酶工程学-第四、五周生物合成

1、第三章 酶的生物合成法生产经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，获得所需要的酶的技术过程,称为酶的生物合成法生产酶的生物合成法生产。第一节 细胞的选择优良的产酶细胞应具备的条件优良的产酶细胞应具备的条件 1. 繁殖快,产酶量高，有利于缩短生产周期。2. 能在便宜的底物上良好生长。3. 产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。4. 产生的酶容易分离纯化。5. 不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活性物质的微生物，才能确保酶生产和应用的安全。 一、微生物一、微生物细菌（bacteria）放线菌（actinomycetes）霉菌（fungi）酵

2、母（yeast）枯草芽孢杆菌细胞成杆状，（0.70.8）m*（23） m，单个，无荚膜，周生鞭毛，运动，G+，菌落粗糙，不透明。污白色或微带黄色。-淀粉酶蛋白酶-葡聚糖酶碱性磷酸酶等代表菌种：AS1.398产酶种类：大肠杆菌细胞成杆状，0.5m*（13） m，无芽孢，G-，菌落从白色到黄色，光滑闪光，扩展。谷氨酸脱羧酶天冬氨酸酶苄青霉素酰化酶基因工程研究用酶等产酶种类：一般生产胞内酶黑曲霉青霉根霉啤酒酵母米曲霉、木霉、毛霉、链霉菌、假丝酵母二、植物细胞P38 表3-1三、动物细胞CHOA549B16spleen第二节 培养基的配制培养基培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混

3、合物。 固体培养基半固体培养基液体培养基平板培养基斜面培养基培养基的分类：按形态分类保藏培养基种子培养基生长培养基发酵培养基产酶培养基微生物培养基植物培养基、动物培养基按用途分类天然培养基合成培养基麦芽汁培养基马铃薯培养基血清培养基按主要营养成分来源分类一、培养基的基本组分一、培养基的基本组分碳源氮源无机盐生长因素（一）（一） 微生物细胞的化学组成微生物细胞的化学组成大量元素大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁（其中前六种占细菌细胞干重的97%）。微量元素微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍 、硼。 二、微生物培养基二、微生物培养基化学元素:微生物细胞中几种主要元素的含

4、量（干重的百分数） 元素元素 细菌细菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 碳碳 50 49.8 47.9 氮氮 15 12.4 5.2 氢氢 8 6.7 6.7 氧氧 20 31.1 40.2 磷磷 3 硫硫 1 微生物细胞物质中灰分元素含量的百分比微生物细胞物质中灰分元素含量的百分比灰分元素灰分元素固氮菌固氮菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌P2O5SO3K2ONa2OMgOCaOFe2O3SiO2CuO4.950.292.410.070.820.890.08-3.540.0392.34-0.4280.3830.0350.093-4.850.112.811.120.380.190.160.04-（二）元素在细胞内

5、存在形式：（二）元素在细胞内存在形式：3 3水：水：约占细胞总重70%90%，以游离水和结合水两种形式存在1 1有机物有机物：蛋白质、糖、脂类、核酸、维生素及其降解产物. 2 2无机物无机物：1)参与有机物组成， 2)单独存在于细胞质内以无机盐的形式存在. 游离水：干重法可测得； 结合水：不易蒸发、不冻结、也不能渗透, 占水总量的17%28% 。 表42 微生物细胞的化学组成 主要成分主要成分 细菌细菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 水分水分 7585 7080 8590（占细胞鲜重的（占细胞鲜重的%） 蛋白质蛋白质 5080 3275 1415 占占 细细 碳水化合物碳水化合物 1228 2763

6、 740 胞胞 干干 脂肪脂肪 520 215 440 重重 的的 核酸核酸 1020 6 8 1 % 无机盐无机盐 230 3.87 612（三）微生物细胞化学组成含量的变化（三）微生物细胞化学组成含量的变化此组成可因菌种的种类、菌龄、培养基组成、培养条件、分析方法等而有所不同。定义：定义：凡可被用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。功能：提供合成细胞物质及代谢物的原料;并为整个生理活动提供所需要能源（异养微生物）。种类:无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。有机含碳化合物：糖与糖的衍生物（多糖：如淀粉、 麸皮、米糠等；饴糖；单糖）,脂类、 醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物 以及各种

7、含氮的化合物。类型元素水平 化合物水平 培养基原料水平有机碳CHONX复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉等CHON多数氨基酸、简单蛋白质等一般氨基酸、明胶等CHO糖、有机酸、醇、脂类等葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等CH烃类天然气、石油及其不同馏份、石蜡油等无机碳C(?)COCO2CO2COXNaHCO3NaHCO3、CaCO3、白垩等微生物的碳源谱氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用

8、氨基酸作为能源物质。 （五）氮源（五）氮源微生物的氮源谱类类型型 元素水平元素水平化合物水平化合物水平培养基原料水平培养基原料水平有有机机氮氮NCHOX复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、酵母膏、饼牛肉膏、酵母膏、饼粕粉、蚕蛹粉等粕粉、蚕蛹粉等NCHO尿素、一般氨基酸、简单蛋尿素、一般氨基酸、简单蛋白质等白质等尿素、蛋白胨、明胶尿素、蛋白胨、明胶等等无无机机氮氮NHNH3、铵盐等、铵盐等(NH4)2SO4等等NO硝酸盐等硝酸盐等KNO3等等NN2空气空气1.1.氮源的利用顺序氮源的利用顺序:N.C.H.O或N.C.H.O .XN.HN.ON2.2.氨基酸自养型微生物：氨基酸自养型微生物

9、：不需要以氨基酸作氮源，能把尿素、铵盐、硝酸盐甚至氮气等简单氮源自行合成所需要的一切氨基酸的微生物。3.3.氨基酸异养型微生物氨基酸异养型微生物：需要从外界吸收现成的氨基酸作氮源的微生物。迟效氮源：迟效氮源：蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用。速效氮源：速效氮源：无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用。实验室常用的氮源实验室常用的氮源：碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。生产上常用的氮源：生产上常用的氮源：硝酸盐、铵盐、尿素、氨以及蛋白含量较高的鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆等。 氮源的种类氮源的种类 能源：能源

10、：指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 有机物：化能异养微生物的能源（同碳源） 化学物质 能源谱能源谱 无机物：化能自养微生物的能源（不同于碳源） 辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源（六）能源（六）能源 微生物的能源谱：微生物的能源谱： 化能自养微生物的能源物质化能自养微生物的能源物质：都是一些还原态的无机物质，例如：NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+ 等，能利用这些物质作为能源的全部是细菌，如：硝酸细菌、亚硝酸菌、硫化细菌、硫细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。这些无机养料常常是双功能的（如： NH4+ 既是硝酸细菌的能源，又是它的氮源。） 有机营养物

11、有机营养物常有双功能或三功能作用，既是异养微生物的能源，又是它们的碳源或氮源。 光辐射能：是单功能的，只为光能微生物提供能源。 还原态的NH4:是双功能营养物（能源、氮源） 氨基酸：三功能营养物（碳源、氮源、能源）是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。主要包括： （七）生长因子（七）生长因子（growth factorgrowth factor）维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶（碱基）及其衍生物，此外还有甾醇、 胺类、脂肪酸等。缺乏合成生长因子能力的微生物称为“营养缺陷型”微生物。 无机盐：无机盐： 是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们为机体生长提供多种重要的生

12、理功能，包括大量元素和微量元素。（八）无机盐（八）无机盐大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。 （微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L）微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等。 （微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L） 一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。 细胞内一般分子成分（P、S、Ca、Mg 、Fe等） 一般功能 渗透压的维持（Na+等） 生理调节物质 酶的激活剂（M g2+等） 大量元素 pH的稳定无 化能自养菌的能源（S、Fe2+、NH4+、NO2-等）机 特殊功能 盐 无氧呼吸时的氢受体（NO

13、3-、SO42-等） 酶的激活剂（Cu2+、Mn2+ 、Zn2+等） 微量元素 特殊分子结构成分（Co、Mo等）无机盐的生理功能无机盐的生理功能无机元素的来源和功能无机元素的来源和功能元素人为提供形式 生 理 功 能PKH2PO4、K2HPO4核酸、磷酸和辅酶的成分SMgSO4含硫氨基酸、含硫维生素成分KKH2PO4、K2HPO4酶的辅因子、维持电位差和渗透压NaNaCl维持渗透压、某些细菌和蓝细菌需要CaCa(NO3)2、CaCl2胞外酶稳定剂、蛋白酶辅因子、细菌芽孢和真菌孢子形成MgMgSO4固氮酶辅因子、叶绿素成分FeFeSO4Cyt成分；合成叶绿素、白喉毒素和氯高铁血红素所需MnMnS

14、O4超氧化物歧化酶、氨肽酶、L-阿拉伯糖异构酶等的辅因子CuCuSO4氧化酶、酪氨酸酶的辅因子CoCoSO4VB12复合物的成分、肽酶的辅因子ZnZnSO4碱性磷酸酶、脱氢酶、肽酶、脱羧酶辅因子Mo(NH4)6Mo7O24固氮酶和同化型及异化型硝酸盐还原酶的成分水分是生物细胞的主要化学成分，其重要的生理功能表现在下列几个方面：（九）水（九）水1. 细胞的构成成分2. 良好的溶剂，一系列生理生化反应的反应介质3. 参与许多生理生化反应4. 有效地控制细胞内的温度变化几种生物的几种生物的游离水含量游离水含量人体：人体：60%海蛰：海蛰：96%微生物微生物孢子孢子营养体营养体霉菌孢子：霉菌孢子：39

15、%细菌芽孢：细菌芽孢：皮层：皮层：70%核心：极低核心：极低细菌：细菌：80%酵母：酵母：75%霉菌：霉菌：85%水在细胞中有两种存在形式： 结合水和游离水. 不同细胞及不同细胞结构中游离水的含量有较大差别：三、植物细胞培养基三、植物细胞培养基1. 需要大量无机盐：P、S、N、K、Na、Ca、Mg、Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I2. 需要多种维生素和植物生长激素3. 氮源一般为无机氮4. 碳源一般为葡萄糖四、动物细胞培养基四、动物细胞培养基1. 氨基酸2. 维生素3. 无机盐4. 葡萄糖5. 激素6. 生长因子P44 表3-7第三节第三节 产酶工艺条件及其调节控制产酶工艺条件及其调节控制

16、P45 图3-1一、细胞活化与扩大培养一、细胞活化与扩大培养细胞活化细胞活化：保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活力，这就叫细胞的活化。 种子培养基：用于细胞扩大培养的培养基。氮源丰富碳源少温度、pH、溶解氧接种量：110% 二、二、pH调节调节1.细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH值往往不同，通常接近于该酶反应的最适pH。2.有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。3.培养基的pH在细胞生长繁殖和代谢物产生的过程中往往会发生变化。 三、温度的调节控制三、温度的调节控制1.细胞发酵产酶的最适温度与

17、最适生长温度有所不同，而且往往低于最适生长温度。2.有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同的温度条件。五、溶解氧的调节控制五、溶解氧的调节控制调节溶解氧的方法：（1）调节通气量（2）调节氧的分压（3）调节气液接触时间（4）调节气液接触面积（5）改变培养基的性质第四节第四节 微生物发酵产酶微生物发酵产酶一、微生物产酶的方式及特点一、微生物产酶的方式及特点1.固体培养发酵优点：设备简单、操作方便、麸曲中酶浓度较高、适合霉菌培养发酵缺点：劳动强度大、原料利用率低、生产周期长2.液体深层发酵3.固定化细胞4.固定化原生质体二、提高酶产量的措施二、提高酶产量的措施1.添加诱导物酶的作用底物酶的反应产物酶

18、的底物类似物2.控制阻遏物的浓度3.添加表面活性剂4.添加产酶促进剂三、酶发酵动力学三、酶发酵动力学（一）酶生物合成模式P52 图3-2P52 图3-3（二）各种酶生物合成模式的特点（二）各种酶生物合成模式的特点1.同步合成型例：单宁诱导米曲霉合成单宁酶1.生物合成可以诱导，但不受分解代谢阻遏物和反应产物阻遏。2.酶所对应的mRNA很不稳定。特点：P53 图3-42. 延续合成型例：果胶诱导黑曲霉合成聚半乳糖酸酶1.生物合成可以诱导，但不受分解代谢阻遏物和反应产物阻遏。2.酶所对应的mRNA很稳定。特点：P54 图3-53.中期合成型例：枯草杆菌合成碱性磷酸酶1.生物合成受反馈抑制。2.酶所对应的mRNA不稳定。特点：P54 图3-64. 滞后合成型1.酶在对数期不合成。2.酶所对应的mRNA稳定。例：黑曲霉合成酸性蛋白酶特点：第五节第五节 动、植物细胞发酵产酶动、植物细胞发酵产酶一、