潜伏相关转录体对单纯疱疹病毒再激活作用的研究进展

1、潜伏相关转录体对单纯疱疹病毒再激活作用的研究进展赵举峰1,2，杨慧兰1（1、广州军区广州总医院皮肤科，广州 510010；2、华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510640）【摘 要】本文综述了关于HSV病毒LAT基因近年来的研究成果，综合分析了LAT在潜伏HSV激活过程中的作用机制，界定了潜伏感染HSV再激活的定义及各种非特异性诱导因素，总结了病毒HSV激活的相关推测，一种是LAT ORFs编码蛋白执行了调控潜伏病毒激活的功能；一种推测则认为LAT具有抗凋亡的活性，并以此使病毒的激活感染及扩大成为可能。论证了潜伏感染HSV的再激活现象不仅会发生，而且广泛存在。【关键词】单纯疱疹病毒（HS

2、V）；潜伏相关转录子（LAT）；激活；机制The mechanism that Latency-associated transcripts mediate reactivation of the Herpes Simplex VirusZHAO ju-feng1,2, YANG hui-lan11. The department of Dermatology, Liu Hua qiao Hospital, Guangzhou 510010, China 2. College of Bioscience & Biotechnology, South China University o

3、f Technology, Guangzhou 510640, China 【Abstract】The paper reviewed the most recent findings of HSVs LAT, discussed several model that LAT used to mediate HSVs reactivation. One model suggests that the LATORFs translate some proteins to exert activate the letancy HSV. The other model suggests that th

4、e LATs possess antiapoptotic activity that protects HSV-infected neurons from detection and deletion by apoptotic singnaling pathways and use this method help the HSV activation and extent HSVs infection. It is strongly suggest that the phenomenon of HSVs reactivation is not only existence but also

5、could occurrence at anytime.【Key words】HSV； LAT；reactivation； mechanism单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）属于疱疹病毒科，有HSV-1（Herpes Simplex Virus type 1）和HSV-2（Herpes Simplex Virus type 2）两个血清型。HSV-1病毒主要感染唇、口、眼、脑等部位，可引起眼结膜炎、致死性脑炎等疾病，而HSV-2病毒则感染腰以下部位，主要引起生殖器疱疹（Genital Herpes，GH）1。虽然两个病毒引起的临床症状差异迥然，但因其在基因组序列

6、上极高的同源性，大部分基因的区分及功能也非常类似。HSV病毒感染之所以成为世界性的医学难题，其易潜伏特性是症结所在。1、 HSV潜伏感染及其定义HSV极具传染力，可引起多种广泛流行的疾病，且易建立潜伏。HSV-1、HSV-2分别能在三叉神经节基金项目国家自然科学基金资助项目（30571668） 作者简介赵举峰，男，在读硕士研究生，从事单纯疱疹病毒型潜伏相关转录体基因的作用研究。通讯作者杨慧兰，女，教授，主任医师，博士生导师。E-mail:huilany88，Tel骶尾神经节内终生潜伏。Kesan等曾给HSV-1的潜伏作过这样的定义：（1）病毒能在宿主体内持续存在但宿主

7、本身不表现任何相关的临床症状；（2）潜伏感染的HSV病毒可由潜伏状态被再次激活并伴随具感染力的病毒颗粒产生；（3）病毒处于潜伏感染状态时，不表达任何相关的增殖性基因，但在宿主细胞核内会大量积累潜伏相关转录体（Latency-Associated Transcripts，LATs）；（4）病毒不表达相关抗原，但宿主体内可检测到病毒基因组的存在2。这个定义分别从四个不同的层面界定了HSV-1潜伏感染时的表型，并且与HSV-2潜伏感染的情况吻合。虽然随着检测技术的逐步发展， ICP0、TK激酶等病毒增殖性感染基因在病毒潜伏感染期间也有微量表达，但研究者认为这是因为潜伏感染与再激活感染之间的动态平衡所

8、引起的。易潜伏是HSV感染难以医治的症结所在，因为到目前为止，所有用于治疗HSV感染相关疾病的药物均以病毒核酸编码的部分酶为作用靶点，通过对其选择性磷酸化来阻断病毒基因的复制，进而控制疾病相关的临床症状。而一旦病毒进入潜伏感染状态，这些常规药物作用所倚赖的TK激酶、DNA多聚酶等均不被表达，使得药物失去了进一步有效治疗和彻底清除病毒的功效3。2、潜伏感染HSV的再激活广泛存在绝对潜伏的HSV病毒在神经元细胞中处于静息状态，不进行任何增殖性表达，也不会引起任何疾病相关的临床症状。对病人来说，如果终其一生体内所有的HSV病毒都处于潜伏状态，应该不会造成生理上太大的痛苦，甚至连细微的不适，如肢端神经

9、性麻木都不会经常出现4。但问题的关键是潜伏感染的HSV病毒会从潜伏状态活化，即所谓潜伏HSV的再激活，严重的会重新引发临床症状，造成相关疾病的复发。研究显示，HSV的再激活不但会发生，并且广泛存在。早期的研究者们在HSV病毒原发感染小鼠后，因为无法在其相关神经节切片中检测到ICP4、TK等病毒增殖性基因的表达产物而一直认为小鼠比家兔更适合用于HSV潜伏感染相关机制的研究，认为原发感染了HSV病毒后没有临床症状的小鼠就是一个稳定的HSV潜伏感染模型5。然而随着技术的进步，即使在小鼠模型中，Lawrence.T及其同事仍然发现了潜伏HSV的“自发的分子复活”现象，他们通过对上千组被认为是HSV-1

10、潜伏感染小鼠的TG神经节切片进行高通量的ICP4、TK、gC、LAT等基因产物的检测，发现在少数神经节的神经元中有HSV-1增殖性基因表达的证据，并且发现了病毒DNA复制和相关蛋白合成的痕迹，在某些激活感染的神经元周围还发现了大量炎性浸润细胞的存在，这进一步揭示了在这一部位有强烈的细胞免疫作用存在，证实潜伏的病毒已被激活5。ICP4是一个重要的即早期（Immediate Early，IE）蛋白，负责调控病毒增殖性周期的早期事件，TK激酶则是由ICP4调控产生的病毒增殖性周期的晚期蛋白。通过RT-PCR检验，Kramer和Coen6也发现了被表达的病毒增殖性基因，另外，研究证实使用阿昔洛维（Ac

11、yclovir）这种用于抑制病毒增殖的药物可以明显减少这些基因产物。随后的一系列研究中，也都发现了病毒增殖早期的一些基因表达产物，于是越来越多的研究者相信潜伏感染HSV的激活是普遍存在的现象，潜伏与激活处于一个相对的平衡中。研究者认为，这样的结果要么是在潜伏感染HSV的神经节中有很多神经元都表达了增殖性基因，只不过量要少于LAT，要么是极少数神经元大量表达了这些基因7，但由于总数太少，所以仍然被认为病毒处于潜伏感染阶段。总而言之，潜伏感染病毒的再激活是普遍发生的。3、潜伏感染HSV再激活的诱导因素众多随着对HSV潜伏及激活认识的逐步深入，研究者们发现除了自发活化以外，大量物理和生物化学及心理应

12、激均可作为诱导因素作用于潜伏病毒的激活。例如，紫外线照射、干冰灼伤及其他有害物刺激引起的物理性皮肤破损等上皮刺激；X射线等细胞毒性因子；重金属类神经毒性因子；高热、疲劳、病毒性疾病等整个机体的系统损伤；惊吓、兴奋等心理应激；肾上腺素等信号肽均可作为有效诱发因素激活潜伏感染的HSV病毒3。显然，上述这些因素是普通患者在其日常生活中会经常遇到的，一旦受到诸如此类的刺激，那将可能导致疾病的复发，但常规药物的使用只是让暂时激活了的病毒再次进入新一轮的潜伏感染中，在潜伏、复发、再潜伏、再复发的循环中病毒潜伏的时间越来越长，所需药物的剂量越来越大，复发导致的临床症状也越来越严重，患者不堪其苦。因此，欲有效

13、治疗疾病及清除病毒，HSV再激活引起的复发感染相关机制的研究越来越显得必要和紧迫。4、LAT介导的潜伏HSV再激活机制HSV病毒复发的相关分子机理的研究存在诸多障碍，由于实验过程中所选择的模型动物、标本的检测方法、攻击病毒株等的差异，使得很多实验结果没有高的可重复性，而目前普遍采用的从HSV潜伏感染动物模型的相关神经节取切片检测的做法会否与活体内的潜伏HSV存在某些差异也不得而知7。由于这些原因，关于潜伏感染HSV的活化至今仍然没有一个被普遍接受的机制。近来的研究表明，相关的争论越来越多地围绕潜伏相关转录体（LAT）这一HSV病毒潜伏感染阶段极少数被大量表达的RNA展开,虽然有研究者认为LAT

14、的表达对于潜伏病毒的激活并非必需，但更多的则认为LAT对于调控病毒复活是至关重要的8。LAT基因位于HSV病毒基因组长重复序列（TRL和IRL）与UL相连接的区域。HSV-1包括8.3kb非主要LAT（Minor LAT）及由其剪切形成的2.0kb、1.5kb（或1.45kb）主要LAT（Major LAT）9，HSV-2则仅包括9.0kbMinior LAT和由其剪切形成的2.2kbMajor LAT10。尽管LAT的准确功能仍然不太清楚，但很多证据显示LAT是多功能性的，不仅与病毒潜伏的建立关系密切，而且对潜伏病毒的再激活也至关重要。关于LAT对于潜伏HSV的激活作用，研究者曾提出多种假说

15、，如LAT通过反义核酸机制抑制ICP0的表达10，或者是LAT使病毒基因组始终处于转录活性状态以使病毒的自主复发成为可能。显然，这些假说都过于片面，不足以完全解释LAT在介导病毒潜伏和激活感染中的各种现象12。综述关于LAT介导潜伏感染HSV再激活的相关机制，大致集中在以下几个方面：4.1 主要LAT ORFs与潜伏HSV的再激活HSV主要LAT均包含有多个蛋白开放读码框（ORFs）。其中， HSV-1的2.0 kb LAT含有三个蛋白开放读码框（ORF），但由于第三个ORF位于2.0 kb LAT的剪切位点区，所以在生成1.5 kb LAT时被移除。其ORF1保留了274个密码子，ORF2含

16、有419个密码子13。HSV-2的主要LAT内含有三个ORFs，分别命名为ORF1、ORF2和ORF3。这三个蛋白开放读码框分别保留了214、74和119个密码子。它们的ATG分别位于HSV-2主要LAT序列的第784，1267，1496碱基位14。LAT（-）突变病毒的再激活率明显低于野生型病毒的研究表明潜伏感染HSV的再激活与LAT具有某种相关性。介导潜伏的HSV活化是LAT的功能之一，既然LAT包含有如此数目众多的ORFs，那么研究们推测LAT的功能之中应该有以蛋白为介质进行作用的。最先提出LAT ORFs编码蛋白可能在HSV潜伏感染过程中具有某种功能的是Wilcox及其同事，但这一设想

17、很轻易的就被人们否定了，不仅是因为当LAT ORFs区域突变的病毒株用于实验时HSV缺乏稳定的表型，更因为事实上在病毒潜伏感染的神经元中使用现有的检测手段无法稳定地检测到LAT ORFs编码的蛋白。同样基于这一猜想，S.K Thomas等12构建了pcDNA3.1mycHis-LATORF重组载体并通过体外转录的方式表达了LAT ORFs编码蛋白，检测发现它能大幅提升ICPO（-）突变病毒株在DH7细胞中的活性。在将pcDNA3.1mycHis-LATORF与病毒共转染Vero细胞的实验中还发现该重组载体可以解除因ICP0、ICP4等即早期（IE）蛋白基因缺乏所引起的对插入病毒基因组的外源启动

18、子的抑制，这显示了LATORFs编码蛋白与ICP0蛋白功能相似。电镜观察发现表达了LATORFs编码蛋白的宿主细胞核基因组即将复制的结构单元上出现了一些细孔状结构，这一改变已被证实由ICP0蛋白完成。因此，研究者认为LAT ORFs编码蛋白在功能上类似于HSV病毒的即早蛋白ICP0，并以在实验中检测到的磷酸化形式为其活性形式，而LAT正是通过在HSV潜伏感染期间表达其ORFs编码的蛋白来代替增殖性感染早期的调控蛋白ICP0进而介导了病毒的再激活。但由于LAT ORFs的编码处于病毒激活的过程紧密的级联调控当中，蛋白被瞬时表达后立即改变形态以执行其功能，因而难以在病毒激活后一段时间里被常规方法检

19、测到。4.2 1.5kbLAT区域基因序列与潜伏感染病毒的激活Perng等1996年在家兔模型实验中证实HSV-1 1.5kbLAT对于潜伏病毒的自发性激活不可或缺，Drolet则认为1.5kbLAT5端的前811bp序列对于LAT无义突变病毒株而言可以弥补由于1.5kbLAT缺失对潜伏病毒激活造成的影响。D.C Bloom等进一步研究了该区域中5端前348bp序列对于病毒复活的相关功能，认为至少对于由肾上腺素电转化法诱导的HSV-1复活而言，这348bp才是真正必需的。作为这一思路的延续，P.B Bhattachrjee等以野生型17syn+为亲株分别构建了348bp5端和3端缺失201bp

20、、207bp的17201、17207突变株，并将其用于感染家兔模型15。实验结果表明，与野生型17syn+株及348bp回复突变株17348R相比，病毒进入潜伏以后这两个突变株与对照株均达到了同一水平的高复活率。因而揭示了在这348bp区域是作为一个大的整体来执行其对潜伏病毒的激活功能的，由于201bp和207bp在位置上有重叠，这就排除了其间存在顺式调控元件的可能。为了评估这348bp缺失了的突变株的低复活率是否是由348bp以外的空间因素引发，研究者又构建了另一包括360bp异源基因（lacZ）填充片段的突变株17348st，填充片段是为了维持其他序列原有的立体构型。与17348株类似，结

21、果同样也显示为一低的复活率，揭示这被删掉的348bp是通过某种非空间的因素而起作用的。4.3 LAT抗凋亡功能与潜伏HSV病毒的激活研究者们相信LAT相关的抗凋亡功能不仅有利于病毒潜伏感染的建立，而且也与潜伏病毒的再激活关系密切。牛单纯疱疹（Bovine Herpes Virus，BHV）也属于疱疹家族，其潜伏相关基因LR被认为具有介导多种病毒的抗宿主凋亡的功能。为了研究HSV病毒抗凋亡功能与潜伏病毒再激活的关系，Kevin R.Mott等将缺失了第二个ORF的LR突变基因插入到LAT负突变病毒DLAT2903缺失了的LAT区域构建嵌合病毒CJLATmut。在随后的实验中证实该嵌合病毒不仅消除

22、了HSV-1病毒的抗凋亡功能，而且还消除了BHV病毒抗凋亡特性，并且无论是在家兔模型还是在小鼠模型上，CJLATmut病毒的复活率均低于野生病毒株。这除了表明BHV LR的抗凋亡功能可能由其第二个ORF编码蛋白来执行以外还证实HSV-1病毒的复活与LAT的抗凋亡功能相关16。研究者们推测在患者体内，被重新激活的病毒会复制形成新的病毒颗粒，它们足以感染邻近的神经元。因此，潜伏病毒的再激活使得这一区域潜伏病毒再次复发的效应会被逐级放大，但被期望的相关细胞的凋亡或死亡仍然不会发生4。显然，病毒的抗凋亡功能在这里发挥了效用，自然地让人联想到这一次LAT抗凋亡被用于潜伏感染病毒的再激发。单纯疱疹病毒感染

23、所引起的顽疾已成为全球医学界的难题，临床症状不定期的复发更是让患者苦不堪言，问题的症结在于HSV病毒易在神经节内建立潜伏，而且潜伏状态极不稳定，会在多种非特异性诱导因素的刺激下由潜伏状态被激活，引起临床症状的反复。关于潜伏HSV以何种机制复活，研究者们提出了多种假说，但至今仍未有一个得到普遍认可的推论。近年来，HSV病毒潜伏相关转录体LAT成为了争论的中心，但由于实验手段的差异，关于LAT介导的潜伏HSV激活机理也是众说纷纭，尽早阐明LAT对于HSV病毒激活的相关机制，无论对于学术界还是临床治疗均意义重大。参考文献：1 Mohamed A.H,Dennis M.H,William T.R,He

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