胞胚。>3、迅速发展阶段（20世纪60年代现在）（1）原生质体培养取得重大突破：1960年，Cocking et al用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功；1971年，Takebe et al在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除生殖细胞和有壁体细胞以外，体细胞的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可为基因工程外源基因的导入提供理想的受体材料；1972年，Carlson et al通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。（

8、2）花药培养取得显著成绩：1964 年，Guha and Maheshwari 报道，在毛曼陀罗中通过花药离体培养由小孢子直接发育成胚； 1967年，Bourgin and Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。（3）微繁技术得到广泛应用：1960年，Morel建立了一个离体营养繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。由于这一方法具巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”。在其它许多观赏植物和经济植物中，微繁也达到了工厂化的生产规模。1962年，Murashinge和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。 （三）植物组织培养与其它生命科学的关系1、植物组

9、织培养是植物基因工程不可或缺的组成部分。无论是转基因受体的提供，还是转化细胞的筛选和再生，都需组织培养技术作为支撑。>2、植物组织培养是生物制品的有效生产途径。有些极其昂贵的生物制品，例如抗癌首选药物紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。国内在红豆杉组织培养中获得高产细胞系，每L细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25 mg。3、在植物杂交育种中，采用花药培养技术不但可以缩短杂合体纯合化所需的时间，而且还可节省土地面积。>4、在远缘杂交中，通过原生质体融合可克服受精前障碍；通过幼龄合子胚培养可克服受精后障碍；通过原生质体融合可获得细胞质杂种。>5、对于无药可治的病毒病，可

10、通过茎尖培养消除病毒。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等。>6、通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可进行很多名贵花卉等重要园艺植物的快速繁殖。一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如：一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。>7、应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化，从而大大提高选择效率，节省时间和土地面积，且不受季节的限制。例如：中国林科院通过逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。>8、愈伤组织培养等可产生体细胞无性系变异，为不同的育种目标提供（除有性杂交、理化诱变外的第三类）可利用的变异

11、。>9、特别在营养繁殖植物中，通过茎尖分生组织等离体材料的超低温保存，不但可大大节省空间，而且可使其免受病虫侵袭，且便于无毒种质的国际交流。>二、实验室的基本分区及设备（一）概述如果新建实验室，那么最好应选择在光线充足、通风良好、空气清新、环境清洁、水电齐备、交通便利的地方，注意避开各种污染源。也可因地制宜利用现有房舍，按照相关要求改建而成。实验室的大小可根据各自的工作性质和生产规模来设计，面积可大可小。如用于科研和小规模生产的，面积可较小；如为大规模工厂化生产的，面积应较大，其常被称为“组培工厂”。一个大型的植物组织培养实验室可设置：洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、

12、接种室、培养室、观察记录室、贮藏室，另外还可配置一定面积的炼苗温室。小型植物组织培养实验室可将上述同类分区加以合并。如果条件允许，那么其可分为准备室、接种室、培养室、炼苗室等区室。一般按照自然工作程序，将上述各区室依次安排成一条连续的生产线。 洗涤室：用于玻璃器皿、实验用具的清洗干燥；培养材料清洗及预处理也可在本室完成。 药品室：用于存放各种药品试剂。要求：干燥、通风，避免光照。 称量室：进行化学药品的称量。要求：干燥、密闭、无直射光照，避免腐蚀性药品与水汽直接接触。 培养基配制室：主要进行贮备液和植物生长物质原液的配制以及培养基的配制、分装、包扎及灭菌前的暂时存放。 灭菌室：主要用于培养基和

13、器皿的灭菌以及蒸馏水的制备。 接种室：主要进行植物材料的表面灭菌、分离切割及转接等。面积：宜小不宜大，一般小的接种室为57m2。要求：地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉门，以减少开关门时的空气扰动。在适当位置吊装12盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。接种室外应设有缓冲间，面积以1m2为宜。进入接种室前在此更衣换鞋，以减少进出时将杂菌带入接种室。缓冲间最好也装一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。 培养室：培养植物材料的场所。室内的培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约10cm，其它每层间隔30cm左右

14、，整个培养架高约1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计的，宽度一般为60cm。培养室内各因子设置（培养的物理条件）：培养室中对培养影响最大的因子是温度。为适合大多数植物生长，一般通过冷热可控空调，通常将温度设定为25±2 。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，因此最好不同种类有不同温度的培养室。室内湿度也应维持恒定，一般相对湿度以保持在70%80%为宜，可通过加湿器、除湿器来调节。光照强度：对多数植物来说，10004000 lx的光强即能满足其生长的需要。光周期：可通过定时开关控制。一般设为每天光照1016 h。通常短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照

15、条件。也有一些培养类型需要连续黑暗。黑暗条件：利于愈伤组织的诱导和增殖、再生器官原基的分化等；光照条件：利于器官增殖发育等。光质：对愈伤组织的诱导、培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。例如：百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织；但在蓝光下培养，十几周后才出现愈伤组织。而唐菖蒲子球块接种15 d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛；而白光下幼苗纤细。对于杨树愈伤组织生长：红光促进；蓝光阻碍。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源。这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，炼苗容易成活。在阴雨天可用灯光作补充。 观察、记录室：用于对培养物的生长情况

16、及实验结果进行观察记录。 贮藏室：用于暂时不用的器皿和用具等的存放。 炼苗室：用于试管苗的炼苗和移栽。（二）基本分区及其设备1、准备室及其设备主要用于：器皿洗涤、干燥、贮存；试剂贮存、称量、配制；培养基配制、分装、灭菌等。主要设备有：洗涤池、烘箱、药品柜、冰箱、工作台、天平、蒸馏水发生器等制水设备、贮物柜、三角瓶、电热磁搅拌器、 pH计、电炉、微波炉等加热设备（熔化琼脂等）、恒温水浴、培养基分装器、培养容器等各种所需器皿及用具、封口材料、医用小推车等运输工具、高压蒸汽灭菌锅（小型手提式或中型立式或大型卧式）、吸气机或真空泵（辅助过滤灭菌）、细菌过滤器、离心机、血球计数器、显微镜等。注意要点：电

17、子分析天平和托盘天平：电子分析天平用于称取大量元素、微量元素、维生素、植物生长物质等微量药品，精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。>注意要点：pH计：组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用pH计测定。若无pH计，也可使用pH试纸进行粗测。首次使用pH计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度扭，使之与培养基温度相当。>注意要点：高压蒸汽灭菌锅：用于耐热培养基、蒸馏水和接种器械等的灭菌消毒。工作原理：在密闭

18、的蒸锅内0.1 MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。使用方法：首先检查灭菌锅内是否有水，而且水刚好淹过加热器，然后放入灭菌材料，对称拧紧灭菌锅上的螺丝，关闭放气阀，再通电。待压力上升到0.05 MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0.10.15 Mpa时，维持20 min后，断电，待压力降至零时，打开放气阀，取出灭菌材料。注意要点： 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培基质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力；对一些布制品，在洗净晾干后，用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20

19、30min；而对培养基，要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间； 高压灭菌前、后的培养基，pH值下降0.20.3单位。因此，调pH值时，可适当调高0.20.3个单位；烘箱：可用于干燥洗净的玻璃器皿，可用于干热灭菌，也可用于烘干鲜物质以测定干物重。用于干燥器皿，需保持80100 ；用于干热灭菌，需保持150 ，达13 h；用于烘干物质，需保持80 ，烘干至完全干燥为止。注意要点：培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿现逐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、不易破碎、成本低等优点。 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和

20、杂菌污染。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸，也可采用专用的封口膜。2、接种室（附缓冲间）及其设备缓冲间界于准备室与接种室之间。该室主要用于操作人员进入接种室之前在此更衣换鞋、洗手等。主要设备有：紫外线灭菌灯、搁物架、洗手池、衣帽架、鞋柜等。接种室主要用于植物材料的消毒、无菌清洗、接种、无菌培养物的继代接种等。主要设备有：紫外线灭菌灯、搁物架（贮放灭过菌待接种的培养容器等）、超净工作台、酒精灯、酒精缸（用于浸泡接种用具）、酒精喷壶（用于消毒灭菌）、接种用具（包括用于接种切割等的无菌器皿）、接种用具灭菌器、灭菌剂及灭菌所需助剂、器皿、废物缸、闹钟、医用

21、小推车等运输工具、双筒显微解剖镜、空调等。注意要点：超净工作台：使用前，将超净工作台的排风和杀菌按钮开启，灭菌15 min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。解剖镜：种类较多，用于分离茎尖，采用双筒实体解剖镜。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。解剖刀：切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。3、培养室及其设备主要设备有：分层培养架与日光灯管（每层40 W日光灯12盏，架长约126 cm）、定时开关（控制光周期）、空调、加除湿器、摇床（平动式，或旋转式；或

22、温光可控式：进行细胞悬浮培养）、培养箱（恒温培养箱；光照培养箱）等。>注意要点：摇床：在悬浮培养中，可改善液体培养基中的培养材料的通气状况，例如：从疏松愈伤组织中获得单细胞或小细胞团。但要注意设定适合的温度及转速。>4、炼苗室及其设备主要用于试管培养苗到自然生长苗状态的适应锻炼。主要设备有：分层架、光源（自然光或人造光）、温控设备等。>三、培养基（一）概述拟定植物组织培养方案：查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合将要研究的植物的情况，制定出切实可行的培养方案。其中，确定各种合适的培养基是植物组织培养最重要的内容，是决定培养成败的关键因素。没有一种现成的培养基能适合

23、一切类型的植物组织、器官等的离体培养。因此在建立一个新的培养系统时，首先必须研制出一种能满足该待培养材料所需的培养基。一些早期的植物组织培养基，如Gautheret（1939）提出的愈伤组织培养基和White（1943）提出的根培养基，都是由先前用于整体植物栽培的营养液发展而来的。而以后几乎所有的培养基，都是建立在White培养基和Gautheret培养基的基础之上的。1、常用的基本培养基基本培养基：MS、White、B5、Nitsh、 改良MS、Heller、Miller、N6、SH等。完全培养基：在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质而成，例如：加植物生长物质、其它复杂有机

24、物等。>2、常用基本培养基的特点（1）MS培养基 它是1962年 由Murashige and Skoog 为培养烟草细胞而设计的。 特点：无机盐浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其是铵盐和硝酸盐的含量很大，能够满足快速增长的组织对营养元素的需求。有加速愈伤组织等培养物生长的作用，当培养物长时间不转移时，仍可维持其生存。>（2）White培养基 它是1943 年由White 为培养番茄根尖而设计的。 1963 年又作了改良，称作White 改良培养基，提高了MnSO4 浓度，增加了硼素。 特点：无机机盐数量较低，适于生根培养。>（3）B5培养基 它是1968 年由Gamborg

25、et al 为培养大豆根细胞而设计的。 特点：含有较低的铵盐、较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。适合于某些双子叶植物，特别是木本植物的生长。>（4）N6培养基 它是1974 年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 特点：成分较简单，KNO3 和（NH4 ）2SO4 含量高。 广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花粉、花药培养。 >各种常用基本培养基之间在组分上的主要差别在于所含各种离子数量上的不同。目前，MS培养基是一种最常用的植物离体培养基。 >配制培养基的化学药品的纯度：尽量选用分析纯，有时化学纯也可代用。配制培养基对水的要求：在研究工作中，一般需用重蒸水或蒸馏水，也可用去离

26、子水；在工厂化大量生产时，可试用对植物无毒害、水质软（配制培养基经高压灭菌后不产生沉淀）的水源。 >国际植物生理学会建议：在植物组织培养的文献中采用摩尔值（mol/L及其派生单位）作为培养基中化学物质的计量单位，以便对不同的培养基进行比较。在实际工作中，也常用mg/L为单位。在需要时，可以进行两者间的换算。 >（二）培养基的组成无机营养成分、有机营养成分、植物生长物质、其它成分、琼脂及其它固化剂、pH1、无机营养成分除了碳、氢、氧之外，还有氮、磷、钾、钙、硫、镁、（硅）、（氯）、硼、铜、铁、锌、锰、（镍）、钼、（钠）等12（19）种元素。氮、磷、钾、钙、硫、镁的需要量较大（0.5

27、mmol/L），被称为大量元素；硼、铜、铁、锌、锰、钼的需要量较小（0.5 mmol/L），被称为微量元素。 >氮是生命不可缺少的物质。在制备培养基时，常以NO3和NH4两种形式供应。多数培养基既含NO3又含NH4。NH4对植物生长较为有利。供应N的物质有KNO3、NH4NO3等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。 >在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对氮的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2PO4或NaH2PO4等。 >钾与碳水化合物合成和转移及氮素代谢等有密切关系。在制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类提供。 >

28、;Mg、S和Ca：Mg和S常以MgSO4·7H20提供，用量为13mg/L。Ca常以CaCl2·2H2O提供。 >现在多数培养基中，铁是以一种螯合形式（Fe·EDTA）提供的，其在培养基的pH值升至7.68.0时，仍可被植物组织所利用。 在单独使用时，硝酸盐会使培养基的pH值向碱性方向漂移；若硝酸盐与少量铵盐一起使用，则这种漂移即可被阻止。因此，多种培养基既含有硝酸盐，也含有铵盐。 >2、有机营养成分（1）含氮物质一般认为，硫胺素（VB1）是必需的。在其它各种维生素中，已知烟酸（VB3）、泛酸钙（VB5）和吡哆醇（VB6）、肌醇都能改善所培养植物组织的

29、生长状况。维生素大多溶于水。而叶酸需先用少量稀碱水溶解，然后加水定容。 >有时还用一些营养成分不明的混合物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、酵母浸出液（YE）（2）碳源不但起碳源作用，也起能源作用，还起渗透压稳定剂的作用。可用葡萄糖、果糖、蔗糖等，此外，还有山梨醇、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、淀粉。最常用的是蔗糖，浓度为25%。在诱导花药愈伤组织时，所用蔗糖浓度可适当提高。 >3、植物生长物质（1）生长素在植物离体培养中，生长素类一般用于诱导不定根的形成，也用于诱导愈伤组织的形成，但更用于与细胞分裂素适量配合，共同诱导不定芽的形成，促进侧芽的生长，诱导某些植物胚状体的形成。

30、由于吲哚乙酸（IAA）等天然激素易受体内酶的分解，而且易受外界光的氧化，以及高温等的破坏，因此在植物离体培养基中，常用人工合成的类似物替代。这类类似物主要有：吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。其作用活性由强到弱的顺序如下：2，4-DNAAIBAIAA。一般在相同用量时，如果以IAA的相对活性为1，那么NAA约为34，而2，4-D则约为1020。IBA和NAA广泛用于诱导生根，并与细胞分裂素一起使用能互作促进茎芽的增殖；2，4-D有抑制不定芽形成的副作用，适宜的用量范围较窄，过量使用常有毒害。一般用于启动离体培养植物体细胞脱分化、愈伤组织的诱导和生长，而诱

31、导分化阶段往往不用2，4-D，多用NAA、IBA或IAA等。一般生长素的使用浓度为0.055.0 mg/L；常配成1 mg/mL的贮备液存于冰箱中备用。（2）细胞分裂素在植物离体培养中，细胞分裂素类主要用于促进细胞分裂与增大，使茎增粗，而抑制茎伸长；一般在细胞分裂素与生长素比值较高时，诱导不定芽的分化，促进侧芽的分化。 常用的细胞分裂素类植物生长物质有：6-苄基腺嘌呤（6-苯甲基氨基嘌呤，6-BA，BA）、糠基腺嘌呤（呋喃甲基氨基嘌呤，激动素，KT，K）、2-异戊烯基腺嘌呤（2ip）、玉米素（ZT）、噻重氮苯基脲（TDZ)等。一般细胞分裂素的使用浓度为0.055.0 mg/L；常配成1 mg/

32、mL的贮备液存于冰箱中备用。（3）赤霉素赤霉素类植物生长物质（GA）主要用于：促进幼苗茎的伸长生长，破除种子、块茎、鳞茎等的休眠，使之提前萌发。在组织培养中所用的是GA3。GA3被用于促进植株节间伸长、刺激在培养中形成的体细胞胚正常发育成植株等。 >GA不耐热，在高压灭菌后约有70100%失效。因此，应采用过滤除菌法加入培养基。GA3在水中不稳定，因此要用95%乙醇配制贮备液。常配成1mg/mL的贮备液存于冰箱中备用。 4、其它成分（1）活性炭在培养基中添加活性炭可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化，对形态发生和器官形成有良好效应。一般认为，活性炭主要吸附非极性物质及色素等大分子

33、，可以减少一些有害物质的影响，但是其吸附的选择性很差。温度低时吸附力增强，温度高时吸附力减弱，甚至会解吸附。 >通常使用浓度为0.510 g/L。加入活性炭后使培养基变黑，对一些植物诱导生根有利。大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力，因此需要多加一些琼脂。很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶，以使其均匀分布于培养基中。 >（2）硝酸银硝酸银在某些植物组织培养中，主要被用于：促进愈伤组织器官发生或体细胞胚发生、克服试管苗玻璃化及早衰和落叶等。硝酸银的用量一般为110 mg/L；灭菌方法为过滤除菌。注意：不要将培养物过长时间（长于原基形成所需时间）培养在含硝

34、酸银的培养基上。否则，其会导致再生植株畸形。 >（3）抗生素加入抗生素的主要目的是：防止菌类污染，抑制菌类生长。抗生素可一种单独使用，也可两种混合使用。但是，抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，并且不同植物组织对不同抗生素的敏感程度不一。常用的抗生素有：青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素等；用量一般为520 mg/L；大部分抗生素要求过滤灭菌。 >5、琼脂及其它固化剂琼脂是一种由海藻得来的多糖类物质，40 凝固；一般使用浓度0.7%1%。 一般来说，在pH值高于6.5时，琼脂固化培养基会变硬；在pH值低于5时，琼脂固化培养基不能很好地凝固。 此外，其它固化剂

35、还有：Gelrite 和Agarose （琼脂糖）等。 >6、pH常用0.1 N氢氧化钾（或0.1 N氢氧化钠）和0.1 N盐酸加以调整。一般将培养基的pH值调整到5.8左右。调好pH值的培养基，经过高压灭菌之后，常会使pH值下降0.20.3，同时使培养基渗透压上升一些。 >（三）培养基的研制1、试验设计一般方法通常，培养基研制的一般试验方法：（1）预备性试验一般预备性试验规模比较小，条件要求等不必面面俱到。 在某些因素作用不明的情况下，可多做一些预备性试验，这样能加快试验研究进展。 >（2）单因素试验 在单因素试验中，其它各个因素都基本确定，并维持在一定水平上，只变动一个因

36、素，以研究这一因素有无影响以及影响程度。 （3）双因素试验在试验中含有两个影响因素的叫双因素试验。其常用于研究生长素与细胞分裂素的浓度配比。在因素水平较少的情况下，进行双因素多水平组合，可以较快地筛选出一组最佳浓度组合。（4）多因素实验在试验中含有两个以上因素者为多因素试验。在试验中，可以同时研究多种因素不同水平对试验结果的影响。例如：在研究培养基中细胞分裂素、生长素、糖和其它成分的合适加用量时，即需采用多因素试验设计，这样可收到事半功倍的效果。多因素试验，一般应用正交实验来具体设计各试验因素各处理水平的安排。（5）逐步添加或逐步排除试验逐步添加是为了使试验取得更多结果；而逐步排除是为了缩小范

37、围，更快找到最有影响的因子，或是为了降低生产成本或利于推广，尽力使培养基简化。例如：在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分；而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步排除一些成分。2、试验设计具体方案（1）在建立一个新的离体培养体系时，为了能较快地研制出一种合适的培养基，最好先以一种已被广泛采用的基本培养基（例如：MS）为基础，以文献中相关研究结果为参考，进行试验设计。进行试验设计，必须遵循两个基本原则： 重复基本试验（样本含量） 随机化配置试材（均一性）（2）在试验设计时，一般最先考虑的是植物植物生长物质，尤其是生长素，或（和）细胞分裂素（试验因素）

38、。对于一个或两个试验因素的研究，可采用完全试验方案。完全试验方案具均衡完全的特点，各个因素的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合。例如：研究NAA和BA的最佳浓度组合，每个因素各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10 mmolL)，这两个因素的各种浓度的所有的组合，就构成了一个具有25个处理的完全试验方案。然而，在完全试验方案中，试验因素越多，处理数越多，试验就越复杂，消耗的精力、物力等就越多。 对于两个以上试验因素的研究，一般采用正交设计方案。采用正交设计试验，可以通过较少的试验处理数量，获得较多的试验结果信息。采用正交设计试验，一般需借助于正交表。例如：采用正交设计表L9（3

39、4）可安排3个因素各3个水平的试验，进行9个不同搭配的试验，但其结果实际上相当于进行了完全试验的27个处理的试验。*正交表正交表是一套规则的设计表格，L为正交表代号；n为试验次数（处理组合数）；t为水平数；c为列数，即最多可能安排的因素个数。一般式表示为： Ln（tc）。例如：L9（34）表示：最多可观测4个因素，每个因素均为3个水平，设置9个试验处理组合。一个正交表中也可以各列的水平数不相等，其被称为混合型正交表，如L8（4×24），在此表的5列中，有1列为4个水平，4列为2个水平。正交表具有以下两项性质： （1）每一列中，不同的数字出现的次数相等。例如：在两水平正交表中，任何一列

40、都有数码“1”与“2”，且任何一列中它们出现的次数是相等的；例如：在三水平正交表中，任何一列都有“1”、“2”、“3”，且在任一列的出现数均相等。 >（2）任意两列中数字的排列方式齐全而且均衡。例如：在两水平正交表中，任何两列（同一横行内）有序对子共有4种：1，1；1，2；2，1；2，2；每种对数出现次数相等。在三水平情况下，任何两列（同一横行内）有序对共有9种：1，1；1，2；1，3；2，1；2，2；2，3；3，1；3，2；3，3；且每对出现数也均相等。以上两点充分地体现了正交表的两大优越性，即： 均匀分散性； 整齐可比性。通俗地说，每个因素的每个水平与另一个因素各水平各碰一次，这就是

41、正交性。 交互作用表：一般每张正交表后都附有相应的交互作用表，它专门用来安排交互作用试验。 >（3）在试验设计中，必须考虑同时设置试验处理组与对照组（试验水平）。而试验处理组与对照组中的试验个体（试材）在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，须尽可能地完全一致，以使试验处理结果的差异仅来源于试验因素。 >（4）试验处理组与对照组中的试验个体须达一定数量（样本含量），即试验设计都要设有一定数量的重复，以取得可靠的可供生物统计分析的试验结果。一般地随试验规模和要求不同而异，大多每个处理10个培养容器，每个容器至少3个外植体。（5）确定可供对试验结果进行全面正确评价的观测指标；并应尽量选择

42、非百分率型的观测指标。（6）确定进行连续动态观测的合适观测方法以及合适间隔时间。 >（四）培养基的制备1、贮备液的配制与保存为简便起见，将培养基配方中的药品一次称量以供一段时间使用，即配制一些浓溶液，用时只需稀释即可。这种浓溶液就是贮备液。贮备液要根据药剂的化学性质分别配制，一般配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物质等。在配制大量元素无机盐贮备液时，要防止在混合各种盐类时产生沉淀；在配制微量元素贮备液时，也要注意药品的添加顺序，以免产生沉淀。一般大量元素的贮备液比使用液浓度高1020倍；微量元素等的贮备液比使用液浓度高100200倍。铁盐容易发生沉淀，需要单独配制。贮备液的浓度过高，以及

43、不恰当混合，会引起沉淀，影响使用效果。 以MS培养基为例，配制贮备液如下：一般按照上述表格所列各种试剂顺序，依次称量，分别溶解在少量蒸馏水中，然后依次加在一起，最后定容至规定的体积，得到贮备液（母液）I、II、III和IV。在配制贮备液III（铁盐）时，按量称取两种试剂，分别置于近半量的蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解，然后将两种溶液混合，调整pH至5.8，最后加蒸馏水定容至终体积，将其贮存于棕色玻璃试剂瓶中。 >以MS培养基为例，配制贮备液如下：植物生长物质大多不溶于或难溶于水。IAA、NAA、IBA、2,4-D等生长素类和GA3,需要先用少量95%乙醇助溶，然后再用蒸馏水定容至所需要

44、的体积；KT、BA等细胞分裂素类则可用少量1 mol/L的HCl加热溶解，然后再用蒸馏水定容至所需要的体积。 >以MS培养基为例，配制贮备液如下：各种植物生长物质的贮备液应分别配制。其贮备液浓度可为1 mmol/L，或1 mg/mL。配制好的贮备液应分别贴上标签，注明贮备液种类、倍数、配制日期，并在记录本上详细记载配制及称取量，以便工作准确及日后检查。所有贮备液应置冰箱4 保存。在取用贮备液时，应先轻轻摇动贮备液试剂瓶，检查有无沉淀悬浮物或微生物污染，一经发现，立即将其淘汰，重新配制。2、培养基的配制（1）称取规定数量的琼脂和蔗糖，加蒸馏水直到培养基最终体积的3/4，在恒温水浴中或其它加

45、热设备上加热使之溶解，注意适时搅拌，以免沸腾溢出或者烧焦结底。但在配制液体培养基时则无须加热，因为蔗糖甚至在微温水中也能溶解。（2）分别加入一定量的各种贮备液，包括植物生长物质和其它特殊补加物。 >（3）加水至培养基最终体积。（4）充分混合之后，用0.1 N氢氧化钾（或氢氧化钠）和（或）0.1 N盐酸调节培养基的pH至所需值，一般为5.8（借助pH计或者精密pH试纸）。（5）将培养基分装到所选用的培养容器中，最多不要超过其最大容量的1/3（例如：150 mL的培养瓶，最多装入50 mL培养基）。>在分装时，注意不要将培养基粘附到培养瓶口或瓶口接近的内壁上，以免日后引起污染。（6）以

46、棉塞（它可以阻止微生物污染，也允许培养容器内外气体自由交换）或其它合适的塞或盖等封严瓶口，或外加包头纸（牛皮纸或铝箔等）或包扎其它覆盖物。（7）在121 （1.06 kg/cm2）高压灭菌20 min。 （8）待灭菌完成后，将分装有培养基的培养容器从高压灭菌装置中取出，使其在室温下冷却，暂置合适柜架，以待接种。如果由于特殊原因必须在培养基高压灭菌之后再加入不耐热的生长素等，那么应先调好这些生长素等的pH，经微孔（0.22或0.45m）过滤灭菌后，再在超净台上将其加入温度适宜、尚未开始凝固的培养基中，摇动混匀，冷却备用。 为此，每个培养容器中培养基的分装量应该精确相同，以使每个容器中培养基所含经

47、过滤灭菌药品溶液的量准确可比。配制好灭过菌的培养基一般应尽快用完，最好不要超过10 d。 >四、一般技术与常见问题及其对策（一）外植体的选择1、选择优良的基因型；2、选择适当的部位植物组织培养的外植体材料，可包括植物体的各个部位，如茎尖、节间、鳞茎、叶、子叶、根、花瓣、花药和胚珠等。（1）茎尖：茎尖不仅生长速度快，繁殖率高，不容易发生变异，而且茎尖培养是获得脱毒苗的有效途径。（2）节间：新梢节间部位不仅灭菌容易，而且脱分化和再分化能力较强 。 （3）叶 和叶柄：叶片和叶柄取材容易，新出的叶片杂菌较少 。 （4）鳞片： 水仙、百合、葱、蒜、风信子等鳞茎类植物常以鳞片为材料。 （5）其它：种

48、子、根、块茎、块根、花粉等也可以作为植物组织培养的材料。 3、选取适当的大小 在微繁时，一般叶片、花瓣等外植体，以面积5 mm见方 为宜，其它培养材料的大小常取510 mm 。 如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。 材料太大，材料太老，灭菌不易彻底，污染率高； 材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。4、选择适当的时期对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样。 此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。5、外植体来源要丰富、易得；6、外植体要易于灭菌选择带杂菌少的幼嫩器官或组织，以降低初代培养的污染率。（二）外植体的灭菌在材料接种培养前，必须要进行灭

49、菌处理。灭菌：一方面要求将材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤，或只轻微损伤组织材料，而不影响其生长。1、 常用的灭菌剂 理想的灭菌剂：应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其它生物无害，来源广泛，价格低廉。（1）酒精：以70%75%酒精，灭菌效果最好。（2）升汞：又称氯化汞。 2、 灭菌方法（外植体类型） （1）茎尖、茎段及叶片等的灭菌灭菌时先用70%酒精浸泡1030 s，以无菌水冲洗23次，然后按材料的老、嫩，和枝条的坚实程度，分别采用2%次氯酸钠浸泡1015 min，或用0.1%升汞浸泡510 min。（2）果实及种子的灭菌先用自来水冲洗1020 m

50、in，再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠浸10 min，后用无菌水冲洗23次；种子则先用10%次氯酸钠浸泡2030 min，难以灭菌的可用0.1%升汞灭菌510 min。对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡810 min。 （3）花药的灭菌 将整个花蕾或幼穗用70% 酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗23 次， 再在漂白粉中浸泡10 min ，最后用无菌水冲洗23 次。 >（4）根及地下部器官的灭菌 先用自来水冲洗、软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位， 再用酒精漂洗后，置于0.1% 升汞中浸510 min ， 或2% 次氯酸钠中浸1015 min ， 最后用

51、无菌水冲洗3 次。2、 灭菌方法（分类及原则） （1）方法分类 物理方法干热（烘箱烘烤，或火焰灼烧）；湿热（蒸煮，或高压蒸煮）；过滤（抽滤，或注射过滤）；辐射处理（紫外线等）；微波处理（微波炉等）等。 化学方法灭菌剂（乙醇、升汞HgCl2、次氯酸钠、次氯酸钙等溶液）浸泡；高锰酸钾熏蒸等。 （2）一般原则 培养基用湿热灭菌（121，20min）； 无菌水、栽培基质、纱布棉花、工作服等用湿热灭菌（121 ，或20 min）； 不耐热物质（例如IAA、GA3等）用过滤除菌（滤膜孔径0.45或0.22m）； 耐热用具用干热灭菌（烘箱160180 ，90 min）； 注射过滤器具等耐热塑料制品先用高压蒸

52、煮湿热灭菌，再用70%乙醇灭菌剂浸泡灭菌； 接种用具先用高压蒸煮湿热灭菌，再用95%乙醇浸泡火焰灼烧干热灭菌； 缓冲间和接种室用高锰酸钾熏蒸、紫外灯照射灭菌；由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2 m为宜。 超净台用紫外灯照射工作空间及用70%乙醇灭菌剂喷、擦工作台面灭菌。（三）外植体的接种1、无菌操作规程无菌操作质量的高低决定了组织培养的成败。组培的工序中无菌操作的环节很多，材料切割、茎尖剥离、材料转接、封口等各个环节均要求规范、准确、迅速，任何一步做不好，就会导致失败。2、材料的分离、切割和接种较大的材料，肉眼观察即可操作分离；较小的

53、材料，需要在解剖镜下放大操作。分离工具要锋利，切割动作要快，培养材料在培养容器内的分布要均匀，以保证必要的营养面积和光照条件。将茎段基部插入固体培养基中，将茎尖下端置于培养基表面，将叶片叶背接触培养基。接完，标记：材料、处理、接种日期等。 （四）污染及其对策污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。常见的污染病原主要是细菌和真菌两大类：细菌污染常在接种12 d后表现，培养基表面出现黏液状菌斑；真菌污染一般在接种3 d以后才表现，主要症状是培养基上出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色的孢子层。1、污染原因造成污染的原因也很多，主要有： 培养基

54、及各种使用器具灭菌不彻底； 外植体灭菌不彻底； 接种时未严格无菌操作； 接种和培养环境不清洁； 培养容器破损。2、污染的对策（1）灭菌要彻底在组培生产中，各种培养基，以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。 （2）选择适当的外植体要认真地选择外植体，减少外植体上的带菌量。 （3）外植体灭菌对于外生菌：可以通过表面灭菌方法杀灭；对于内生菌：首先将欲取材的植株或枝条放在温室或无菌培养室内预培养，再在培养液中添加一些抗生素或灭菌剂。（4）环境灭菌对接种室和培养室，可采用紫外灯照射灭菌，或喷灭菌剂灭菌。 （5）严格无菌操作（五）褐变及其对策褐变，是指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，

55、致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。1 、褐变的原因 当外植体切割后，切口附近细胞的分割效应被打破，酚类化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌类化合物，醌类化合物又会在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其它酶系统失活，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡。 >2、影响褐变的因素（1）植物基因型一般木本植物的酚类化合物含量，比草本植物高，更易发生褐变现象。 （2）外植体的生理状态一般外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变。切口越大，酚类物质的被氧化面也越大，褐变程度就会更严重。（3）取材时间和部位冬、春季取材，褐变死亡率

56、最低；夏季取材，很容易褐变。在取材部位上，幼嫩茎尖，比其它部位褐变程度低。（4）培养基在初代培养中，培养基中无机盐浓度过高，易引起酚类物质大量产生，导致褐变。BA和KT，不仅促进酚类化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐变；而生长素类，例如：NAA和2,4-D可延缓多酚合成，减轻褐变。（5）光照将接种后的初代培养材料，在黑暗条件下培养，对抑制褐变发生有一定效果。（6）温度高温能促进酚氧化，培养温度越高，褐变越严重；而低温可抑制酚类化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。（7）培养时间 材料培养时间过长，易引起褐变物的积累，加重对培养材料的伤害。 >3、褐变的对策（1）选择适当的外植体选择适当的外植体，是克服褐变的重要手段。避免在夏季高温季节取材；选择幼苗、褐变程度轻的品种和部位，作为外植体。 （2）外植体预处理先用流水冲洗外植体，然后置于5 左右的冰箱中，低温处理1214 h。 （3）筛选合适的培养