神经干细胞的研究现状与应用前景

1、神经干细胞的研究现状与应用前景 主主 要要 内内 容容基本知识基本知识 神经干细胞的定义、特点、标志、分布及分化因素等基本知识神经干细胞的定义、特点、标志、分布及分化因素等基本知识成年神经干细胞的研究现状成年神经干细胞的研究现状研究方法研究方法 神经干细胞的来源、分离、培养及鉴定方法神经干细胞的来源、分离、培养及鉴定方法应用前景应用前景 神经干细胞技术在神经系统疾病治疗中的应用神经干细胞技术在神经系统疾病治疗中的应用 神经干细胞与神经心理学神经干细胞与神经心理学干细胞（干细胞（Stem cell，SC）是一类具有自我更新（）是一类具有自我更新（self-renewing）能力）能力的多潜能细胞

2、，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织合适的条件或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为器官，医学界称其为“万用细胞万用细胞”，也有人通俗而形象地称其为，也有人通俗而形象地称其为“干什么都行的细胞干什么都行的细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织如骨髓、脐带等。干细胞干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织如骨髓、脐带等。干细胞技术最显著的作用就是：能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的技术最显著的作用就是：能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细

3、胞、组织或器官。细胞、组织或器官。干细胞技术是近年现代生物科技继克隆技术、基因工程之后的第三干细胞技术是近年现代生物科技继克隆技术、基因工程之后的第三大科学成就。大科学成就。它不仅促使人们重新熟悉细胞生长与分化的基本生命原理，也为多它不仅促使人们重新熟悉细胞生长与分化的基本生命原理，也为多种难治性疾病的治疗带来了划时代的革命。种难治性疾病的治疗带来了划时代的革命。21世纪是生命科学的时世纪是生命科学的时代，也是为人类的健康长寿创造世界奇迹的时代，干细胞的应用将代，也是为人类的健康长寿创造世界奇迹的时代，干细胞的应用将有广阔前景。有广阔前景。(Okano et al. 2002)1 生长因子：生

4、长因子：FGF2（碱性成纤维细胞生长因子（碱性成纤维细胞生长因子2）在胚胎早期维持神经祖细胞的的生存，促进其增）在胚胎早期维持神经祖细胞的的生存，促进其增殖。殖。ECG（神经表皮生长因子）在发育较晚期促使神经祖细胞增殖和分化。（神经表皮生长因子）在发育较晚期促使神经祖细胞增殖和分化。BDNF（脑源性神经营养因子）及（脑源性神经营养因子）及IGF1（胰岛素样生长因子（胰岛素样生长因子1）主要促进祖细胞向神经元）主要促进祖细胞向神经元方向分化。方向分化。2 细胞因子：红细胞生成素、集落刺激因子、白介素家族等影响神经元的发育；细胞因子：红细胞生成素、集落刺激因子、白介素家族等影响神经元的发育；BMP

5、（骨架多型性蛋白）促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化。（骨架多型性蛋白）促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化。3 移植区域的信号：一是选择性调控，即信号只能调节干细胞的存活和增殖而不能影响移植区域的信号：一是选择性调控，即信号只能调节干细胞的存活和增殖而不能影响其分化方向。二是指导性作用，指特异性指导神经干细胞、祖细胞向特定谱系分化。其分化方向。二是指导性作用，指特异性指导神经干细胞、祖细胞向特定谱系分化。4神经干细胞和神经祖细胞自身产生多种调控信号。神经干细胞和神经祖细胞自身产生多种调控信号。5 Nestin基因和基因和Notch基因：人基因：人nestin基因第二个内含子中存在一个（基因

6、第二个内含子中存在一个（400bp区域对神区域对神经干细胞起增强作用。这个增强子也对早期神经干细胞其他基因表达起作用，包括经干细胞起增强作用。这个增强子也对早期神经干细胞其他基因表达起作用，包括Notch基因。基因。Notch基因是在中枢神经系统发育过程中确定神经元数量的重要调控基因。基因是在中枢神经系统发育过程中确定神经元数量的重要调控基因。胚胎期胚胎期幼年期幼年期成年期成年期胚胎期：胚胎期：神经干细胞主要分布在大脑的皮层、纹状体、海神经干细胞主要分布在大脑的皮层、纹状体、海马、室管膜下层和中脑等区域。马、室管膜下层和中脑等区域。成年期：成年期：中枢神经系统仍有神经干细胞存在，只不过这些中枢

7、神经系统仍有神经干细胞存在，只不过这些细胞平时处于静止状态。成年脑区神经干细胞主细胞平时处于静止状态。成年脑区神经干细胞主要局限在海马齿状回、纹状体和环绕侧脑室的室要局限在海马齿状回、纹状体和环绕侧脑室的室脑膜下层。脑膜下层。海马齿状回侧脑室的室脑膜下层 尾状核豆状核背侧丘脑皮质皮质髓质髓质基底核基底核侧脑室侧脑室尾状核与豆状核合称纹状体尾状核与豆状核合称纹状体 以前的观点认为成年大脑中的神经元数量是以前的观点认为成年大脑中的神经元数量是稳定不变的，由这些神经元构成的神经网络结构稳定不变的，由这些神经元构成的神经网络结构是相对稳定的，神经结构上的可塑性仅发生在树是相对稳定的，神经结构上的可塑性

8、仅发生在树突、轴突和突触等部位。而目前对神经再生和成突、轴突和突触等部位。而目前对神经再生和成年神经干细胞的研究增加了新的认识。年神经干细胞的研究增加了新的认识。小结 成年海马的神经再生与海马功能有着密切关系。学习或奔跑可以改变动成年海马的神经再生与海马功能有着密切关系。学习或奔跑可以改变动物海马细胞存活或细胞增殖水平，从而增加海马的新生神经元的数目。紧张、物海马细胞存活或细胞增殖水平，从而增加海马的新生神经元的数目。紧张、滥用鸦片和癫痫发作等都可以影响到成年海马齿状回新生神经元的增殖和分滥用鸦片和癫痫发作等都可以影响到成年海马齿状回新生神经元的增殖和分化水平。人为减少海马颗粒样神经元的数目，

9、经过处理后的动物其海马依赖化水平。人为减少海马颗粒样神经元的数目，经过处理后的动物其海马依赖的记忆功能受到损害。的记忆功能受到损害。 成年海马神经干细胞产生的新生神经元不仅在形态上与成熟海马神经元成年海马神经干细胞产生的新生神经元不仅在形态上与成熟海马神经元相同，而且对突触刺激有动作电位反应，并且可以有效地整合到神经环路中相同，而且对突触刺激有动作电位反应，并且可以有效地整合到神经环路中去。去。 人们推测，这些由神经干细胞产生的新生神经元是参与其所在海马区域人们推测，这些由神经干细胞产生的新生神经元是参与其所在海马区域的正常功能。神经干细胞和学习记忆关系的研究是复杂的。尽管海马具有记的正常功能

10、。神经干细胞和学习记忆关系的研究是复杂的。尽管海马具有记忆的存储功能，但这种记忆的存储是短暂的，只是为皮层区域的长时程记忆忆的存储功能，但这种记忆的存储是短暂的，只是为皮层区域的长时程记忆做时空上的准备。做时空上的准备。controlkindledExamples of BrdU positive nuclei in hippocampal sections from control 正常情况下，成年啮齿类动物大脑中有大量的新生神经元不断正常情况下，成年啮齿类动物大脑中有大量的新生神经元不断产生，显然这些细胞是来补充已经缺失的神经元，这样成年大脑神经产生，显然这些细胞是来补充已经缺失的神经元，

11、这样成年大脑神经元数目才能保持相对稳定。研究表明在成年大脑神经再生区域里存在元数目才能保持相对稳定。研究表明在成年大脑神经再生区域里存在着普遍的神经元凋亡现象。神经再生活跃区域的死亡细胞数倍于大脑着普遍的神经元凋亡现象。神经再生活跃区域的死亡细胞数倍于大脑其他部位，因而干细胞增殖、祖细胞迁徙并且分化成神经元从而替代其他部位，因而干细胞增殖、祖细胞迁徙并且分化成神经元从而替代死亡的神经元。有人推测，中枢神经系统变性疾病形成的原因就是由死亡的神经元。有人推测，中枢神经系统变性疾病形成的原因就是由于内源性神经干细胞不能对这些疾病产生的信号起反应，内源性神经于内源性神经干细胞不能对这些疾病产生的信号起

12、反应，内源性神经干细胞不能替代变性的神经元，而最终导致老年性疾呆，癫痫，精神干细胞不能替代变性的神经元，而最终导致老年性疾呆，癫痫，精神分裂症等神经系统退行性疾病的发生。分裂症等神经系统退行性疾病的发生。 1. 成年神经再生和早期发育中的神经生成有哪些不同？成年神经再生和早期发育中的神经生成有哪些不同？ 2. 为什么神经再生只存在于成年大脑的某些特定的区域？为什么神经再生只存在于成年大脑的某些特定的区域？ 3. 这些区域的局部微环境对成年神经干细胞的迁徙和分化有这些区域的局部微环境对成年神经干细胞的迁徙和分化有些什么影响？些什么影响？ 4. 成年大脑的神经可塑性的功能意义？成年大脑的神经可塑性

13、的功能意义？ 5. 神经干细胞和认知等高级功能神经活动的关系？神经干细胞和认知等高级功能神经活动的关系？ 来源于神经组织来源于神经组织：目前从哺乳动物胚胎期大部分脑区、成年期的脑室下区、海马回：目前从哺乳动物胚胎期大部分脑区、成年期的脑室下区、海马回的颗粒下层、脊髓等部位均成功分离出神经干细胞的颗粒下层、脊髓等部位均成功分离出神经干细胞来源于胚胎来源于胚胎：胚胎干细胞：胚胎干细胞( embryonic stem cells ,ESCs) 、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞( embryonic germ cells ,EGCs) 等细胞的定向诱导分化而来。等细胞的定向诱导分化而来。来源于血液系统来源

14、于血液系统：骨髓间质干细胞：骨髓间质干细胞( bonemarrow mesenchymal stem cell s ,MSCs) 、成年多能祖细胞、成年多能祖细胞( multipotent adult progenitor cells ,MAPCs) 10 及脐血及脐血细胞细胞(umbilical cord blood) 11 。来源于永生化细胞系来源于永生化细胞系：C17. 2 细胞系细胞系12 、MHP36 细胞系细胞系13 、N T2 细胞系。细胞系。体核细胞转移技术获得神经干细胞体核细胞转移技术获得神经干细胞：将体细胞核植入去核的卵母细胞浆中：将体细胞核植入去核的卵母细胞浆中,再程序再

15、程序化后形成治疗性克隆化后形成治疗性克隆,让其发育到一定阶段后在相应部位获得神经干细胞让其发育到一定阶段后在相应部位获得神经干细胞,可重建组可重建组织相容性。织相容性。（1）反复传代法：取）反复传代法：取34个月龄的人胚胎纹状体或孕个月龄的人胚胎纹状体或孕 1416天小鼠、大鼠胚胎天小鼠、大鼠胚胎大脑，机械分离制作单细胞悬液。在含多种神经因子的无血清培养基中培养，大脑，机械分离制作单细胞悬液。在含多种神经因子的无血清培养基中培养，实现实现NSC的体外稳定有效扩增。经过长期培养反复传代可使的体外稳定有效扩增。经过长期培养反复传代可使NSC得到纯化。得到纯化。（2）流式细胞术：）流式细胞术：Sas

16、aki等采用流式细胞仪对约等采用流式细胞仪对约60种细胞表面抗原进行筛选，种细胞表面抗原进行筛选，结果发现分选出的具有结果发现分选出的具有CD133+/CE34+/CD45-（细胞表面抗原）的细胞为（细胞表面抗原）的细胞为NSC。（3）基因转导：）基因转导：Keyoung 等利用腺病毒为载体等利用腺病毒为载体,将置于归巢素和将置于归巢素和Msi1增强子和启增强子和启动子控制下的绿色荧光蛋白基因导入人胚胎细胞动子控制下的绿色荧光蛋白基因导入人胚胎细胞,然后对胚胎细胞进行体外培然后对胚胎细胞进行体外培养养,只有只有NSC能特异性地出现绿色荧光蛋白。再利用流式细胞仪进行荧光筛选能特异性地出现绿色荧光

17、蛋白。再利用流式细胞仪进行荧光筛选,能进一步将能进一步将NSC收集起来。收集起来。（4）免疫磁珠细胞分选法：利用磁珠表面的特异性抗体与）免疫磁珠细胞分选法：利用磁珠表面的特异性抗体与NSC表面抗原结合，表面抗原结合，在磁场作用下使结合磁珠的在磁场作用下使结合磁珠的NSC与其他细胞分离，从而得到较纯化的与其他细胞分离，从而得到较纯化的NSC。 培养的小鼠神经干细胞胚胎小鼠脑侧室胚胎小鼠纹状体Sakakibara(Sakakibara et al. 1996)E10E14Ventricular zone of spinal cordm-Msi-1nestin(Sakakibara et al. 1

18、996)对分离培养得到的对分离培养得到的NSC进行标记时发现：进行标记时发现：Nestin和和Musashi呈双重阳性呈双重阳性,且且随着随着NSC分化成为神经元分化成为神经元,二者的标记作用也消失二者的标记作用也消失,说明说明Musashi具有与具有与Nestin相似的特异性和种间保守性。相似的特异性和种间保守性。Nestin和和Musashi作为早期原始神经细胞的标志作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于物已被广泛地应用于NSC的鉴定。的鉴定。NSC原位诱导内源性原位诱导内源性NSC的自身激活的自身激活理论依据理论依据：大量体外和在体实验已经证实成年脑中存在：大量体外和在体实验已经证

19、实成年脑中存在NSC。研究影响。研究影响NSC增殖和分化的信号作用的实验证实：脑室管膜下区等部位的增殖和分化的信号作用的实验证实：脑室管膜下区等部位的NSC在脑损伤发生后能够增殖，并迁移到受损部位并分化成新的神经细胞，在脑损伤发生后能够增殖，并迁移到受损部位并分化成新的神经细胞，取代受损脑组织细胞。取代受损脑组织细胞。存在困难存在困难：在大多数情况下：在大多数情况下,仅由内源性干细胞产生的神经组织可能不仅由内源性干细胞产生的神经组织可能不足以替代损伤后缺失的神经组织足以替代损伤后缺失的神经组织,尤其在脊髓、纹状体等神经组织发生尤其在脊髓、纹状体等神经组织发生很少的部位。很少的部位。可能原因可能

20、原因： (1)原位诱导出功能特异的神经元可能需要多种刺激和特定原位诱导出功能特异的神经元可能需要多种刺激和特定细胞因子的作用。细胞因子的作用。(2)患者中枢神经系统的干细胞缺陷或无法激活。患者中枢神经系统的干细胞缺陷或无法激活。异体神经干细胞移植异体神经干细胞移植依据依据：临床试验表明，移植胎儿脑组织治疗神经系统退行性疾病可以明：临床试验表明，移植胎儿脑组织治疗神经系统退行性疾病可以明显改善症状；在体外培养扩增的显改善症状；在体外培养扩增的NSC移植到脑疾病动物模型脑内的实验移植到脑疾病动物模型脑内的实验表明，体外培养的表明，体外培养的NSC移植到脑内后能够迁移分化为特定部位的神经细移植到脑内

21、后能够迁移分化为特定部位的神经细胞，其分化方向与所处的微环境密切相关。胞，其分化方向与所处的微环境密切相关。问题问题：（）（）但胎脑的来源有限，受伦理和法律上的束缚，限制研究的发展；但胎脑的来源有限，受伦理和法律上的束缚，限制研究的发展；（）在研究细胞移植治疗帕金森病时发现（）在研究细胞移植治疗帕金森病时发现,在体外实验中没有必需的在体外实验中没有必需的因素干预下因素干预下, NSC自然分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的自然分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的0.5%5%。因此，诱导因此，诱导NSC向修复所需的神经功能向修复所需的神经功能(目的目的)细胞分化成为研究的细胞分化成为研究

22、的核心问题。核心问题。 基因治疗基因治疗基因治疗是通过特定载体相关外源基因导入体内基因治疗是通过特定载体相关外源基因导入体内,使其获得表达使其获得表达,达达到治疗由于某种基因缺陷或突变引起的疾病。到治疗由于某种基因缺陷或突变引起的疾病。目前神经系统基因治疗常用的靶细胞有：目前神经系统基因治疗常用的靶细胞有：(1)成纤维细胞成纤维细胞,来自间充来自间充质质,能在体外分裂增殖能在体外分裂增殖,具有较高的病毒感染率但植入脑后不能与宿主整具有较高的病毒感染率但植入脑后不能与宿主整合；合；(2)永生化神经祖细胞永生化神经祖细胞,体外容易进行基因转导和能与宿主整合等优体外容易进行基因转导和能与宿主整合等优

23、点点,但存在致癌的危险；但存在致癌的危险；(3)NSC来源于神经组织来源于神经组织,比永生化比永生化NSC更能保持更能保持原有的生物学特性原有的生物学特性,具有分化能力和更好的组织相容性具有分化能力和更好的组织相容性,可以整合到宿主可以整合到宿主脑组织并向周围迁移脑组织并向周围迁移,不形成肿瘤等。不形成肿瘤等。NSC具有稳定的生物学性状具有稳定的生物学性状,建系以后可以获得均一的建系以后可以获得均一的遗传背景遗传背景,具有组织和种属特异性，可作为神经系统疾病的具有组织和种属特异性，可作为神经系统疾病的药物筛选平台。利用药物筛选平台。利用NSC的多向分化潜能的多向分化潜能,可筛选出控制和可筛选出

24、控制和促进促进NSC向终末细胞分化的药物。向终末细胞分化的药物。神经系统疾病的药物筛选平台神经系统疾病的药物筛选平台神经干细胞用于治疗的可能机理神经干细胞用于治疗的可能机理、患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集、患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神细胞的损

25、伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位。经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位。、神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复。、神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复。、神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路、神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路传统的药物治疗效果不令人满意，吃药只可暂时性的控制疾病，一传统的药物治疗效果不令人满意，吃药只可暂时性的控制疾病，一旦停药，病症复现甚至更严重。常年服药不仅让患者痛苦不已，而且旦停药，病症复现甚至更严重。常年服药不仅让患

26、者痛苦不已，而且对身体造成极大的危害，导致对身体造成极大的危害，导致 其他严重疾病的并发。药物不具备激活其他严重疾病的并发。药物不具备激活脑神经细胞的功能是根本原因，所以要想从根本上治疗脑病等神经系脑神经细胞的功能是根本原因，所以要想从根本上治疗脑病等神经系统疾病，借助外界移植神经干细胞是唯一有效的方法。统疾病，借助外界移植神经干细胞是唯一有效的方法。 科学研究证明了神经干细胞的定向分化性，使修复和替代死亡的神科学研究证明了神经干细胞的定向分化性，使修复和替代死亡的神经细胞成为现实。为了减少神经损伤的后遗症，延缓或抑止疾病的进经细胞成为现实。为了减少神经损伤的后遗症，延缓或抑止疾病的进一步发展

27、，取得更好的恢复效果，从根本上修复和激活死亡神经细胞一步发展，取得更好的恢复效果，从根本上修复和激活死亡神经细胞是十分必要的。是十分必要的。神经干细胞移植后神经是否存在有免疫反应神经干细胞移植后神经是否存在有免疫反应? 神经干细胞移植是否有产生肿瘤的可能神经干细胞移植是否有产生肿瘤的可能? 神经干细胞脑内移植的最佳时机是什么神经干细胞脑内移植的最佳时机是什么?虽然神经干细胞在取得一定进展虽然神经干细胞在取得一定进展,但大多是在动物实验上但大多是在动物实验上,应用于临床还需一应用于临床还需一段时间。段时间。目前目前,神经干细胞的增殖、分化及定向、远距离迁移的调控机制还不清楚。神经干细胞的增殖、分化及定向、远距离迁移的调控机制还不清楚。移植用细胞类型是选择神经干细胞还是定向诱导后的成熟细胞或介于两者之移植用细胞类型是选择神经干细胞还是定向诱导后的成熟细胞或介于两者之间的祖细胞间