如何做好Western-blot(免疫印迹)1

1、如何做好如何做好Western-blot（免疫印迹）（免疫印迹）-随意谈随意谈印记法印记法 印迹（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用探测物特异性检测未知样品的方法。 1975年，Southern将DNA转印到硝酸纤维素（NC）膜上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段，后来称这种方法为Southern印迹法。印记法Southern BlotNorthern BlotWestern BlotFar Western BlotDot BlotDNARNAProteinWestern-blot 高灵敏度、高特异性的蛋白检测 应用于绝大多数生物、医学实验室 成熟的技术、丰富的

2、方案选择主要步骤主要步骤样品制备电泳转膜封闭结合抗体发光（显色）信号检测样品制备样品制备 细胞裂解 蛋白溶解（可一步完成） 蛋白定量细胞裂解细胞裂解 离子型去垢剂（SDS） 非离子型去垢剂（N-P40，TritonX-100） Tris、NaCl、叠氮化钠、正钒酸钠等 蛋白酶抑制剂 EDTA、PMSF、PI cocktail等 超声 研磨 匀浆 反复冻融Laemmli Sample Buff.(161-0737 30ml)62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 5% b-ME, 25%Glycerol, 0.01% Bromophenol blue 变性蛋白变性蛋白N

3、ative Sample Buff.(161-0738 30ml)62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 40% Glycerol, 0.01% Bromophenol blue 非变性蛋非变性蛋白白35mm小盘：250ml 30mm中盘：500ml100mm大盘：1ml检测磷酸化蛋白：再加入检测磷酸化蛋白：再加入Na3VO4 0.1mM及及NaF 25mM 样品制备样品制备缓冲液缓冲液Tricine Sample Buff.(161-0739 30ml)200mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 40% Glycerol, 0.04% Coomassie blu

4、e 多肽多肽蛋白的定量 用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry 法三种方法，其中A280法灵敏度为0.2-2 mg/ml，但核酸可引起强干扰作用；Lowry 法灵敏度为5-100 g/ml，虽相对准确，但干扰物质多且反应速度慢，而且含DTT溶液不宜用此法；Bradford法灵敏度为25-200 g /ml，由于相对干扰物质较少，且反应时间仅需2分钟,故适合用于大多数研究的蛋白定量。 Bio-rad另有对一种适用于去垢剂增溶蛋白样品的比色测定的试剂盒DC Protein Assay Kit，该方法类似于常规的Lowry方法，但经过改良后，节省了操作时间。DC蛋白测

5、定只需要15分钟的温育时间，而且吸收值读数保持2小时的稳定。RC DC Protein Assay Kit蛋白测定是一种适用于含还原剂和去垢剂的蛋白测定，具有原来DC蛋白测定的特点，并能与更多的试剂兼容，简化了复杂蛋白样品溶液的定量测定。特殊的兼容物 - - Detergent Reducer &. Detergent样品制备样品制备定量定量 200800 nm Scanning mode Standard curves Kinetics Direct display PrinterSmartSpec plus SpectrophotometerProtein AssayRC DC P

6、rotein Assay Reducing agent compatible Detergent compatible电电 泳泳基质及交联剂基质： 丙稀酰胺（Acrylamide）交联剂： 基质及交联剂 T% C% 蛋白SDS-PAGE常用C：1：29，1：37.5 T%的线性分离范围：%100)()()(mlgg溶液总体积交联剂丙稀酰胺）交联剂（丙稀酰胺（）交联剂（100gggT线性分离范围5572127.53694102080121260151043C=1:29非变性体系非变性体系1配方积层胶4 A/B, 0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 0. 1% AP, 0. 04%

7、TEMED分离胶T A/B, 0.625M Tris-HCl, pH 8.8, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED样品缓冲液62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 40% 甘油, 0.01% 溴酚蓝电极缓冲液25 mM Tris, 192 mM甘氨酸, pH 8.3变性体系变性体系1配方积层胶4 A/B, 0.125M Tris-HCl pH 6.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分离胶T A/B, 0.625M Tris-HCl pH 8.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED样品缓冲液62.5 m

8、M Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 25% 甘油,0.01% 溴酚蓝电极缓冲液25 mM Tris, 192 mM 甘氨酸, 0.1% SDS, pH 8.3适合小分子蛋白分离的适合小分子蛋白分离的Tris-Tricine 体系体系1配方积层胶4 A/B, 0.745M Tris-HCl pH 8.45, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分离胶10 A/B*, 1M Tris-HCl pH 8.45, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED样品缓冲液200mM Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 40% 甘油, 0.0

9、4% 考马斯亮蓝G-250电极缓冲液100mM Tris, 100 mM Tricine, 0.1% SDS*建议选用C%=2.6%*可将阳极缓冲液换成0.2M Tris, 0.1% SDS预混电泳缓冲液预混电泳缓冲液Premixed Electrophoresis Buffers161-0732 10 x Tris/Glycine/SDS, 1 L161-0772 10 x Tris/Glycine/SDS, 5 L cube161-0734 10 x Tris/Glycine, 1 L161-0771 10 x Tris/Glycine, 5 L cube161-0744 10 x Tri

10、s/Tricine/SDS, 1 LSDS-PAGE主要设备主要设备Precision Plus ProteinTM 蛋白标准品 条带窄而清晰，分子量准确（经质谱验证），可用于蛋白分子量测算； 未预染的条带标记链亲和素(Streptavidin)亲和肽，可进行Western杂交检测； 包括未预染(161-0363)，预染全蓝(161-0373)，双色(161-0374)和彩染(161-0375) 每种标准品含10个条带，跨度从10KD250KD。未染标准品分子量测定Fig. 1. Approach for MW determination of an unknown protein. Lane

11、 1, 10 l of Precision Plus Protein unstained standards; lanes 27, a dilution series of an E. coli lysate containing a hypothetically unknown protein (GFP). Proteins were separated by Criterion 420% Tris-HCl gel and stained with Bio-Safe Coomassie stain. Precision Plus ProteinTM 预染标准品预染标准品r20.996转转 印

12、印印迹膜 硝酸纤维素硝酸纤维素(NC)膜：历史悠久，蛋白结合力不强，膜：历史悠久，蛋白结合力不强，载量较低载量较低Nitrocellulose:载量载量80-100mg/cm2，孔径，孔径0.2/0.45 mm 聚偏四氟乙烯聚偏四氟乙烯(PVDF)膜：蛋白结合力强，载量膜：蛋白结合力强，载量较大，使用广泛较大，使用广泛Immuno-BlotTM :载量载量150-160mg/cm2，适于反复洗脱。孔径，适于反复洗脱。孔径0.2mmSequi-BlotTM ：载量：载量170-200mg/cm2，蛋白结合更牢固，可用，蛋白结合更牢固，可用于蛋白测序或小分子转印，孔径于蛋白测序或小分子转印，孔径0

13、.2mm 尼龙尼龙(Nylon)膜膜: 带正电荷，结合力最强，载量最带正电荷，结合力最强，载量最大，尤其适于很小分子转印和生物素显色大，尤其适于很小分子转印和生物素显色 Zeta-Probe: 载量载量480mg/cm2，蛋白结合最牢固，封闭只需，蛋白结合最牢固，封闭只需5脱脂奶粉脱脂奶粉缓冲液 Towbin 缓冲液: 25mM Tris, 192mM 甘氨酸, 20% (v/v) 甲醇. Towbin缓冲液+SDS: 25mM Tris, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 20% (v/v)甲醇. CAPS缓冲液: 10mM CAPS, 10%甲醇. 乙酸缓冲液: 0.7%乙酸不同蛋白

14、须用不同缓冲体系和膜蛋白测序Towbin,CAPSNC,PVDF高分子蛋白Towbin-SDS,CAPSNC,pH!小分子蛋白或肽 Towbin,CAPSNC,PVDF碱性蛋白(pI9)在SDS-PAGECAPS,碳酸-Bjerrum S-NielsenNC,PVDF碱性蛋白(pI9)在native-PAGE0.7% HACNC,PVDF糖蛋白Towbin,CAPS-SDS/-,碳酸盐, Bjerrum ,S-NielsenNC,PVDF槽式转印系统（湿转）槽式转印系统（湿转）1.Mini Trans-Blot转印槽2. Criterion转印仪3.Trans-Blot 转印槽4.Trans-

15、Blot Plus转印槽半干转印系统半干转印系统1.Trans-Blot SD 半干转印槽微量过滤及筛选系统微量过滤及筛选系统1.Bio-Dot 和 Bio-Dot 微量过滤器2.Mini-Protean II多道筛选仪真空转印系统真空转印系统1.785 型真空转印仪 (DNA & RNA 转印至尼龙膜)转印设备转印设备电电 转转 印印电转印+- 电场强度决定转印的效率电场强度决定转印的效率 场强越高，转印越快场强越高，转印越快 电场强度又取决于电极间距离电场强度又取决于电极间距离 距离越短，场强越高距离越短，场强越高.半干转印特有的不连续转印半干转印特有的不连续转印 缓冲液被隔绝，允

16、许正、负极间缓冲液缓冲液被隔绝，允许正、负极间缓冲液不同不同 阴极阴极(胶面胶面)缓冲液含缓冲液含0.1%SDS，不含甲，不含甲醇，利于转印醇，利于转印 阳极阳极(膜面膜面)缓冲液不含缓冲液不含SDS，含，含20甲甲醇，防止转过醇，防止转过 配合配合PVDF膜可提高转膜效率，减少损失膜可提高转膜效率，减少损失*5储液：36.34 g Tris, 44.26 g CAPS, 加水至 1 L一个新型不连续转膜体系 缓冲液： 1.5mA/cm2 (电压不超过25V)，转印30-60min阴极缓冲液阳极缓冲液5Tris-CAPS储液*20ml20ml10% SDS1ml-Methanol-15mlH2

17、O79ml65ml巧妙的改进，出色的结果 左：10%SDS PAGE后用前述不连续缓冲体系半干转印，转印后印迹膜用考马斯蓝R250染色；中：转膜后凝胶考染；右：Western Blot检测该印迹膜上p47蛋白。泳道1、2分别为Kaleidoscope 蛋白标准品和细胞全蛋白 1 2 1 2 216kD132kD特殊转印要求下仪器和试剂的选择应用应用转印缓冲液转印缓冲液印迹膜印迹膜推荐仪器推荐仪器蛋白测序CAPSPVDF/NC槽式转印大分子蛋白Towbin with SDS, 不连续体系PVDF/NC槽式转印小分子蛋白或多肽Towbin，CAPSPVDF槽式转印碱性(pI9), 变性胶CAPSN

18、C/PVDF槽式/半干转印碱性(pI9), 非变性胶0.7% 乙酸NC/PVDF槽式转印糖蛋白Towbin(with SDS), CAPSNC/PVDF槽式/半干转印蛋白多糖TowbinNC/PVDF槽式/半干转印两种转印系统的比较半干转半干转湿转湿转每块每块mini胶所胶所需缓冲液的量需缓冲液的量20ml500700ml所需时间所需时间30分钟分钟(大分子量蛋大分子量蛋白应适当延长白应适当延长)3060分钟分钟(很大分子很大分子量蛋白适当延长量蛋白适当延长)冰浴冰浴不需要不需要需要需要适用范围适用范围150KD无限制无限制电压,电流,功率 设置恒电压时,电阻下降,电流加大,会产高热,须降温(

19、半干除外) 设置恒电流时,电压和功率随电阻下降而下降,产热也会降低,以后随场强下降,转印速度也会下降. 设置恒功率时,电流随电阻下降而升高,升高的速度较恒电压时低,所以设置恒功率近似恒电流Semi-dry blot Transfer mini gels for 1530 minutes at 1015 V. Large gels can be transferred for 30 minutes to 1 hour at 1525 V. Do not exceed 25 V with this instrument. A current limit (3 mA/cm2 for large ge

20、ls; 5.5 mA/cm2 for mini gels) is recommended to prevent excessive heating during the run.湿转用Bio-Dot 或 Bio-Dot SF进行斑点或狭缝印迹 直接真空抽滤上样至印迹膜 方便快速，可高温消毒，适于高通量筛选转膜后检测 丽春红丽春红S S染色染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 注：染色法不适合蛋白结合力较强的注：染色法不适合蛋白结合力较强的PVDF膜和尼龙膜膜和尼龙膜封闭 目

21、的：封闭膜上多余的蛋白结合位点，减目的：封闭膜上多余的蛋白结合位点，减少非特异性反应少非特异性反应 封闭液封闭液脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSA (5) 溶于溶于TBST (100mmol/L Tris-Cl, 9g/L NaCl, 5g/L Tween 20)溶液中溶液中 封闭时间：封闭时间：37一小时，一小时，4过夜过夜常用封闭液试剂膜浓度备注明胶NC1-3%明胶加热溶解脱脂奶,BLOTTONC,PVDF0.5-5%PVDF所需浓度要高BSANC,PVDF1-5%PVDF所需浓度要高TWEEN20NC0.05-0.3%可能有杂带一抗、二抗孵育 根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭液配制的

22、一抗液与滤膜温育。37一小时，4 过夜 倒掉一抗溶液，用TBST液滤膜3次，每次5min 加入用封闭液配制的二抗溶液，37一小时，4过夜 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3-5次，每次10min。印迹膜检测全蛋白检测负离子染色 主要有考马斯亮蓝主要有考马斯亮蓝-R250和氨基黑和氨基黑 优点：廉价、快速，缺点：灵敏度优点：廉价、快速，缺点：灵敏度低，膜易变形低，膜易变形 氨基黑染色背景较低，脱色容易，氨基黑染色背景较低，脱色容易，优于考马斯蓝优于考马斯蓝 常用的有Sypro Ruby等 灵敏度高(2-8ng)，线性范围宽，超过1000倍 可用于蛋白测序等 价格相对昂贵，需要UV成像仪或激光扫描仪全蛋白检测荧光染色化学发光底物被HRP或AP分解后发光，被X光片或成像系统