朱明华版仪器分析HPLC

1、高效液相色谱简介（HPLC）是以是以气相色谱气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上，采用础上，采用颗粒十分细的固定相颗粒十分细的固定相，并采用，并采用高压泵输送高压泵输送流动相流动相而建立的一种液相色谱法。而建立的一种液相色谱法。HPLC的突出特点：的突出特点： 1）高压）高压; 2）高速）高速; 3）高效）高效; 4）高灵敏度）高灵敏度(10-9); 5）高选择性）高选择性;HPLC的的应用范围应用范围：溶解后能制成溶液的溶解后能制成溶液的样品样品，不受，不受样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、

2、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的泛，占有机物的80%。GC与与LC的比较的比较HPLC系统溶剂传输系统：心脏高压泵样品引入系统：自动购置进样器样品分离系统：关键色谱柱信号检测系统：检测器数据处理系统：软件泵的基本原理（高压泵.swf）往复活塞泵(单向阀)弹簧隔板/红宝石球串联柱塞泵消除流量脉冲 并联柱塞泵减小流量脉冲 仪器：手动进样器-六通阀/定量环 （LC.swf）六通阀定量环高压定量进样阀：高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。优点：进样准确，重现性好，适于定量分析。仪器：自动进样器自动进样100样品盘/机

3、器手/自动洗针机械手样品盘色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架柱温箱外挂架仪器：检测器-紫外UV/Vis双灯，全波长检测检测器流路仪器：检测器-其它仪器：化学工作站进样器高压泵流动相色谱柱检测器数据处理流动相HPLC流动相除了起运载流动相除了起运载作用外，还直接参与分离，作用外，还直接参与分离，影响明显。影响明显。 盐的影响：盐的影响： 通常加入醋酸盐、硼酸盐、硫酸盐等。无机盐使通常加入醋酸盐、硼酸盐、硫酸盐等。无机盐使流动相表面张力增大，对非离子性溶质，使流动相表面张力增大，对非离子性溶质，使k增加，增加，对离子型溶质，对离子型溶质，k下降。对碱性有机物有改善峰形下降。对碱性有机物有改善峰形的作用。

4、的作用。 pH值：值： 加入酸、碱或缓冲液，控制加入酸、碱或缓冲液，控制PH，抑制溶质的离子，抑制溶质的离子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。流动相单组分（一种溶剂）和多组分；单组分（一种溶剂）和多组分；极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；固定组成洗脱和梯度洗脱；固定组成洗脱和梯度洗脱；用用二二元或元或三三元组合溶剂元组合溶剂灵活调节流动相的极性灵活调节流动相的极性或或增加选择性增加选择性，改进分，改进分离或调整出峰时间。离或调整出峰时间。无水正庚烷无水正庚烷含水正庚烷含水正庚烷水饱和正庚烷水饱和正庚烷色谱柱色谱柱C18流动相常用作流动相的溶剂有：乙腈、甲

5、醇、乙腈 水、甲醇-水、四氢呋喃、氯仿、正己烷等。乙腈的毒性、成本均高于甲醇，在等度淋洗时一般选用甲醇-水体系。乙腈-水比较适合梯度洗脱，而甲醇-水系统出于热力学和可压缩性因素，在梯度洗脱时易导致基线漂移。梯度洗提(脱)梯度洗脱即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。与气相色谱中的程序升温相当 对于亲水性固定液，采用疏水性流动对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（相，即流动相的极性小于固定液

6、的极性（正正相相 normal phase色谱），反之，流动相的极色谱），反之，流动相的极性大于固定液的极性（性大于固定液的极性（反相反相 reverse phase色色谱）。谱）。为什么？化学键合相色谱优点：有较好的分离效果；优点：有较好的分离效果；缺点：固定液流失，使柱效和分离选择性下降缺点：固定液流失，使柱效和分离选择性下降产生基线噪声而降低检测器的灵敏度。不适用产生基线噪声而降低检测器的灵敏度。不适用于梯度洗脱操作。于梯度洗脱操作。*化学键合相色谱法化学键合相色谱法* 为了解决固定液的流失问题，人们将各种不为了解决固定液的流失问题，人们将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅同的

7、有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶胶( (载体载体) )表面的游离羟基上，而生成化学键表面的游离羟基上，而生成化学键合固定相，并进而发展成键合相色谱法。合固定相，并进而发展成键合相色谱法。 特点：化学键合固定相对各种极性溶剂都有特点：化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱柱色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好，几柱效高、使用寿命长、重现性好，几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性，特别适用于具有宽范围择性，特别适用于具有宽范围k k值的样品的值的样品的分离，并可用于梯度洗脱操作

8、。分离，并可用于梯度洗脱操作。 根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，该法分为正相键合相色谱法和反相键合相色该法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。在前者中，键合固定相的极性谱法。在前者中，键合固定相的极性大于大于流流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。在后者中，键合固定极性和强极性化合物。在后者中，键合固定相的极性相的极性小于小于流动相的极性，适于分离非极流动相的极性，适于分离非极性、极性或离子型化合物。据统计在高效液性、极性或离子型化合物。据统计在高效液相色谱法中，约相色谱法中，约7070

9、8080的分析任务皆的分析任务皆由反相键合相色谱法来完成的。由反相键合相色谱法来完成的。反相反相HPLC 极性极性:固定相固定相 流动相流动相 固定相固定相 - 极性极性 流动相流动相(己烷己烷, 庚烷庚烷)- 非极性非极性 极性物质后出峰极性物质后出峰正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%正己烷/异丙醇（v/v）：70/30；80/20；90/10；95/5 正相正相HPLC为什么反相色谱应用如此广泛?它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和

10、解释。 所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。固定相-填充材料液相色谱柱填料尽管有有机高分液相色谱柱填料尽管有有机高分子、石墨化碳、氧化铝、氧化钛，氧子、石墨化碳、氧化铝、氧化钛，氧化锆等，但多以全多孔硅胶作基质。化锆等，但多以全多孔硅胶作基质。 烷基键合固定相特性对保留值的影响：烷基键合固定相特性对保留值的影响： 反相：键合相烷链长，反相：键合相烷链长，k大，选择性好。大，选择性好。现代高效液相色谱柱的要求1.超纯 B 型球形硅胶 峰形好、柱效高。2.不能有使色谱性能降低的直径小于50

11、 的微孔。3.粒径尺寸从 3 m 到 10 m 能满足从分析到制备色谱规模的需求。 4.色谱柱柱床装填好 使用寿命长、柱效高。5.封尾彻底 峰形好、使用寿命长。6.批与批之间得重现性好。7.不同的相具有不同的选择性 能更好的实现分离。8.键合相化学稳定好 适用的 pH 范围广, 使用寿命长。HPLC 色谱柱结构类 型内径D (cm)柱长(cm)粒径 (m)分析柱0.3 0.463 - 253 - 10微孔柱0.1, 0.2115, 253 - 8半制备柱0.8 1.010 - 255 - 20制备柱2.0 5.010 - 255 - 20HPLC在医药方面的应用1、新药研发：目标物的检测、纯度

12、等2、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等3、体液：血、尿、脊椎液、唾液等4、抗菌素 ：青霉素 、甾族(激素)等 5、其它HPLC在环保方面的应用1、农药残留量分析 ：含氯农药 、有机磷 农药 、除虫菊等2、致癌物质 ：硝基呋喃及其代谢物、霉 素 、亚硝胺、苯并芘等3、水质分析：内分泌污染物等4、其它HPLC在生化方面的应用1、蛋白质分析2、肽类的分析3、核酸4、氨基酸 5、其它手性的普遍性及在医药中的重要性手性的普遍性及在医药中的重要性n手性的发现和普遍存在手性的发现和普遍存在nPasteur（1848年外消旋酒石酸钠铵盐晶体）n实物与镜像不重合n蛋白质、核酸等n手性化合物的性质手性化合物的性质 (旋光、手性环境)n反应停事件（反应停事件（20世纪六十年代）世纪六十年代）u1956年，联邦