第2节 基本原理与主要分离类型

1、2022-5-21第第十一十一章章高效液相色谱分高效液相色谱分析法析法一、液一、液- -固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph二、液二、液- -液分配色谱液分配色谱liquid- liquid partition chromatograph三、离子交换色谱三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph四、离子色谱四、离子色谱ion chromatograph五、离子对色谱五、离子对色谱ion-pair chromatograph六、排阻色谱六、排阻色谱size- exclusion chromatograph七、亲和

2、色谱七、亲和色谱(AC)(AC)Affinity chromatograph第二节第二节主要分离类型与原理主要分离类型与原理high performance liquid chromatographbasic principle and main separating typesHPLC液-固吸附液-液分配正相色谱反相色谱一般反相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱一般离子交换色谱离子色谱氨基酸分析空间排斥色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱假相色谱胶束色谱环糊精色谱亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳键合相色谱2022-5-21一、一、 液液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorpt

3、ion chromatography 固定相固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂； 流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂，相似相溶，即极性大的试样用较强的流动相，反之亦然。 基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2022-5-21 吸附剂含水量是控制吸附剂活性，影响溶质保留的重要因素。2022-5-21 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要

4、它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相（溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:Xs + nMmXm +nMs吸附解吸2022-5-21二、二、 液液-液分配色谱液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相固定

5、相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。2022-5-212022-5-21 （1）非极性键合相 （2）弱极性键合固定相 （3）极性键合相2022-5-21 表面基团为非极性羟基，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基（C1）、苯基等。 常用于反相色谱 非极性键合相的烷基链越长，稳定性越好，溶质的K越大，载样量越高，分离选择性越好。2022-5-21时间，时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3

6、-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯2022-5-21（2）弱极性键合固定相）弱极性键合固定相 常见的有醚基和二羟基键合相常见的有醚基和二羟基键合相 可用于正相或反相色谱可用于正相或反相色谱（3）极性键合相）极性键合相n氨基键合相： 硅胶-氨丙硅烷基Si(CH2)3NH2 氰基键合相： 硅胶-氰乙硅烷基Si(CH2)2CN 一般用于正相色谱一般用于正相色谱2022-5-21国产：YWG-C18H37 YQG-C18H37 YWG-CN YQG-NH2 YWG-C6H5进口：Spherisorb ODS Lichrosorb -CN 2022-5-21特点： 1）不易流失； 2）热稳定

7、性好； 3）化学性能好：可键合不同官能团，提高选择性； 4）载样量大； 5）适于梯度洗脱存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；使用时应注意：1）流动相pH应在28，否则会引起硅胶溶解2）不同厂家，不同批号的同一类型键合相也可能表现不同的色谱特性。2022-5-212022-5-212022-5-21三、三、 离子交换色谱离子交换色谱ion-exchange chromatography 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定

8、相，采用碱性水溶液； 基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2022-5-21 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换

9、： 阴离子交换： Xm+ YRs+_Y+mX+Rs+_X_mYR+s_+Y_m+X_R+s2022-5-21 凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。 2022-5-21四、四、 离子色谱离子色谱ion chromatography 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。2022-5-21五、五、2022-5

10、-21 阴离子分离阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 色谱条件色谱条件：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。2022-5-21六、六、 排阻色谱色谱排阻色谱色谱size- exclusion chromatography 固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中

11、速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 2022-5-21七、七、 亲和色谱亲和色谱(AC) Affinity chromatograph 原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2022-5-21八八、液相色谱的流动相、液相色谱的流动相 mobile phases of LC 液相色谱的流动相

12、又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； 1、流动相特性、流动相特性1）与固定相不发生化学反应。2）对试样有适宜的溶解度。使k在1-10范围内。3）与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。2022-5-214）高纯度。 否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；5）低的粘度。 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

13、2022-5-212. 2. 流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2022-5-213. 3. 流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2022-5-212022-5-211、相对分子量分子量2000，凝胶色谱柱分子量2000，但同时分