实验2氨基酸薄层层析

1、如何分离鉴定氨基酸混合液？陈 健生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心氨基酸的薄层层析(Thin layer chromatography of amino acids)实验目的实验目的 掌握薄层层析法的一般原理。掌握薄层层析法的一般原理。 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 掌握如何根据移动速率（掌握如何根据移动速率（R Rf f值）来鉴定值）来鉴定 被分离的物质（即氨基酸混合液）。被分离的物质（即氨基酸混合液）。层析基本概念层析基本概念 层析技术层析技术是利用化合物中各组分的物理性质（是利用化合物中各组分的物理性质（如溶解度、

2、吸附能力、分子形状和大小、分子如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的不同，使极性、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度而最终从固定相上流过，不同组分以不同速度而最终被分离。被分离。 特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯化，也可物质。不仅可用于少量物质的分离纯化，也可用于大量物质的分离纯化和制备。用于大量物质的分离纯化和制备。层析基本概念层析基本概念 固定相固定相：固定相是层析

3、的一个基质。包括：固定相是层析的一个基质。包括固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）和液体物质（如固定在硅胶或纤维素等）和液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与相关的化合物上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。 流动相流动相：在层析过程中，推动固定相上待：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂层析时称为展层剂。层析技术的分类层析

4、技术的分类（1）按两相所处状态，可分为液相层析和气相层析）按两相所处状态，可分为液相层析和气相层析，前者以液体为流动相，后者以气体为流动相。，前者以液体为流动相，后者以气体为流动相。（2）按操作形式不同，可分为柱层析、薄层层析和）按操作形式不同，可分为柱层析、薄层层析和纸层析。纸层析。（3）按层析的原理不同，可分为吸附层析、分配层）按层析的原理不同，可分为吸附层析、分配层析、凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。析、凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。今天要做的试验，根据原理属于吸附层析，根据操作形式又属于薄今天要做的试验，根据原理属于吸附层析，根据操作形式又属于薄层层析，合到一起叫：层层析，合

5、到一起叫：吸附薄层层析。吸附薄层层析。试验过程试验过程2cm1cm Ala Arg Gly Mix轻触疾起轻触疾起操作步骤操作步骤点样点样操作步骤操作步骤 展层、显色展层、显色Ala Arg Gly Mix试样展开过程试样展开过程实验原理实验原理 1. 1.薄层层析法是色谱分析技术的一种薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶

6、解度不一样，点在薄板上的基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸解吸-再吸附再吸附-再解再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析硅胶吸附薄层层析实验原理实验原理 吸附薄层中常用的吸附剂为吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶氧化铝和硅胶 硅胶：表达式为硅胶：表达式为SiO2XH2OSiO2XH2O。层析用硅胶是一种。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极多孔性物质，它的

7、硅氧环交链结构表面上密布极性性硅醇基（硅醇基（Si SiOHOH），），这种极性的硅醇基能和这种极性的硅醇基能和许多化合物形成许多化合物形成氢键氢键而产生吸附而产生吸附. .实验原理实验原理硅胶吸附薄层层析的特点：硅胶吸附薄层层析的特点： 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。性也与含水量呈负性相关。硅醇基显较弱的硅醇基显较弱的酸性酸性，因而，硅胶只能用，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。分离。硅胶的活化温度通常为硅胶的活化温度通常为105105110110，不，不

8、能过高。能过高。实验原理实验原理 2. 氨基酸与茚三酮的显色反应氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成茚三酮水化后生成水化茚三酮水化茚三酮，它与氨基，它与氨基酸的羧基反应生成酸的羧基反应生成还原茚三酮还原茚三酮、氨及醛，与、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成成紫红化合物紫红化合物而使氨基酸斑点显色。而使氨基酸斑点显色。实验原理实验原理3. 3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率用相对迁移率RfRf值（值（rate of flowrate of flow）来表示。）来表示。层析中，物

9、质沿溶剂运动方向迁移的距离层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为与溶液前沿的距离之比为RfRf值。值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（的，故移动速率（RfRf值）也是恒定的，因此可值）也是恒定的，因此可以以根据根据RfRf值来鉴定被分离的物质值来鉴定被分离的物质。实验材料实验材料 吸附剂：吸附剂：硅胶硅胶 粘合剂：粘合剂： 0.5%0.5%的羧甲基纤维素钠的羧甲基纤维素钠 氨基酸的异丙醇溶液氨基酸的异丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展开展开- -显色剂显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）（正丁醇

10、、乙酸、茚三酮溶液） 分析样品：分析样品：氨基酸混合液氨基酸混合液器器 材材 层析板、尺子、铅笔层析板、尺子、铅笔 烧杯、玻棒、量筒烧杯、玻棒、量筒 吹风机吹风机 毛细管、层析缸毛细管、层析缸 药匙药匙 烘箱烘箱操作步骤操作步骤薄层板的制备薄层板的制备 结果计算结果计算 Rf =斑点至原点距离斑点至原点距离溶剂前缘至原点距离溶剂前缘至原点距离 小心量出斑点中心至原点中心距小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的离，计算出它们的 值。值。 根据根据值，鉴定出混合样品中值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。氨基酸的种类，并绘出层析图谱。Rf值测量值测量数据记录及结果数据