第六章 分子发光分析法

1、T T1 1S S0 0ISCISCVRVRVRVRICICS S0 0S S1 1S S2 2VRVR第六章第六章 分子发光分析法分子发光分析法第六章第六章 分子发光分析法分子发光分析法 分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理 介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被测物质之间的关系荧光强度与被测物质之间的关系 荧光分析仪器荧光分析仪器 分子荧光定量分析分子荧光定量分析 简介化学发光简介化学发光 6-1 6-1 概述概述一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类 某些物质的某些物质的分子分子吸收一定能量后，电子从

2、基态跃吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以迁到激发态，以光辐射光辐射的形式从激发态回到基态，的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。分析方法为分子发光分析法。较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量受激量受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：为以下几类： 光致发光：以光致发光：以光源光源来激发而发光来激发而发光 电致发光：以电致发光：

3、以电能电能来激发而发光来激发而发光原子发射光谱法原子发射光谱法 生物发光：以生物发光：以生物体释放的能量生物体释放的能量激发而发光激发而发光 化学发光：以化学发光：以化学反应能化学反应能激发而发光激发而发光化学发光分析化学发光分析法法荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法二、分子荧光分析法的特点二、分子荧光分析法的特点1. 1. 灵敏度高灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度）强度，可提高荧光强度） 采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度

4、法低度，检测限荧光分析法比分光光度法低2-42-4个数个数量级量级激发激发发射荧光发射荧光强强强强2. 2. 选择性好选择性好 不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长光波长 不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长波长 比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3. 3. 实验方法简单实验方法简单4. 4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广 具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，具发光强度可定量测定

5、许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法6-2 6-2 荧光和磷光光谱法荧光和磷光光谱法一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁价电子跃迁产生荧光和磷光产生荧光和磷光 基态分子基态分子 价电子跃迁到激发态价电子跃迁到激发态光照激发光照激发去激发光去激发光 * * * *n n 、n n1. 1. 电子自旋状态的

6、多重性电子自旋状态的多重性 大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的中两个电子自旋方向总是相反的 ，处于基态，处于基态单重态。用单重态。用 “ “S S0 0” ” 表示表示 ；当物质受光照射时，；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净净自旋自旋=0=0。这种跃迁是符合光谱选律的。这种跃迁是符合光谱选律的。 基态单重态 第一激发单重态 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为单

7、重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为1010-8-8S S 若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态由基态单重态激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋 0 0。这种跃迁。这种跃迁为禁阻跃迁。为禁阻跃迁。 T T1 1、T T2 2、T T3 3分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态 基态单重态基态单重态 第一激发三重态第一激发三重态 自旋平行自旋平行三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为1010-4-4-1S-1S 分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不

8、稳分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激去激和辐射去激2. 2. 无辐射去激无辐射去激不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括：系内的多余的能量以热的形式释放。包括： 内部转换（内部转换（ICIC） 相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换 S-SS-S 系间窜跃（系间窜跃（ISCISC）不同的多重态之间的转换不同的多重态之间的转换 S-T S-T 振动驰豫（振动驰豫（VRVR） 同一电子能级

9、中，从较高振动能级到较同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程低振动能级的过程 外部转移外部转移指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭 发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，S S1 1TT1 1间进行，比内部转换困难间进行，比内部转换困难 T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光S0S1S2VRVR： 振动驰豫振动驰豫ICIC： 内部转换内部转换ISCISC：系间窜跃：系间窜跃3. 3. 荧光和磷光光谱的产生荧光和磷光光谱的产生辐射去激辐射去激 处

10、于处于S S1 1或或T T1 1态的电子返回态的电子返回S S0 0态时，伴随有发光现象，这种态时，伴随有发光现象，这种过程叫辐射去激过程叫辐射去激 S S1 1或或T T1 1 S S0 0 发光发光T T1 1S S0 0ISCISCVRVRVRVRICIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 图图6-1 6-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图S S0 0S S1 1S S2 2VRVR：振动驰豫：振动驰豫ICIC：内部转换：内部转换ISCISC：系间窜跃：系间窜跃（2 2）磷光）磷光当当受激电子降到受激电子降到S S1 1的最低振动能级后，未发射荧光，而是的最低振动能级后

11、，未发射荧光，而是经过系间窜跃到经过系间窜跃到T T1 1振动能级，经振动驰豫到振动能级，经振动驰豫到 T T1 1最低振动能最低振动能级，从级，从T T1 1最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光光叫磷光 从从T T1 1 S S1 1要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为1010-4-4-10s-10s，光照停止后，磷光仍可持续一段时间光照停止后，磷光仍可持续一段时间 分子相互碰撞的无辐射能量损耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量损耗大，所以磷光的波长更长 磷磷 荧荧 激激 * * 易产生荧光易产生

12、荧光 n n * * 易产生磷光易产生磷光T T1 1S S0 0ISCISCVRVRVRVRICIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光 图图6-1 6-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S S0 0S S1 1S S2 2VRVR：振动驰豫：振动驰豫ICIC：内部转换：内部转换ISCISC：系间窜跃：系间窜跃VRVR二、荧光、磷光与分子结构的关系二、荧光、磷光与分子结构的关系 了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有

13、什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体弱荧光体变成强荧光体（一）荧光效率（一）荧光效率 荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率f f 来描述来描述 荧光量子效率荧光量子效率 f f = =发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数 若以各种跃迁速率常数来表示若以各种跃迁速率常数来表示 K Kf f 为荧光发射过程的速率常数为荧光发射过程的速率常数取决于物质的取决于物质的化学结构化学结构 KKi i

14、为非辐射跃迁的速率常数之和为非辐射跃迁的速率常数之和主要取决主要取决于化学环境，也与化学结构有关于化学环境，也与化学结构有关 分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在0.1-10.1-1之间之间ifffKKK 至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系述荧光与分子结构之间的关系 一般情况，一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物是是最强最有用的荧光体最强最有用的荧光体（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系 物质只有吸

15、收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生 * *n n * *跃迁，产生荧光跃迁，产生荧光 * *与与n n * *跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大10102 2-10-103 3，寿命短寿命短 * *跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光， n n * *跃迁产跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光1. 1. 共轭体系共轭体系有较强的荧光有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭电子共轭程度越大，越易产生荧光程度越大，越易产生荧光; ; 环越多，共轭程度越环越多

16、，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强 0.11 205 278 0.11 205 2780.29 286 3100.29 286 3100.46 365 4000.46 365 400苯苯萘萘蒽蒽 350350菲菲线状环结构比非线状结构的荧光波长长线状环结构比非线状结构的荧光波长长 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光多数能发生荧光 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定法测定 3 3，4 - 4 - 苯并苯并芘是强致癌物芘是强致癌物2. 2. 刚性

17、平面结构刚性平面结构较稳定的平面结构较稳定的平面结构 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构ocoo-oo-coo-oo-荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两个环固定在一个平个环固定在一个平面上，具有平面结面上，具有平面结构，强荧光物质构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质例例 1，2 - 二苯乙烯反式：平面构型 强荧光体顺式：非平面构型 非荧光体C=CHHC=CHH（三）金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物

18、都能产生很强的荧光，可用于痕量金属些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定离子的测定 不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与或不发荧光，但与M Mn+n+形形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光生荧光 例：例：8-8-羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与M Mn+n+ Al Al3+3+、MgMg2+2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强NOHNOHM（四）取代基的类型 取代基对荧光物质的荧光特征和强度也取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三

19、类：有很大影响。分成三类：（1 1）增强荧光的取代基）增强荧光的取代基 有有 -OH-OH、-OR-OR、 -NH-NH2 2、-NHR-NHR、-NR-NR2 2等给电子基团等给电子基团 由于基团的由于基团的 n n 电子（孤对电子）的电子云与苯环电子（孤对电子）的电子云与苯环上的上的 轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了共轭 电子，扩大了电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强（2 2）减弱荧光的取代基）减弱荧光的取代基 -COOH -COOH 、 -NO-NO2 2 、-COOR -COOR 、-NO-NO、-SH -SH 吸电子基团吸电子

20、基团, , 使荧光波长短移，荧光强度减弱使荧光波长短移，荧光强度减弱 芳环上被芳环上被F F、ClCl、BrBr、I I 取代后，使系间窜跃加强，磷光取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。磷光相应增强，这种效应为重原子效应。（3 3）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基 -NH-NH3 3+ +、-R-R、- SO- SO3 3H H等等三、环境对荧光、磷光的影响 1. 1. 溶剂的影响溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现

21、出不同的荧光性质不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大移，荧光强度增大 2. 2. 温度的影响温度的影响低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。度减弱。 温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大3. pH3. pH的影响的影响 大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧大多数含有酸性或碱性基

22、团的芳香族化合物的荧光性质受溶液光性质受溶液pHpH的影响很大的影响很大 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长有各自的荧光效率和荧光波长OHO_OHH+_例：例： 苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1pH1有有荧光荧光pH13pH13无荧光无荧光 但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光例：例： 苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光OHO_另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性四、荧光强度与荧光物质浓度的

23、关系 用强度为用强度为I I0 0的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度时，产生荧光，荧光强度I If f 用仪器测得，在荧光用仪器测得，在荧光浓度很稀浓度很稀 (A0.05)(A0.05)时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度I If f 与浓度有下面的关系与浓度有下面的关系 I If f = = f f I Ia a= = f f （I I0 0- I - I ）荧光池荧光强度检测器IIA0lg将上式展开! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320

24、AAAIIff 当当A A0.050.05时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化 I If f = 2.3 = 2.3 f f I I0 0A A =2.3 =2.3 f f I I0 0 bcbc当当A A0.050.05时，时， 荧光强度与物质浓度呈线形关系，荧光强度与物质浓度呈线形关系，I If f=KC=KC只只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高量或痕量组分，灵敏度高 浓度高时，浓度高时， I If f与与C C不呈线形关系，有时不呈线形关系，有时C C增增大，

25、大， I If f反而降低因为公式反而降低因为公式 中后面影响，中后面影响，有时发生荧光猝灭效应有时发生荧光猝灭效应 荧光猝灭荧光猝灭 荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率或荧光效率 f f 下降称为荧光猝灭。下降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭碰撞猝灭 M + M + 激激 M M* * M M* *

26、+ Q M + Q + + Q M + Q +热热 自熄灭自熄灭荧光物质发射的荧光被荧光物质的基荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象态分子所吸收，即自吸收现象（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器主要由光源、单色器、主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成液槽、检测器和显示器组成光源第一单色器液池检测器第二单色器检测器放大器及记录器与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个单色器两个单色器检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角五、荧光和磷光分析仪器1、光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长

27、范围宽发射强度；适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm250800nm很强的连续光源很强的连续光源2 2、单色器、单色器 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱分析，不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光

28、光谱又可获得荧光光谱 第一单色器作用第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长最佳激发波长 ex ex ，用此激发光激发液池内的荧，用此激发光激发液池内的荧光物质光物质 ex ex 第二单色器作用第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长的干扰光，用来选择测定用的荧光波长 em em。 在在选定的选定的 em em 下测定荧光强度，定量分析下测定荧光强度，定量分析3 3、样品池、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最

29、上边都透光，只能用手拿棱或最上边4 4、检测器、检测器 把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号, , 放大放大, , 直接转成荧光强直接转成荧光强度度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可强度可 大大提高荧光强度大大提高荧光强度5 5、读出装置、读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱记录仪记录或打印机打

30、印出结果，扫描激发光谱和发射光谱和发射光谱（二）激发光谱和荧光、磷光光谱 荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定据激发光谱确定激发光谱是在固定荧光波长下，激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱I I固定固定获得方法：先把第二单色器的波获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的长固定，使测定的I I I I固定固定获得方法：先把第一获得方法：先把第一单色器的波长固定，单色器的波长固定，使激发的使激发的 从图中看出从图中看出 磷磷 荧荧 激激图吸收峰荧光峰磷光峰（

31、三）磷光分析仪器 与荧光分析仪器相似，主要差异如下：与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1. 1. 试样室试样室 试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（77K77K，-196-196）下测定低温磷）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内） 固体表面室温磷光分析需特制试样室固体表面室温磷光分析需特制试样室2. 2. 磷光镜磷光镜 有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置切光装置磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。六、 荧光

32、、磷光分析及应用（一）定量分析方法（一）定量分析方法 定量分析依据定量分析依据 I If f = KC I = KC Ip p = KC = KC1. 1. 标准曲线法标准曲线法最常用的定量分析方法最常用的定量分析方法将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。系列标准液，测定它们的相对发光强度。以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标浓度浓度 C C1 1 C C2 2 C C3 3 C C4 4 C C5 5 Cx Cx荧光强度荧光强度 I If1

33、f1 I If2f2 I If3f3 I If4f4 I If5f5 I If fx xxCxC2. 荧光猝灭法 把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性 若荧光物质若荧光物质 M M 与猝灭剂与猝灭剂 Q Q 生成不发荧光的基态配合物生成不发荧光的基态配合物MQMQ M + Q = MQ M + Q = MQ（非荧光物（非荧光物质）质）经推导得出：经推导得出：)(1QCKIIf后前猝灭剂加入前的荧光强度猝灭剂加入后试液的荧光强度常数猝灭剂浓度)()()(QCMCMQCKf 与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分与标准曲线法相似，

34、对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂别加入一系列不同量的猝灭剂 Q Q ，配成一个荧，配成一个荧光物质光物质猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度，得一曲线们的荧光强度，得一曲线 取相同荧光物质取相同荧光物质 C CM M C CM M C CM M C CM M C CM M 加不同量加不同量Q CQ CQ0Q0 C CQ1 Q1 C CQ2 Q2 C CQ3 Q3 C CQx Qx (C(CQ0Q0 =0) =0) 测测 I If f I I前前 I I后后1 1 I I后后2 2 I I后后3 3 I I后后 x x 计算计算 I

35、I前前/I/I后后 I I前前/I/I后后1 1 I I前前/I/I后后2 2 I I前前/I/I后后3 3 I I前前/I/I后后x x 3. 比较法比较简单 如果试样数量不多，可用比较法进行测量如果试样数量不多，可用比较法进行测量 配一标准溶液浓度为配一标准溶液浓度为CsCs， CsCs与未知液浓度与未知液浓度CxCx相近，相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度并在相同条件下测定它们的荧光强度 未知液未知液 I If f x x = KCx = KCx 标准液标准液 I If f s s = KCs = KCs 比较CsCxIIfsfx00ffsffxfsfxIIIICsIICsCx荧光强

36、度减去空白后若有试剂空白，测得的4. 多组分混合物的荧光分析(1) (1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰如果两组分的荧光峰相互不干扰, ,可直接可直接测定测定 可分别在各自的可分别在各自的 荧荧波长处测定波长处测定, ,求出它们的求出它们的含量含量(2) (2) 如果两组分的荧光峰相互干扰如果两组分的荧光峰相互干扰, ,但激发光但激发光谱有显著区别谱有显著区别, ,在某一激发光下一个组分产在某一激发光下一个组分产生荧光峰生荧光峰, ,另一组分不产生荧光另一组分不产生荧光; ; 可选用不同的激发光进行测定可选用不同的激发光进行测定AlAl3+3+8-8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液羟基喹啉配合物的氯

37、仿溶液 ex ex =365nm =365nm emem=520nm=520nmGaGa3+3+8-8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液羟基喹啉配合物的氯仿溶液 ex ex =436nm =436nm emem=520nm=520nm 365nm 365nm激发光，激发光， AlAl3+3+的配合物产生荧光，而的配合物产生荧光，而GaGa3+3+配配合物不产生荧光，无荧光峰；合物不产生荧光，无荧光峰； 436nm436nm激发光，激发光， GaGa3+3+ 的配合物产生荧光，而的配合物产生荧光，而AlAl3+3+配配合物不产生荧光，无荧光峰合物不产生荧光，无荧光峰 在在365nm365nm条件下激发，

38、条件下激发，520nm520nm处测处测AlAl3+3+8-8-羟基喹啉羟基喹啉配合物，在配合物，在436nm436nm条件下激发，条件下激发，520nm520nm处测处测GaGa3+3+8-8-羟基喹啉配合物羟基喹啉配合物例：(3) 如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰 利用荧光强度的加和性（F=F1+F2+F3+），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解例：硫胺荧例：硫胺荧 C CT T ex ex =385nm =385nm emem=435nm=435nm 吡啶硫胺荧吡啶硫胺荧C CP P ex ex =410nm =410nm emem=480nm=480nm相互干扰荧光光谱重叠

39、 在在385385或或410nm410nm下激发，在下激发，在435435和和480nm480nm下分别测荧下分别测荧光强度光强度硫胺素浓度吡啶硫胺素浓度 =KCK: 纯物质在选定波长下测,求K（二）荧光分析法的应用 荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1. 1. 无机化合物的分析无机化合物的分析 无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达后，进行荧光分析的元素达7070多种，其中较常采用多种，其中

40、较常采用荧光法测定的元素有：荧光法测定的元素有：BeBe、AlAl、B B、GaGa、SeSe、MgMg、ZnZn、CdCd及某些稀土元素及某些稀土元素2. 2. 有机化合物的分析有机化合物的分析 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析剂反应后才能进行荧光分析 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃于具有致癌活性的多环芳烃荧光分析荧光分析

41、法是最主要的测定方法法是最主要的测定方法 为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定合物与适当试剂反应之后进行测定 可测定结构复杂的大量有机物质，如：各可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等和辅酶以及各种药物、毒物和农药等例：3，4 苯并芘 3 3，4 4 苯并芘为强致癌物质苯并芘为强致癌物质例： VB2 又称核黄素，是一种生又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花脏、肉类、蛋黄、豆

42、类、花生、蘑菇和海藻中，生、蘑菇和海藻中， VBVB2 2易易溶于强酸或强碱性溶液。溶于强酸或强碱性溶液。 在低浓度情况下，在低浓度情况下，I= KCI= KC，I I与与C C呈线性关系，在呈线性关系，在pH67pH67荧光最强荧光最强 在在430440nm430440nm蓝光照射下，蓝光照射下，发出绿色荧光，发出绿色荧光， em = em = 535 nm535 nm下测下测 I I ，用标准曲，用标准曲线法测定线法测定CHHOHOHONNNNHCHCHCH OHCH22OOH CH C33缺VB2会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎维生素维生素B B2 2（三）磷光分析法应用 能产生磷光的

43、物质数量很少，磷光分析不能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。用。 低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含苯并芘等多环芳烃及含O O、S S、N N的杂环化合的杂环化合物分析物分析 固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。6-3 6-3 化学发光分析法化学发光分析法一、概述一、概述 化学发光是利

44、用化学反应所产生的光辐射化学发光是利用化学反应所产生的光辐射现象所建立的分析方法现象所建立的分析方法 化学发光与荧光的主要区别：受激发时所化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的需的能量来源能量来源不同，需要化学反应过程中不同，需要化学反应过程中所提供的化学能所提供的化学能化学发光分析具有以下特点 灵敏度高灵敏度高例：用荧光素酶和三磷酸腺苷例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至的化学发光反应，可测定低至210-17 molL-1 ATP 线性范围宽线性范围宽一般有一般有56个数量级个数量级 仪器设备简单，成本低廉仪器设备简单，成本低廉 分析速度快，易实现自动化分析速度快，易

45、实现自动化 局限性：可供发光用的试剂有限局限性：可供发光用的试剂有限 发光机理有待进一步研究发光机理有待进一步研究二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件（一）化学发光反应的基本条件 发光反应必须满足以下条件发光反应必须满足以下条件1. 化学反应必须产生足够的化学能化学反应必须产生足够的化学能 化学发光基于化学反应提供足够的能量化学发光基于化学反应提供足够的能量 A + B C* +D 产物接受反应能被激发产物接受反应能被激发 C* C + h 在可见光区观察化学发光，需在可见光区观察化学发光，需170300kJmol-1激发能。具有激发能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应过氧

46、化物中间产物的氧化还原反应可满足要求。化学反应多是在有可满足要求。化学反应多是在有O3、H2O2等参加等参加的高能反应中的高能反应中2. 处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态（二）化学发光效率和发光强度 化学发光效率化学发光效率 CL激发态分子数发射的光子数参加反应的分子数激发态分子数参加反应的分子数发射的光子数frCL激发态分子的化学效率激发态分子的发光效率取决于发光所依据的化学反应本身取决于发光所依据的化学反应本身化学发光强度 具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发光。如：萤火虫发光反应的效率几乎

47、接近光。如：萤火虫发光反应的效率几乎接近100%。非生物体的化学发光效率一般不超过非生物体的化学发光效率一般不超过1% 化学发光强度化学发光强度 ICL（t）与反应速度、化学发光效）与反应速度、化学发光效率有如下关系率有如下关系dtdctICLCL)(对下列化学发光反应对下列化学发光反应 A +B C* +D C + h A + B C* +D A为待测物质，为待测物质，C为发光物质，当反应物为发光物质，当反应物B的浓度的浓度远远过量于待测物浓度时，远远过量于待测物浓度时，B的浓度可认为是常的浓度可认为是常数。因此，发光反应可视为一级反应数。因此，发光反应可视为一级反应Ackdtdc1nt 时

48、刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比n化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用发光总强度来定量分析发光总强度来定量分析ACLCLCLcdtdtdcdtIS发光总强度ACLCLCLckdtdctI1)(三、化学发光反应的类型1. 液相化学发光液相化学发光研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（Luminol）光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。 鲁米诺是最常用的发光试剂鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定，它可以测定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和和NO2，产生化学发光，产生化学发光反应时量子效率为反应时量子效率为0.010.05 鲁米诺（鲁米诺（3 氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为等氧化剂反应生成最大波长为425 nm的光的光辐射辐射NHNHOONH22NHCOOCOO*OH-COOCOONH2+hv氧化剂氧化剂425 nm 反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光 可检测低至可检测低至10-9 molL-1 的的H2O2 鲁米诺