毕业论文纳米硫化铅对雄性大鼠肝肾组织氧化损伤功能

1、学学 号：号：200895110131HEBEI UNITED UNIVERSITY毕毕 业业 论论文文GRADUATE THESIS设计题目：设计题目：纳米硫化铅对雄性大鼠肝肾组织氧化损伤功能纳米硫化铅对雄性大鼠肝肾组织氧化损伤功能 的影响的影响学生姓名：朱玉鹏学生姓名：朱玉鹏专业班级：专业班级：08 预防预防 1 班班学学 院：公共卫生学院院：公共卫生学院指导教师：曹燕花指导教师：曹燕花 讲师讲师2013 年年 06 月月 01 日日河北理工大学信息学院-摘 要目的：通过建立纳米硫化铅染毒模型，探讨PbS NPs对大鼠肝肾组织氧化损伤功能的影响，为深入阐明PbS NPs对肝肾的毒性机制，寻

2、找有效干预措施提供依据。方法：SPF级雄性大鼠50只，随机分为对照组（超纯水）；低剂量组（25mg/kg PbS NPs）、中剂量组（50mg/kg PbS NPs）、高剂量组（100mg/kg PbS NPs）；微米组（100mg/kg PbS），每组10只动物。每天灌胃染毒一次，每周五天，连续染毒6周后，进行各指标的测定：采用试剂盒测定肝肾组织抗氧化酶活力（SOD、GSH-Px、CAT）及MDA含量；采用H-E染色对肝肾组织进行病理形态学检测。结果：PbS NPs染毒组大鼠肝肾组织SOD、GSH-Px、CAT的活力较对照组明显下降（0.05），MDA含量较对照组上升（0.05）。相同剂量下

3、，PbS NPs组SOD、GSH-Px、CAT的活力均低于微米组，MDA含量高于微米组。结论：PbS NPs染毒可致大鼠肝肾组织发生氧化损伤，而不同粒径比较，PbS NPs作用甚于微米PbS。关键词 PbS NPs；SOD；CAT；MDA；氧化损伤Abstract-I-AbstractObjectives：To investigate the toxicity of oxidative damage induced by PbS NPs in rat liver and kidney by the establishment of PbS NPs exposure model, elucida

4、te the mechanisms the liver and kidney toxicity of PbS NPs, and to provide evidences for effective interventions.Methods：50 SPF grade male rats were randomly divided into control group (ultrapure water), low dose group (25mg/kg PbS NPs), middle dose group (50mg/kg PbS NPs), high-dose group (100mg/kg

5、 PbS NPs) and micron group (100mg/kg PbS), each group with 10 rats. Exposure by gavage once a day, five days a week, continued exposure for 6 weeks. The determination of liver and kidney tissues using antioxidant enzymes (SOD, GSH-Px, CAT) and MDA kits and using HE staining to test liver and kidney

6、tissues pathological changes.Results：The SOD, GSH-Px and CAT vigors in liver and kidney tissues of PbS NPs groups decreased significantly than the control group (P 0.05), but MDA contents increased significantly (P 0.05). Wiht same concentration, compared with the micron group, SOD, GSH-Px and CAT a

7、ctivities in PbS NPs groups were lower but MDA content were increased.Conclusions：PbS NPs exposure can cause oxidative damages in liver and kidney tissues of rats. Comparison of different sizes, the effects of PbS NPs stronger than micron PbS.Keywords PbS NPs; SOD; CAT; MDA; Oxidative damage 目 录-II-

8、目 录毕毕业业论论文文 .IGRADUATE THESIS.I设计题目：纳米硫化铅对雄性大鼠肝肾组织氧化损伤功能设计题目：纳米硫化铅对雄性大鼠肝肾组织氧化损伤功能.I的影响的影响.I学生姓名：学生姓名：朱玉鹏朱玉鹏.I2013 年年 06 月月 01 日日.I摘 要.IABSTRACT.II1 前 言.12 材料与方法.32.1 主要仪器.32.2 主要试剂.32.3 PBS NPS染毒模型的制作 .42.3.1 实验动物与分组.42.3.2 实验动物染毒.42.4 观察指标及检测方法.42.4.1 一般情况.42.4.2 肝系数、肾系数测定.42.4.3 肝肾组织铅含量测定.52.4.3.1

9、 样品前处理.52.4.3.2 微量元素含量的测定.52.4.4 血清中指标检测方法.52.4.5 组织中指标检测方法.52.5 病理学检测方法.52.5.1 病理标本采集方法.52.5.2 光镜切片的制备（HE 染色）.62.6 试剂盒操作方法.62.6.1 AST 含量的检测方法.62.6.2 ALT 含量的测定方法.72.6.3 Cr 含量的测定方法.72.6.4 BUN 含量的测定方法.92.6.5 SOD 活力的测定方法.92.6.6 GSH-Px 活力的测定方法.102.6.7 CAT 活力的测定方法.112.6.8 MDA 含量的测定方法.122.6.9 总蛋白含量测定.133

10、统计学处理.133 结果.14目 录-III-3.1 实验大鼠的一般情况.143.2 纳米铅暴露后对实验大鼠的肝系数、肾系数的影响.143.3 纳米铅暴露后对实验大鼠肝、肾组织中铅含量的影响.143.4 纳米铅暴露后对实验大鼠血清 AST、ALT、BUN 和 CR水平的影响.153.5 纳米铅暴露后对实验大鼠肝组织 SOD、GSH-PX、CAT 活力和 MDA 含量比较 .163.6 纳米铅暴露后对实验大鼠肾组织 SOD、GSH-PX、CAT 活力和 MDA 含量比较 .163.7 纳米铅暴露后对实验大鼠肝、肾组织病理形态学的影响.174 讨 论.204.1 实验大鼠的一般情况.204.2 纳

11、米铅暴露后对实验大鼠的肝系数、肾系数的影响.204.3 纳米铅暴露后对实验大鼠肝、肾组织中铅含量的影响.204.4 纳米铅暴露后对实验大鼠血清 AST、ALT、BUN 和 CR水平的影响.214.5 纳米铅暴露后对实验大鼠肝、肾组织 SOD、GSH-PX、CAT 活力和 MDA 含量的影响 .215 结 论.24参考文献.25谢 辞.27英文缩略语.28附 录.29 河北联合大学公共卫生学院-0-1 前 言纳米材料是指任何一维几何尺寸处于纳米尺度(1100 nm)，并具有特殊的物理化学性质的材料，目前已被广泛应用于染料、涂料、医药诊断等传统产业中, 在生产和使用过程中直接进入人体，或通过环境、

12、食物链进入人体1。人们接触到纳米材料的机会越来越多，其对人体的健康安全性评价日益受到人们的关注。铅(Pb)是一种广泛存在于自然界的人体非必需元素，通过不同途径进入人体的铅及其化合物可对多个系统造成严重损伤2，主要损伤神经系统、心血管系统、造血系统、肝脏、肾脏，同时还具有免疫毒性、生殖毒性和致癌性。某些研究显示，正常大小的物质，一旦做成纳米级的微粒后，就可能具有毒性，具有潜在危害，且粒径越小越具毒性3。纳米硫化铅（PbS NPs）是一种重要的半导体材料，在非线性光学器件、探测器、太阳光伏电池和光催化剂等方面有很好的应用前景4,5。因此，纳米级铅进入环境数量越来越多，有可能对环境和人体健康产生影响

13、。由于纳米颗粒的体积微小，有可能进入常规颗粒所不能到达的组织及部位，因此，其所致的生物学效应常较后者明显增强。本课题组前期研究表明，大鼠 PbS NPs 暴露，可引起机体的氧化应激反应，使其学习记忆能力下降，大鼠海马和大脑皮质丙二醛（MDA）含量显著升高，超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力明显降低，从而导致机体抗氧化能力的减弱，海马及皮质的损伤，脑组织结构发生病理性改变6。由此，PbS NPs 能够诱导氧化应激，促进脂质过氧化，导致组织的氧化损伤。氧化应激是纳米颗粒致机体损伤的重要机制之一7，它是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧(reaeti

14、ve oxygen species，ROS)产生过多，氧化程度超出机体清除能力，以致氧化系统和抗氧化系统失衡的状况，可导致组织损伤8,9。SOD 是活性氧自由基的天然消除剂，是机体抵抗 ROS 的第一道防线，可将 O2-转化为 H2O2和其他氢过氧化物。GSH-Px 是体内重要的抗氧化酶，可以催化有机过氧化物或过氧化氢还原成相应的醇或水，同时氧化 2 分子还原型谷胱甘肽生成 1 分子氧化型谷胱甘肽，可以保护细胞免受脂质过氧化的损伤。过氧化氢酶（CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶。它可催化过氧化氢分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害。抗氧化酶的活力高低则直接反

15、映机体清除氧自由基的能力。MDA 是机体在清除自由基过程中发生脂质过氧化的最终产物，是反映氧化损伤最经典的指标之一，前 言-1-其在组织中的含量可以反映脂质过氧化和细胞氧化损伤的程度。MDA 含量越高，机体清除自由基的能力越弱，相应的机体受到自由基攻击的程度就越大10。肝脏、肾脏是机体重要的解毒、排泄器官。外源化学物进人机体后要经过肝脏转化，然后在血液的带动下输送到肾脏，经肾小球和肾小管过滤后被排出体外，因此二者成为毒物最先攻击的靶器官。有实验室通过急性灌胃染毒 50 nm 的 PbO2，发现纳米 PbO2较普通 PbO2更易被机体吸收并在体内蓄积，且小鼠血液、肝脏、肾脏、脑组织的中 MDA

16、含量显著升高，抗氧化酶活力下降，机体出现氧化损伤11。但有关纳米级铅亚慢性染毒对肝肾组织氧化损伤功能的影响尚未见报道。因此，本研究以 30nm 硫化铅为研究对象，建立大鼠 PbS NPs 染毒模型，通过检测大鼠血清 AST、ALT、Cr 和 BUN 水平，肝肾组织 SOD、GSH-Px、CAT 活力及 MDA 含量的变化，探讨不同剂量 PbS NPs 对大鼠肝、肾组织的氧化损伤，并与微米硫化铅组进行比较，为深入阐明 PbS NPs 对肝肾毒性机制，寻找有效干预措施提供依据。河北联合大学公共卫生学院-2-2 材料与方法2.1 主要仪器仪仪 器器 名名 称称 及及 型型 号号厂厂 家家KDC-10

17、44 型低速离心机科大创新股份有限公司中佳分公司KQ-300VDB 型双频数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司7500 型 ICP-MS 仪美国 Thermo 公司CA94089 连续光谱酶标仪美国SK-1 型快速混匀器江苏医疗仪器厂艾科浦超纯水机 AWL-2002-重庆颐阳企业发展有限公司ETHOSA 微波消解仪美国 MILESTONE 公司WMZK-02 型电热恒温水浴箱浙江省嘉兴市新胜电器厂FA2004 型电子天平上海精科天平厂2.2 主要试剂试试 剂剂来来 源源高纯 30nm 粒径球状 PbS NPs 颗粒南开大学环境科学学院生理盐水实验室配制4%水合氯醛溶液实验室配制多聚甲醛实验室

18、配制超纯水艾科浦实验室超纯水系统硝酸（优级纯）天津市风船化学试剂科技有限公司高锰酸（优级纯）天津正成化学制品有限公司超氧化物歧化酶测试盒南京建成生物工程研究所丙二醛试剂盒南京建成生物工程研究所总抗氧化能力试剂盒南京建成生物工程研究所考马斯亮兰蛋白测定试剂盒南京建成生物工程研究所冰醋酸（分析纯）天津市申泰化学试剂有限公司材料与方法-3-2.3 PbS NPs 染毒模型的制作2.3.1 实验动物与分组SPF 级 SD 雄性大鼠 50 只（河北联合大学实验动物中心提供） ，体重180220g，自由摄食，饮水，适应性喂养 1w 后供试。随机分为对照组，微米PbS 处理组（100 mg/kg） ，PbS

19、 NPs 低剂量组（25 mg/kg） 、PbS NPs 中剂量组（50 mg/kg） 、PbS NPs 高剂量组（也称为纳米组，100 mg/kg） ，每组 10 只。2.3.2 实验动物染毒微米 PbS 处理组经灌胃给予 10 mg/ml 微米 PbS 悬浊液； PbS NPs 处理组经灌胃分别给予 2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml PbS NPs 悬浊液；对照组灌胃给予经高温灭菌的超纯水。各组大鼠每天染毒 1 次，每周染毒 5 d，连续染毒 6 w。动物于染毒前隔夜禁食。灌胃染毒时，以 1 ml/100g 体重的比例，1 min 内连续灌胃达到染毒剂量。染毒结束 2

20、h 后给予动物食物，其余时间均正常摄食、饮水。每天观察各组大鼠的一般情况和中毒症状等，每周测量 1 次大鼠体重。2.4 观察指标及检测方法2.4.1 一般情况实验期间观察大鼠皮毛光泽度、活动能力、粪便性状，进食饮水情况、体重和精神状态，每周观察一次。2.4.2 肝系数、肾系数测定于最后一次染毒后 24h 记录大鼠体重，心脏取血后迅速取出肝脏、肾脏，分别称重，计算其脏器系数。脏器系数=（脏器湿重/体重）100%河北联合大学公共卫生学院-4-2.4.3 肝肾组织铅含量测定2.4.3.1 样品前处理称取五组大鼠的肝、肾组织各 1.0g，分别置于锥形瓶（经过超声、水洗、泡酸、纯水、超纯水冲洗）中，加入

21、高氯酸 1ml 和硝酸 4ml 消化 12 小时左右，至样品被消化。之后，置于电热板上硝化至出现白色晶体，1%的稀硝酸定容至10ml。2.4.3.2 微量元素含量的测定本次实验用美国生产的 7500 型电感耦合等离子体原子发射光谱质谱仪（ICP-MS）仪测定血清和肝、肾组织中铅元素的含量。该仪器的工作条件：铅 发射功率：1420W，频率：27.12，雾化压力：32 lbf/in2，辅助气流量：1.08L/min, 进样速度：1.85 mL/min, 2%的稀硝酸冲洗时间：1min，超纯水冲洗时间：1min。2.4.4 血清中指标检测方法染毒 6 周后，处死大鼠，心脏采血，离心（2000r/mi

22、n）10min 取血清，检测 AST、ALT、Cr、BUN 水平，具体方法按试剂盒说明书进行。2.4.5 组织中指标检测方法染毒 6 周后，处死大鼠，心脏采血后迅速取出肝肾组织，制作成 10%组织匀浆，分别检测肝肾 SOD、GSH-Px、CAT 活力及 MDA 含量，具体方法按试剂盒说明书进行。2.5 病理学检测方法2.5.1 病理标本采集方法大鼠腹腔注射浓度为 10%水合氯醛（0.3ml/100g） ，待麻醉后暴露腹腔，取出肝肾组织，置于 10甲醛固定 24h，取出固定液中组织标本，常规脱水，石蜡包埋。连续切片，厚度约 5m，经粘片剂处理过的载玻片捞干，置于-60烤箱烘烤备用。材料与方法-5

23、-AST MDH2.5.2 光镜切片的制备（HE 染色）把所取组织石蜡切片经二甲苯常规脱蜡后，梯度酒精脱水。明矾苏木精染色 10min，自来水漂洗，经 1%氨水溶液数秒后自来水漂洗，0.5%伊红水溶液复染 2min，经漂洗去除伊红浮色，70%、80%、95%、100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。2.6 试剂盒操作方法2.6.1 AST 含量的检测方法(1) 测定原理L-天门冬氨酸+-酮戊二酸 草酰乙酸+L-谷氨酸草酰乙酸+NADH+H+ L-苹果酸+NAD+H2O(2) 测定方法AST 含量具体测定步骤如下：表表 1 1 双抗体夹心法测定双抗体夹心法测定 ASTAST 含量含量空白管样

24、品管样品30l蒸馏水30lR1500l500l混匀，保温 5 分钟R2250l250l混匀，保温 1 分钟，准确测定 1 分钟吸光度变化(3) 血清中 AST 含量计算公式AST（U/L）=(A 样品/分-A 空白/分) FF=Vt/(Vs 消光系数) 1000=4127Vt=反应总体积 Vs=样品体积NADH 在 340nm 波长下毫克分子消光系数=6.3河北联合大学公共卫生学院-6-2.6.2 ALT 含量的测定方法(1) 测定原理L-丙氨酸+-酮戊二酸 丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADH+H+ L-乳酸+NAD+H2O(2) 测定方法ALT 含量具体测定步骤如下：表表 2 2 双抗体夹心

25、法测定双抗体夹心法测定 ALTALT 含量含量空白管样品管样品30l蒸馏水30lR1500l500l混匀，保温 5 分钟R2250l250l混匀，保温 1 分钟，准确测定 1 分钟吸光度变化(3) 血清中 ALT 含量计算公式ALT（U/L）=(A 样品/分-A 空白/分) FF=Vt/(Vs 消光系数) 1000=4127Vt=反应总体积 Vs=样品体积NADH 在 340nm 波长下毫克分子消光系数=6.32.6.3 Cr 含量的测定方法(1) 测定原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠肌酐(Cr)水平。用纯化的大鼠肌酐(Cr)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肌

26、酐(Cr)，再与 HRP 标记的肌酐(Cr)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肌酐(Cr)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ，通过标准曲线计算样品中大鼠肌酐(Cr)浓度。 LDHALT材料与方法-7-(2) 测定方法 准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品 100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50l，混匀；然后从第一、第二孔中各取 100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、

27、第四孔分别加标准品稀释液 50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50l 弃掉，再各取 50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第九第十孔中各取 50l 弃掉。 （稀释后各孔加样量都为 50l，浓度分别为48mol/L，32mol/L，16mol/L，8mol/L，4mol/L） 。 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余

28、各步操作相同） 、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品 10l（样品最终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟。 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外。 温育：操作同 3。 洗涤：操作同 5。 显色：每孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色 15 分钟。 终止：每

29、孔加终止液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。 以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值） 。测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。(3) Cr 含量的计算以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。河北联合大学公共卫生学院-8-2.6.4 BUN 含量的测定方法(1) 测定原理脲酶使尿素分解产生氨，碱性条件下，被氧化成氯胺，亚硝基铁氰化钠催化

30、下与苯酚及次氯酸作用，后生成蓝色的靛酚，经过同样处理的校准液进行比较，可计算出样品中尿素或尿素氮的含量。(2) 测定方法BUN 含量具体测定步骤如下: 表表 3 3 脲酶改良波氏一步法测定脲酶改良波氏一步法测定 BUNBUN 含量含量空白管样本管 校准管校准液（l）样本（l）酶工作液（l）显色剂（l）显色剂（l）100010001000 1010 1000 10001000 10001000 1000按顺序操作各管混匀，置 37水浴 15 分钟，取出至室温，于 550nm，光径 1cm，以空白管调零比色。(3) 血清中 BUN 含量计算公式尿素氮（mmol/L）=样本吸光度（A）/校准吸光度（

31、A）校准液浓度2.6.5 SOD 活力的测定方法(1) 测定原理通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子（O2-.） ，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。当被测样品中含 SOD 时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品 SOD 的活力。(2) 测定方法按照 SOD 试剂盒说明，在波长为 550nm 下用酶标仪比色，具体步骤如下，（见表 4） 。材料与方法-9-表表 4 4 黄嘌呤氧化酶法测定黄嘌呤氧化酶法测定 SODSOD 活力活力试剂测定管对照

32、管试剂一（ml）0.50.5样品（ml）2.5 10-3蒸馏水（ml）2.5 10-3试剂二（ml）0.050.05试剂三（ml）0.050.05试剂四（ml）0.050.05用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟显色剂（ml）11混匀，室温放置 10 分钟，于波长 550nm 处，蒸馏水调零，比色。(3) 计算方法用酶标仪测定后，记录下每一管的吸光度。肝、肾组织中总 SOD 按以下公式计算：总 SOD 活力（U/mgprot）=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度/50% 反应液总体积/取液量（ml）/待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）2.6.6 GSH-Px 活力的测定方

33、法(1) 测定原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）可以促进过氧化氢（H2O2）与还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成 H2O 及氧化型谷胱甘肽（GSSG） ，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。H2O2+2GSH 2H2O+GSSG(2) 测定方法及步骤GSH-PX河北联合大学公共卫生学院-10-表表 5 5 酶促反应测定酶促反应测定 GSH-PxGSH-Px 活力活力非酶管酶管1mmol/L GSH (ml)0.20.2待测匀浆 (血清) (ml)0.2(0.1)37 水浴预温5 min试剂一(37预温) (ml)0.10

34、.137 水浴准确反应5 min试剂二应用液 (ml)22待测匀浆 (血清) (ml)0.2(0.1)混匀，35004000 rpm，离心 10 min，取上清 1ml 作显色反应。表表 6 6 显色反应显色反应空白管标准管非酶管酶管GSH标准品溶剂应用液 (ml)120mol/L GSH标准液 (ml)1上清液 (ml)11试剂三应用液 (ml)1111试剂四应用液 (ml)0.250.250.250.25试剂五应用液 (ml)0.050.050.050.05混匀，室温静置 15min 后，412nm 处，1cm 光径比色杯，蒸馏水调零，测各管 OD 值。(3) GSH-Px 活力计算公式组

35、织 GSH-Px 酶活力=标准管浓度(20mol/L) 稀释倍数(5*)反应时间(取样量样本蛋白含量)注：从酶促反应中看出反应液0.5ml，加试剂二2ml，在反应液中为5倍稀释。2.6.7 CAT 活力的测定方法(1) 测定原理过氧化氢酶 (CAT) 分解 H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的 H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在 405nm 处测定其生成量，可计算出 CAT 的活力。材料与方法-11-(2) 测定方法及步骤表表 7 7 CATCAT 活力测定活力测定加入物对照管测定管血清(匀浆) (ml)0.1 (0.05)试剂一(37预温) (ml)1.01.0试剂二

36、(37预温) (ml)0.10.1混匀，37准确反应 1min(60s)试剂三(ml)1.01.0试剂四(ml)0.10.1血清（匀浆）(ml)0.1 (0.05)(3) CAT活力计算公式组织中 CAT 活力(U/mgprot) = (对照 OD 值-测定 OD 值) 271待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)2.6.8 MDA 含量的测定方法(1) 测定原理 测过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在 532nm 处有最大吸收峰。(2) 测定方法及步骤表表 8 8 MDAMDA 含量测定含量测定标准管标准空白管测定管测定空白管10 nmo/ml 标准品 (ml)

37、a* 无水乙醇 (ml)a* 测试样品 (ml) a*a*试剂一 (ml)a*a*a*a*混匀（摇动几下试管架）试剂二 (ml)3333试剂三 (ml)111 50%冰醋酸 (ml) 1河北联合大学公共卫生学院-12- 漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95水浴 40 分钟，取出后流水冷却，然后 35004000 转/分，离心 10 分钟。取上清 532 nm 处，1cm 光径，蒸馏水调零，测各试管吸光度值。(3) MDA 计算公式 血清 MDA 计算公式血清 MDA 含量(nmol/ml)=标准品浓度(10nmol/ml)样本测试前稀释倍数 组织 MDA 计算公式组织中 M

38、DA 含量(nmol/mgprot)=标准品浓度(10nmol/ml)待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)注：*nmol/mgprot 为纳摩尔/毫克蛋白2.6.9 总蛋白含量测定(1) 测定原理蛋白质分子有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。(2) 测定方法及步骤从80中取出 2%的海马组织匀浆，解冻后，进行蛋白含量的测定（见表 7）。表表 9 9 考马斯亮兰法测定总蛋白含量步骤考马斯亮兰法测定总蛋白含量步骤试剂空白管标准管测定管蒸馏水（ml）0.050.563g/

39、l 标准液（ml）0.05样品（ml）0.05考马斯亮兰显色剂（ml）3.03.03.0混匀，静置 10 分钟，于 595nm 处，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管 OD 值。(3) 总蛋白含量计算公式蛋白浓度(g/L) = 标准管浓度（0.563 g/L）3 统计学处理所有数据录入 Excel2007 数据库，采用 SPSS13.0 统计学软件进行数据处理，结果以（）表示，多组均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采sx 用 LSD 法处理，P0.05 表示差异有统计学意义。结 果-13-3 结果3.1 实验大鼠的一般情况对照组大鼠皮毛有光泽，自主活动较多；高剂量组毛色干枯发黄无光泽，自

40、主活动普遍减少，反应迟缓，摄食量、饮水量减少，前爪和后爪表面皮肤粗糙，甚至有脱毛现象。3.2 纳米铅暴露后对实验大鼠的肝系数、肾系数的影响由表 10 可见，高剂量 PbS NPs 染毒组大鼠肝系数、肾系数均明显高于对照组（P0.05） 。表表 1010 各组大鼠肝系数、肾系数比较各组大鼠肝系数、肾系数比较（）sx 组别肝系数（%）肾系数（%）对照组2.490.310.630.09低剂量组2.550.220.660.05中剂量组2.690.350.700.06高剂量组2.820.440.710.08微米组2.630.150.630.05注：与对照组比 P0.05。3.3 纳米铅暴露后对实验大鼠肝

41、、肾组织中铅含量的影响由表 11 可见，各 PbS NPs 染毒组大鼠肝肾组织铅含量均明显高于对照组；随着染毒剂量的增加，肝肾组织中铅含量也随之升高，中剂量组明显高于低剂量组，高剂量组明显高于中剂量组与低剂量组（P0.05） 。相同剂量 PbS 比较，PbS NPs 组大鼠肝肾组织铅含量明显高于微米组大鼠（P0.05） 。河北联合大学公共卫生学院-14-表表 1111 各组大鼠肝、肾组织铅含量的比较各组大鼠肝、肾组织铅含量的比较（）sx 组别肝（g/g）肾（g/g）对照组0.620.150.540.09低剂量组20.224.4313.942.72中剂量组33.884.0322.233.54高剂

42、量组48.636.4729.353.87微米组2.290.345.471.04注：与对照组比 P0.05；：与低剂量组比 P0.05；：与中剂量组比 P0.05；：与微米组比，P0.05。3.4 纳米铅暴露后对实验大鼠血清 AST、ALT、BUN 和 Cr 水平的影响由表 12 可见，各 PbS NPs 染毒组大鼠血清 ALT、AST、Cr 水平均明显高于对照组（P0.05） ，随着染毒剂量的增加，血清中肝肾功能指标水平也随之升高，中、高剂量组血清 BUN 水平明显高于对照组（P0.05） ，中剂量组血清AST、BUN、Cr 水平明显高于低剂量组（P0.05） ，高剂量组ALT、AST、Cr、

43、BUN 水平均明显高于中、低剂量组（P0.05） 。相同剂量 PbS比较，PbS NPs 组血清 ALT、AST、Cr、BUN 水平均明显高于微米组（P0.05） 。表表 1212 各组大鼠血清各组大鼠血清 ASTAST、ALTALT、BUNBUN 和和 CrCr 水平的比较水平的比较（）sx 组别AST(U/L)ALT(U/L)BUN(mmol/L)Cr(mol/L)对照组107.3712.0961.308.403.920.4869.8713.31低剂量组139.9518.1685.3715.434.830.6788.8511.16中剂量组172.3517.0498.4819.016.751

44、.32108.6510.32高剂量组219.6717.39138.8318.599.251.74135.9814.96微米组130.7520.6976.4012.325.601.1891.1519.10注：与对照组比 P0.05；：与低剂量组比 P0.05；：与中剂量组比 P0.05；：与微米组比，P0.05。结 果-15-3.5 纳米铅暴露后对实验大鼠肝组织 SOD、GSH-Px、CAT 活力和MDA 含量比较由表 11 可见，各 PbS NPs 染毒组大鼠肝组织 MDA 含量明显高于对照组（P0.05） ，随着染毒剂量的增加，肝组织 MDA 含量升高，中剂量组明显高于低剂量组，高剂量组明显

45、高于中剂量组与低剂量组（P0.05） 。各 PbS NPs 染毒组大鼠肝组织 SOD、CAT 活力明显低于对照组，随着染毒剂量的增加，肝组织SOD、CAT 活力活力下降，中剂量组明显低于低剂量组，高剂量组明显低于中剂量组与低剂量组（P0.05） ；中高剂量组肝组织 GSH-Px 活力明显低于对照组（P0.05） ，高剂量组低于低剂量组（P0.05） 。相同剂量 PbS 比较，PbS NPs组 MDA 含量明显高于微米组（P0.05） ，SOD、GSH-Px、CAT 活力均明显低于微米组（P0.05） 。表表 1313 各组大鼠肝组织抗氧化酶活力及各组大鼠肝组织抗氧化酶活力及 MDAMDA 含量

46、比较（含量比较（）sx 组别SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/gprot)CAT(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)对照组178.5429.4164.736.679.231.793.430.60低剂量组145.8228.7958.516.167.651.367.191.43中剂量组109.7522.1650.374.164.491.010.241.84高剂量组79.3116.8441.896.512.380.5115.822.57微米组133.3725.1855.159.367.881.649.121.78注：与对照组比 P0.05；：与低剂量组比 P0.05；：与中

47、剂量组比 P0.05；：与微米组比，P0.05。3.6 纳米铅暴露后对实验大鼠肾组织 SOD、GSH-Px、CAT 活力和MDA 含量比较由表 14 可见，各 PbS NPs 染毒组大鼠肾组织 MDA 含量明显高于对照组，随着染毒剂量的增加，肾组织 MDA 含量升高，中剂量组明显高于低剂量组，高剂量组明显高于中剂量组与低剂量组（P0.05） 。各 PbS NPs 染毒组大鼠肾组织 SOD 活力明显低于对照组，随着染毒剂量的增加，肾组织 SOD 活力降低，中剂量组明显低于低剂量组，高剂量组明显低于中剂量组与低剂量组（P0.05） 。河北联合大学公共卫生学院-16-中高剂量组肾组织 CAT、GSH

48、-Px 活力均明显低于对照组（P0.05） ，高剂量组均明显低于低剂量组（P0.05） 。相同剂量 PbS 比较，PbS NPs 组 MDA 含量明显高于微米组（P0.05） ，SOD、GSH-Px、CAT 活力均明显低于微米组（P0.05） 。表表 1414 各组大鼠肾组织抗氧化酶活力及各组大鼠肾组织抗氧化酶活力及 MDAMDA 含量比较（含量比较（）sx 组别SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/gprot)CAT(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot) 对照组153.2724.9254.438.368.141.242.810.53低剂量组125.4523.1847.51

49、9.237.211.385.091.01中剂量组96.8319.5643.377.844.051.079.751.97高剂量组74.7116.3937.898.922.220.5712.392.09微米组126.0824.5945.459.186.461.034.360.85注：与对照组比 P0.05；：与低剂量组比 P0.05；：与中剂量组比 P0.05； ：与微米组比P0.05。3.7 纳米铅暴露后对实验大鼠肝、肾组织病理形态学的影响大体观其肝肾组织出现了明显的临床病理损伤，多数肝肾可见黑色或棕色粒子沉积。在普通光学显微镜下观察肝肾组织病理形态学改变，染毒组与对照组比较有明显的炎症性病理改

50、变，主要表现为肝血窦充血，肝细胞水肿，可见炎细胞浸润肾近曲小管上皮细胞水肿，肾间质充血等。由图 1 可见对照组肝小叶结构正常，可见肝细胞索和肝血窦，肝细胞形态正常。低剂量组肝小叶结构正常，可见肝细胞索，肝血窦充血，肝细胞轻度水肿。中剂量组肝小叶结构正常，可见肝细胞索，肝细胞明显水肿至气球样变。高剂量组肝小叶结构正常，肝细胞索紊乱，肝细胞重度水肿至大量气球样变，可见肝内有脂滴。肾小球结构正常，微米组肝小叶结构正常，可见肝细胞索，肝血窦充血，肝细胞轻度水肿，可见肝内有脂滴。结 果-17- 对照组（HE 染色400） 低剂量组（HE 染色400） 中剂量组（HE 染色400） 高剂量组（HE 染色4

51、00） 微米组（HE 染色400）图 1 各剂量组肝组织病理图肾组织病理学改变如图 2 所示，对照组肾小球结构正常，肾近曲小管、远曲小管未见异常，肾间质无纤维化，无充血，无炎细胞浸润。低剂量组肾小球结构正常，肾近曲小管上皮细胞轻度水肿，肾间质有充血，可见少量炎细胞浸润。中剂量组肾小球结构正常，肾近曲小管上皮细胞明显水肿，可见明显炎细胞浸润。高剂量组肾近曲小管上皮细胞重度水肿，肾间质充血，可见大量炎细胞浸润。微米组肾小球结构正常，肾近曲小管上皮细胞轻度水肿，肾间质明显充血，少量炎细胞浸润。河北联合大学公共卫生学院-18- 对照组（HE 染色400） 低剂量组（HE 染色400） 中剂量组（HE

52、染色400） 高剂量组（HE 染色400） 微米组（HE 染色400）图 2 各剂量组肾组织病理图 讨 论-19-4 讨 论氧化应激是多种外源化学物对机体造成损伤的机制之一。外源化学物进入体内引起活性氧自由基(ROS)的产生过多，机体氧化抗氧化系统失衡，从而导致组织的氧化损伤。本次实验通过灌胃PbS NPs染毒大鼠，建立PbS NPs亚慢性染毒模型，通过检测肝肾组织AST、ALT、BUN、Cr水平的变化及抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活力，脂质过氧化物MDA含量的变化，探讨PbS NPs对大鼠肝、肾组织氧化损伤功能的影响。4.1 实验大鼠的一般情况染毒动物的一般情况主要表现在动物体重、皮

53、毛色泽、自主活动、精神状态、进食饮水量等方面。众多学者研究表明，铅染毒动物的一般情况均有明显的变化。多项研究表明，铅使染毒动物皮毛发黄、自主活动减少、精神萎靡、饮水进食量减少。与本实验研究结果基本一致，可能是由于PbS NPs染毒，对大鼠的机体造成损伤。4.2 纳米铅暴露后对实验大鼠的肝系数、肾系数的影响脏器系数是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，单位体重一般以100g体重计。实验动物随年龄、体重增长，在不同的年龄期各脏器与体重之间重量比值有一定规律。脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。本次实验结果显示，高剂量组肝系数、肾系数增大，说明可能

54、随着铅染毒剂量的增加，其对机体的毒作用在不断增强，可能是因为染毒使肝、肾组织充血水肿，造成其脏器系数增大。4.3 纳米铅暴露后对实验大鼠肝、肾组织中铅含量的影响肝脏和肾脏是动物体内最重要的解毒、排毒器官，外来异物进人机体后要经过肝脏转化，然后在血液的带动下输送到肾脏，经肾小球和肾小管过滤后被排出体外，因此二者成为毒物最先攻击的靶器官。本次研究发现，随着 PbS NPs 染毒剂量的升高，肝肾组织铅含量明显升高。说明纳米铅由于其独特的物理化学特性，可相对容易地进入血液循环并蓄积于肝肾。相同剂量 PbS 比较，PbS NPs 组肝肾组织铅含量均明显高于微米组。这是由于纳米颗粒的体积微小，有可能进入常

55、规颗粒难以到达的组织及部位所致，因而其所致的生物学效应也河北联合大学公共卫生学院-20-常强于后者。4.4 纳米铅暴露后对实验大鼠血清 AST、ALT、BUN 和 Cr 水平的影响谷草转氨酶（AST）是医学临床上肝功能检查的指标，用来判断肝脏是否受到损害，当肝脏发生严重坏死或破坏时，能够引起血清中 AST 水平升高12,14。谷丙转氨酶（ALT）主要存在于肝细胞浆内，它是反映肝细胞受损程度最灵敏的指标。肝细胞或某些组织损伤或坏死，都会使血清中的 ALT升高。肌酐（Cr）是肌肉在人体内代谢的产物, 检测血肌酐是常用的了解肾功能的主要方法之一，尿素氮（BUN）是人体蛋白质代谢的主要终末产物，是肾功

56、能主要指标之一。在肾功能正常的情况下，肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）这些小分子物质从肾小球滤出，当急、慢性肾小球肾炎等使肾小球滤过功能减退时，血肌酐可升高。故二者可用作肾小球滤过功能的诊断和过筛指标。本次实验研究发现各 PbS NPs 染毒组 AST、ALT 、Cr 浓度显著高于对照组，PbS NPs 中、高剂量组 BUN 活力显著高于对照组。有研究表明15，纳米 PbO2染毒组的小鼠血清中 Cr、BUN 含量与对照组比较均明显升高，同剂量纳米 PbO2染毒组 Cr、BUN 值远远高于普通组，与本次实验结果基本一致，同时结合肝脏病理检测结果可见，高剂量组肝脏以及肾脏损伤情况比低剂量组严重，低剂

57、量组肝脏以及肾脏损伤情况较对照组严重，提示PbS NPs 对于肝脏及肾脏的毒性与其浓度相关，且 PbS NPs 对肝肾功能造成的损害作用远远大于普通 PbS。4.5 纳米铅暴露后对实验大鼠肝、肾组织 SOD、GSH-Px、CAT 活力和 MDA 含量的影响抗氧化防御系统是生物体内重要的氧自由基清除系统，包括酶性清除剂(如SOD，CAT，GPX等)、小分子抗氧化剂(如GSH、维生素C、维生素E等)。在正常生理条件下，体内自由基的产生和清除保持动态平衡。但当机体受到外物作用时，体内的氧化应激系统可能被激活，随生物体内氧自由基的增加，抗氧化酶和部分抗氧化剂的合成可能相应增加。当氧自由基的产生速度超出

58、了机体抗氧化防御系统的清除能力，就会对机体造成氧化胁迫，从而引发一系列毒性效应16。SOD是一种广泛存在于生物体内与细胞氧化代谢密切相关的蛋白质，是抗 讨 论-21-氧化酶系中最先与活性氧自由基结合的酶，而且它是机体唯一能够清除超氧阴离子的酶，该酶受到抑制，必然造成超氧阴离子的堆积，并可通过其他反应生成羟自由基等有害产物，超氧阴离子和羟自由基是脂质过氧化的关键因素17，因此SOD是抗氧化系统性能状态的一个重要指标18。近年来，学者们对机体内铅与SOD的关系进行了大量的研究，其结果多数一致，主要认为铅可使机体内的SOD活性降低，而且呈现出剂量-反应关系。本次研究对结果显示：低、中、高剂量组SOD

59、活力降低。提示可能是由于随着染毒剂量的增加，其SOD的含量在逐渐降低，表明机体可能受到了氧自由基的攻击，从而使机体清除氧自由基的能力减弱。GSH-Px是人体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，可以催化有机过氧化物还原成相应的醇或H2O，保护细胞免受脂质过氧化的损伤，保护细胞膜结构及功能不受过氧化物的干扰与损害。CAT是一种酶类清除剂，主要存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，可清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害。本次研究发现，中高剂量组肝肾组织GSH-Px、CAT活力明显低于对照组。相同剂量PbS比较，PbS NPs组肝肾组织GSH-Px、CAT活力均明显低于微米组。这提示

60、纳米铅对肝肾组织的毒性可能与其诱导ROS等自由基的产生，抑制抗氧化酶活力，导致机体氧化抗氧化系统失衡，使细胞处于氧化应激状态，进而导致细胞的氧化损伤有着密切关系。机体内存在着大量的不饱和脂肪酸，极易受到自由基的攻击。Rehman(1984) 19指出铅可以通过脂质过氧化反应导致生物膜的变性及功能丧失，并产生MDA等一系列对机体有害的降解产物，对机体造成损伤。MDA是目前反映机体氧化损伤最具代表性的指标之一，其在机体中的浓度水平反映了脂质过氧化的程度，即机体细胞受自由基攻击的严重程度20。胡锦东等(2004) 21研究发现，wistar大鼠以40 mg/kg的醋酸铅连续灌胃4周后，其肝脏及肾脏的