第二章生物制药工艺技术基础3ppt课件

1、二、动物细胞工程制药技术根底二、动物细胞工程制药技术根底一动物细胞的获得一动物细胞的获得 供消费生物技术药物的动物细胞有供消费生物技术药物的动物细胞有3类；类； 1、原代细胞、原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织器官，经过分散、原代细胞是直接取自动物组织器官，经过分散、消化制得的细胞悬液。消化制得的细胞悬液。 2、二倍体细胞系、二倍体细胞系 原代细胞经过传代、挑选、克隆，从而由多种细原代细胞经过传代、挑选、克隆，从而由多种细胞成分的组织中挑选强化具有一定特性的细胞株。胞成分的组织中挑选强化具有一定特性的细胞株。 其特点是：其特点是： 染色体组织依然是染色体组织依然是2n的模型；的模型； 具有明

2、显贴壁依赖和接触抑制的特性：具有明显贴壁依赖和接触抑制的特性： 具有有限的增殖才干，普通可延续传代培育具有有限的增殖才干，普通可延续传代培育50代；代； 无致癌性。二倍体细胞通常由胚胎组织中获取。无致癌性。二倍体细胞通常由胚胎组织中获取。 3、转化细胞系、转化细胞系 这类细胞经常因染色体的断裂而变成异倍体，这类细胞经常因染色体的断裂而变成异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获得无限繁衍的才从而失去了正常细胞的特点，而获得无限繁衍的才干。这种转化进程可以是自发的，也可以经过人为干。这种转化进程可以是自发的，也可以经过人为的方法进展的转化。的方法进展的转化。 另外，从动物肿瘤组织中建立的细胞系也是

3、转化细胞，转化细胞具有无限生命力，倍增时间较短，培育条件要求较低，适于大规模消费培育 。二动物细胞培育条件 营养、pH及温度是细胞生长所要求的重要条件，培育细胞的最适温度为370.5，偏离此温度，细胞的正常生长及代谢将会遭到影响。细胞培育的最适pH 7.27.4间。 细胞生长代谢离不开气体，培育瓶中的O2与CO2 ，是以保证细胞体内代谢活动的进展，但作为代谢产物CO2 在培育环境中还有调理pH的作用， CO2培育箱可以维持一定比例的CO2 ，使培育环境中的氢离子浓度坚持恒定。 在保证细胞浸透压的情况下，培育液里的成分要满足细胞进展代谢所需求的各种组成，如各种必需氨基酸和非必需氨基酸、维生素、碳

4、水化合物及无机盐类等，只需满足了这些根本条件，细胞才干在体外正常存活、生长。 另外，在单克隆抗体实验培育中参与一些豢养细胞，或在换液时留一些原培育液，也有利于细胞生长。 各种合成培育基给细胞培育提供了方便，但单纯采用合成培育基，细胞还不能很好地增殖，甚至细胞不贴壁生长，因此运用时常要添加510小牛血清，对杂交瘤细胞的培育添加胎牛血清要达l020， 其运用有几方面：其运用有几方面： 提供细胞生长所需的条件生长因子和激素。提供细胞生长所需的条件生长因子和激素。 提供细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；提供细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子； 提供识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋提供识别金属、激素、

5、维生素和脂类的结合蛋白；白； 提供细胞生长所需的脂肪酸和微量元素。提供细胞生长所需的脂肪酸和微量元素。 为顺应大规模细胞培育，开展高技术生物制品，为顺应大规模细胞培育，开展高技术生物制品，近代还大力研讨无血清培育基。近代还大力研讨无血清培育基。 无血清培育基具有以下优点：无血清培育基具有以下优点： 提高了细胞培育的可反复性，防止了由于血清提高了细胞培育的可反复性，防止了由于血清批之间差别的影响；批之间差别的影响； 减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险； 供应充足、稳定； 细胞产品易于纯化； 防止了血清中某些要素对某些细胞的毒性； 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验

6、结果的分析。 无血清培育基是以合成培育基为根底参与各种细胞生长所需的添加因子，有利于细胞生长的因子和微量元素等。三动物细胞大规模培育方法三动物细胞大规模培育方法 动物细胞培育的方法，普通可根据培育细胞的种动物细胞培育的方法，普通可根据培育细胞的种类分为原代细胞培育和传代细胞培育；又可根据培育类分为原代细胞培育和传代细胞培育；又可根据培育基的不同分为液体培育和固体培育；还可根据培育容基的不同分为液体培育和固体培育；还可根据培育容器和方式的不同分为静止培育、旋转培育、搅拌培育、器和方式的不同分为静止培育、旋转培育、搅拌培育、微载体培育、中空纤维培育、固定床或流化床培育等。微载体培育、中空纤维培育、

7、固定床或流化床培育等。 但从消费实践看，动物细胞的大规模培育主要可但从消费实践看，动物细胞的大规模培育主要可分为悬浮培育、贴壁培育和贴壁悬浮培育。分为悬浮培育、贴壁培育和贴壁悬浮培育。 1、悬浮培育、悬浮培育 顾名思义，所谓悬浮培育即让细胞自在地悬浮于培顾名思义，所谓悬浮培育即让细胞自在地悬浮于培育基内生长增殖。它适用于一切种类的非贴壁依赖性育基内生长增殖。它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞悬浮细胞，也适用于兼性贴壁细胞。细胞悬浮细胞，也适用于兼性贴壁细胞。 该培育方法的优点是操作简便，培育条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩展培育规模，在培育设各的设计和实践操作中可自创许多有关细菌发酵的阅历

8、。 目前在消费中用于悬浮培育的设备主要是通气搅拌罐式生物反响器和气升式生物反响器。 2、贴壁培育 贴壁培育是必需让细胞附在某种基质上生长繁衍的培育方法：它适用于一切贴附依赖性细胞贴壁细胞，也适用于兼性贴壁细胞。 该方法优点是适用的细胞种类广由于消费中所运用的细胞绝大多数是贴壁细胞，较容易采用灌流培育的方式使细胞到达高密度；缺乏之处是操作比较费事。 需求适宜的贴附资料和足够的面积，培育条件不易均一，传质和传氧较差，这些缺乏经常成为扩展培育的“瓶颈。 被普遍采用的贴壁培育方法是固定床式生物反响器，但由于该反响器中传质和传氧常会出现梯度式不均一景象，故放大常遭到限制。 贴壁培育扩展培育时，经常需求用

9、酶将其从基质上消化下来。它们的作用主要是使细胞间质和一些促进细胞贴附的蛋白因子水解，使细胞从基质分别成单个细胞。 3、微载体培育 微载体培育是使细胞贴附在微小颗粒载体上，它发明了相当大的贴附面积，供细胞贴附生长、增殖。载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使细胞自在悬浮于培育基内，充分发扬悬浮培育的优点。 理想的微载体需具备如下一些条件： 微载体外表性质与细胞有良好的相容性，适用细胞附着、伸展和增殖； 微载体的资料无毒性。不仅要求对细胞的生长无毒性，而且也不会产生影响产品和人体安康的有害因子； 微载体的资料是惰性的，不与培育基成分发生化学变化，也不会吸收培育基中的营养成分； 微载体的比重在1

10、.0301.045gml，使载体在低速搅拌下就可悬浮，而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获； 粒径在60250m溶胀后之间为好，并要尽能够地均一，差别不大于20 m 。这样有利于细胞均匀分布在各微载体外表； 具有良好的光学透明性，适用在倒置显微镜下察看细胞在载体上的生长情况； 基质的性质最好是软性的，防止在搅拌中由于载体相互磨擦而损伤细胞； 可耐120高温，便于采用高压蒸汽灭菌； 经简单的适当处置后，可反复多次地运用； 原料充分，制造简便，价廉。五动物细胞的种质保管五动物细胞的种质保管 动物细胞种质保管的方式有组织块、细胞悬浮物及动物细胞种质保管的方式有组织块、细胞悬浮物及细胞单层培育物等。

11、保管方式有常温、低温及超低温细胞单层培育物等。保管方式有常温、低温及超低温冰冻法冰冻法3种。种。 目前超低温冰冻法是保管种质细胞最有效和最重要目前超低温冰冻法是保管种质细胞最有效和最重要的方法。的方法。 常温法是将特定种质方式保管于常温法是将特定种质方式保管于2030的方法，的方法，如人肾及猴肾细胞单层于如人肾及猴肾细胞单层于2530可保管可保管1个月以上，个月以上，人二倍体细胞单层可保管两周，中间换液可保管人二倍体细胞单层可保管两周，中间换液可保管30d以以上，假设生长液中小牛血清减至上，假设生长液中小牛血清减至0.5l，于，于37培培育并有规律地改换培育基，那么可长期保管。育并有规律地改换

12、培育基，那么可长期保管。 低温法是将特定种质方式保管于4的方法，如原代猴肾细胞悬浮于4生长液中，可保管3周。 超低温冰冻法系将种质细胞保管于70以下冰箱或液氮中的保管方法。在此条件下，种质可长期保管。但是本法需用维护剂，常用的维护剂有二甲亚砜DMSO及甘油等。 甘油运用浓度为520，DMSO运用浓度为512.5。DMSO因起作用更快，毒性及黏度更低，膜透性更高，抗冻伤才干更强而运用最多，细胞在DMSO中30s左右即到达内外平衡，但在甘油中2h才干平衡。 在深冻过程中，先配制含8l0DMSO、1520小牛血清及适量NaHCO3的维护液，再将细胞培育物消化与分散，离心搜集细胞，按5106个细胞ml

13、浓度添加维护液，按lml支分装于安瓿中，04放置24 h，移至70冰箱中或置于液氮中保管。保冻细胞在继代培育前需复苏，复苏时将安瓿取出，包裹4层纱布浸入40水中，除去纱布后再浸入水中融化40s，混匀后立刻接种l2100ml培育瓶，并按12ml4ml8ml缓慢而依次参与生长液，最终加至20ml。 假设维护液含DMSO可直接用于接种，但其浓度应降至l以下。假设维护液含甘油，那么应离心除去甘油，以防影响细胞增殖，加生长液后可经过台酚蓝染色法计算活细胞数，然后用于培育。六单克隆抗体技术六单克隆抗体技术 l、单克隆抗体的制备原理、单克隆抗体的制备原理 B细胞群受抗原刺激后能产生针对抗原决议簇的特细胞群受

14、抗原刺激后能产生针对抗原决议簇的特异性抗体，一个机体可产生多达异性抗体，一个机体可产生多达100万种特异性不同万种特异性不同的抗体。的抗体。 但一个但一个B细胞却只能分泌一种特异性抗体。每个杂细胞却只能分泌一种特异性抗体。每个杂交瘤细胞只分泌一种特异性抗体，培育单个杂交瘤细交瘤细胞只分泌一种特异性抗体，培育单个杂交瘤细胞，使之无性繁衍构成细胞集落称之为克隆。同胞，使之无性繁衍构成细胞集落称之为克隆。同一个克隆的杂交瘤细胞基因一样，合成并分泌的特异一个克隆的杂交瘤细胞基因一样，合成并分泌的特异性抗体质地均一。这种抗体称之为单克隆抗体。性抗体质地均一。这种抗体称之为单克隆抗体。 淋巴细胞杂交瘤技术

15、是将在体外不能长期生存的免疫淋巴细胞与在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞在聚乙二醇PEG作用下交融而产生杂交瘤细胞。 所得的杂交瘤细胞承袭了两组亲代细胞的遗传性，既保管了骨髓瘤细胞在体外迅速增殖传代的才干，又承继了免疫淋巴细胞合成与分泌抗体和淋巴因子的才干。 T淋巴细胞主司细胞免疫，分泌淋巴因子。知有40多种淋巴因子。T细胞与骨髓瘤细胞交融可产生能分泌淋巴因子的T细胞杂交瘤细胞。 B细胞主司体液免疫，能分泌特异性免疫球蛋白抗体，B细胞与骨髓瘤细胞交融那么产生能分泌特异性抗体的B细胞杂交瘤细胞。 单克隆抗体有特异性强、免疫滴度高、质地均一、反响灵敏、可规范化等特点，还可进展工业化大消费。 单克隆抗体可

16、用于疾病诊断、体内显像定位检查、体内治疗或靶向治疗、食品与环境监测以及天然蛋白与基因工程产品的提纯等。世界各国已制备万种单克隆抗体。现已有百余种诊断试剂和数种治疗剂投放市场。2、单克隆抗体的工业化消费、单克隆抗体的工业化消费 单克隆抗体的消费包括细胞培育、提纯和制剂等单克隆抗体的消费包括细胞培育、提纯和制剂等工艺过程。工艺过程。1杂交瘤细胞的大规模培育杂交瘤细胞的大规模培育 单克隆抗体问世后，已研讨了多种适宜于大规模单克隆抗体问世后，已研讨了多种适宜于大规模培育杂交瘤细胞的生物反响器细胞培育罐及其培育杂交瘤细胞的生物反响器细胞培育罐及其培育基。目前比较成熟的发酵罐有气升式或深层发培育基。目前比

17、较成熟的发酵罐有气升式或深层发酵罐，中空纤维培育罐，微囊或滴珠发酵罐。酵罐，中空纤维培育罐，微囊或滴珠发酵罐。 牛淋巴液大规模培育技术牛淋巴液大规模培育技术mass culturing technique，MCT也是较成熟的适宜于杂交瘤细胞也是较成熟的适宜于杂交瘤细胞大规模培育的方法。大规模培育的方法。 用牛淋巴液体外循环法消费单克隆抗体的步骤： 在无菌条件下，自牛颈部引出牛胸导管、淋巴管至无菌室； 使淋巴细胞与淋巴液分开； 将滤出的细胞与部分淋巴液送回牛静脉管内，无细胞淋巴液经超滤后进入培育罐进展循环，并按比例参与培育液培育液应经过一层微孔半透膜过滤后再进入培育罐。 杂交瘤细胞培育产生的单克

18、隆抗体培育液的20经过另一端的半透膜流出培育罐，每日收获单克隆抗体，其他80再循环。2单抗的分别纯化单抗的分别纯化 无论用动物腹水，还是用发酵罐消费单克隆抗体，无论用动物腹水，还是用发酵罐消费单克隆抗体，产品的分别纯化均非常重要。目前常用的方法有超产品的分别纯化均非常重要。目前常用的方法有超滤法、盐析法，离子交换层析法、等电聚焦层析法、滤法、盐析法，离子交换层析法、等电聚焦层析法、葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A层析法、层析法、HPLC、DEAF C层析法、层析法、葡聚糖或琼脂糖法等。葡聚糖或琼脂糖法等。3单克隆抗体的制剂技术单克隆抗体的制剂技术 即将纯化的单克隆抗体制备成诊断试剂或新药。即将纯化的

19、单克隆抗体制备成诊断试剂或新药。常用于制备单克隆抗体制剂的物质有高聚物、脂质常用于制备单克隆抗体制剂的物质有高聚物、脂质体、聚乙二醇、细胞膜等。导向高聚物是外表包裹体、聚乙二醇、细胞膜等。导向高聚物是外表包裹着特异单克隆抗体的高聚物小珠，可用于移植，癌着特异单克隆抗体的高聚物小珠，可用于移植，癌症治疗和体内定位诊断。症治疗和体内定位诊断。三、植物细胞工程制药技术根底三、植物细胞工程制药技术根底一植物组织和细胞培育的根本概念一植物组织和细胞培育的根本概念 1、植物组织细胞无菌培育技术类型、植物组织细胞无菌培育技术类型 植物组织和细胞是指在无菌和人工控制的营养植物组织和细胞是指在无菌和人工控制的营

20、养培育基及环境条件光照、温度等下，研讨培育基及环境条件光照、温度等下，研讨植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。术。 植物无菌培育技术有以下几类：植物无菌培育技术有以下几类： 幼苗及较大植株的培育，即为幼苗及较大植株的培育，即为“植物培育植物培育plant culture； 从植物各种器官的外植体增殖而构成的愈伤组从植物各种器官的外植体增殖而构成的愈伤组织的培育叫做织的培育叫做“愈伤组织培育愈伤组织培育 ； 可以坚持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培育，称为“悬浮培育 ； 离体器官的培育，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的

21、花器官各部分以及未成熟果实的培育，称为“器官培育 ； 未成熟或成熟的胚胎的离体培育，那么为“胚胎培育。 2、悬浮培育 悬浮培育是指在液体培育基中，可以坚持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培育。在此培育条件下组织程度较低。 3、细胞培育、细胞培育 细胞培育是指利用单个细胞进展液体或固体培育，细胞培育是指利用单个细胞进展液体或固体培育，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁衍系。繁衍系。 4、分生组织培育、分生组织培育 分生组织培育又称生长锥培育，是指在人工培育分生组织培育又称生长锥培育，是指在人工培育基上培育茎端分生组织细胞。分生组织如茎尖分

22、生基上培育茎端分生组织细胞。分生组织如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超越组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超越1mm。 研讨阐明，经过组织培育技术进展植物的快速繁研讨阐明，经过组织培育技术进展植物的快速繁衍实验往往并没有利用这么小的外植体，而是利用衍实验往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括较大的茎尖组织，通常包括l2个原基。个原基。5、外植体组织培育、外植体组织培育 外植体是指用于植物组织细胞培育的器官或外植体是指用于植物组织细胞培育的器官或组织的切段，植物的各部位如根、茎、叶、花、组织的切段，植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花

23、粉等均可作为外植体果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进展组织培育。进展组织培育。6、器官构成培育、器官构成培育 器官构成普通是指在组织培育或悬浮培育中芽、根器官构成普通是指在组织培育或悬浮培育中芽、根或花等器官的分化与构成。或者在先构成的小根基部或花等器官的分化与构成。或者在先构成的小根基部迅速构成愈伤组织，然后再构成芽；或者在不同部位迅速构成愈伤组织，然后再构成芽；或者在不同部位分别构成芽和根之后，再构成维管组织而将二者连成分别构成芽和根之后，再构成维管组织而将二者连成一个轴，最后构成小植株。一个轴，最后构成小植株。 假设在培育过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似

24、时，通常称为“胚胎构成 。 当在体细胞或花药培育中培育物是小孢子这样的单倍体细胞，其所构成的胚胎构造叫做“胚状体 或“不定胚 。二植物组织和细胞培育所用的培育基 培育基实践上是植物离体器官、组织或细胞等的“无菌土壤，其特点是营养成分力可调控性。 植物组织和细胞培育所用培育基种类较多。但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。运用最广的是MS培育基和LS培育基。 MS培育基含两类成分： 无机元素，如N、P、K、Ca、Fe、Mg、 Cu、Mn、Zn、B、Ho、I等； 有机元素，如维生素B1、B6 、烟酸、肌醇、氨基酸、蔗糖等， 在培育基中，一些必需元素，如N、P、K、Ca

25、、Mg等的参与与否及其浓度的高低与组分的相对浓度对培育基结果都有艰苦影响。 在植物组织培育过程中激素的作用非常重要，假设没有激素存在，细胞就不能快速分裂甚至不分裂。 组织培育的优势就在于让植物细胞快速分裂，在短期内产生大量细胞，从而实现快速繁衍的目的。其次激素对于组织的器官和胚状体构成起着重要而明显的调理作用。其中影响最显著的是生长素和细胞分裂素。有时也运用赤霉素GA、零落酸ABA、乙烯以及其他人工合成的生长调理物质。 其中生长素包括：吲哚乙酸IAA、萘乙酸NAA、2，4二氯乙氧苯酸2，4 D、吲哚丁酸IBA。 细胞分裂素包括：激动素KT、6苄基腺嘌呤6BA、玉米素ZT等。 普通以为构成的器官

26、的类型受培育基中这两种激素的相对浓度的控制，较高浓度的生长素有利于根的构成而抑制芽的构成；相反，较高浓度的细胞分裂素那么促进芽的构成而抑制根的构成。三培育资料与培育方式 植物的根、茎、叶、花、果实、种子、髓等组织或器官都可用来诱导愈伤组织。 在实践任务中往往是在生长活泼的部位取材，进展愈伤组织的培育，此时可以进展各种培育基的选择，经过一段时间的培育，可以选择出适当的培育基作为以后培育的根本培育基。等愈伤组织长大后，转移到液体培育基中进展振荡，分别细胞。 普通愈伤组织不会很好地分散成理想的单细胞悬浮液，大多为50200个细胞组成的细胞团。 上述培育出来的细胞悬浮液是异源的，为了进一步得到均一的无

27、性细胞，可以在这种悬浮培育基的根底上，当细胞分散程度和迅速生长到达一定阶段后，利用平板培育技术进展细胞无性系分别。 即细胞悬浮液通常经过双层不锈钢网或尼龙网除去细胞聚集体，将滤过的细胞液与选定的琼脂培育基在35左右下混合，浇到培育皿上使其构成一薄层，当琼脂冷却凝固后，细胞就比较均匀地分布并固定在琼脂培育基中。此方法也称单细胞培育。在做平板培育基时一个关键的问题是细胞密度应以103/ml为宜。 小规模培育可选择大小适当的三角瓶502000ml，里面有选定的培育基，把挑选好的细胞株接入以后，旋转培育50l50rmin，4周后可进展继代培育。假设采用固体培育，在培育基中参与0709琼脂。 大规模培育

28、方式主要是液体悬浮培育法，培育容器用桨式搅拌罐、空气气升式反响器。 为了保证细胞系的消费稳定，已研讨了多种适宜的培育方式，简介如下： 1二步法 从许多植物细胞培育与次消费物的构成来看，生物合成作用往往在细胞生长的后期，据此提出二步培育法。第一步培育基称为生长培育基，主要适宜于细胞的生长；第二步称为合成培育基，用于次消费物的合成。 两种培育基往往有所区别，后者通常具有较低含量的硝酸盐或磷酸盐，或两者含量均较低。此外，通常也含有较低的糖分或少量可利用的碳源。 2固定化培育固定化培育 将悬浮培育的植物细胞包埋于固体将悬浮培育的植物细胞包埋于固体基质中，成为一个固定的生物反响系统。包埋的基质基质中，成

29、为一个固定的生物反响系统。包埋的基质可为多糖和多聚化合物，如褐藻酸盐、琼脂糖、可为多糖和多聚化合物，如褐藻酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、角叉菜胶。聚丙烯酰胺、角叉菜胶。 由于这些支持物胶体本身的交联方式，使之对养由于这些支持物胶体本身的交联方式，使之对养料、水分及气体有一定的通透性，在不同程度上维持料、水分及气体有一定的通透性，在不同程度上维持细胞的生物活力，从而保证进展生化反响的酶系和辅细胞的生物活力，从而保证进展生化反响的酶系和辅助因子的存在。助因子的存在。 基于此原理，在细胞产生次消费物的时期，就将基于此原理，在细胞产生次消费物的时期，就将其固定化，加以营养介质及底物进展反响，将其制成其固定

30、化，加以营养介质及底物进展反响，将其制成颗粒状，注入柱式反响器，就可以进展延续循环反响。颗粒状，注入柱式反响器，就可以进展延续循环反响。经过固定化细胞进展延续培育是实现商业化消费的有经过固定化细胞进展延续培育是实现商业化消费的有效途径。效途径。3代谢产物胞外释放代谢产物胞外释放 由于大部分有用的次生代谢由于大部分有用的次生代谢物并不释放到培育基中，而是储存于液泡中，传统的物并不释放到培育基中，而是储存于液泡中，传统的提取药用次生代谢物的方法始于破碎细胞，使细胞只提取药用次生代谢物的方法始于破碎细胞，使细胞只能一次性的运用。处理储存液泡中的次生代谢物使之能一次性的运用。处理储存液泡中的次生代谢物

31、使之释放到胞外，也是经过固定化细胞进展延续培育要处释放到胞外，也是经过固定化细胞进展延续培育要处理的一个主要问题。理的一个主要问题。 已开展出了化学试剂法、改动离子强度法、已开展出了化学试剂法、改动离子强度法、pH扰动扰动法、电击法等。法、电击法等。4两相培育技术两相培育技术 即在培育基中引入第二相，细胞即在培育基中引入第二相，细胞产物在原培育系统合成后，向第二相富集，从而减少产物在原培育系统合成后，向第二相富集，从而减少了产物的反响抑制，不仅提高了产量，而且简化了后了产物的反响抑制，不仅提高了产量，而且简化了后处置。处置。四植物细胞大规模培育的生物反响器特点四植物细胞大规模培育的生物反响器特

32、点 反响器的选择取决于消费细胞的密度、通气量以反响器的选择取决于消费细胞的密度、通气量以及营养成分的分散程度。常用的反响器及营养成分的分散程度。常用的反响器 3种类型。种类型。 1、摇瓶、摇瓶 气体和营养成分的均匀分布经过振荡而实现搅拌气体和营养成分的均匀分布经过振荡而实现搅拌目的。目的。 2、搅拌型生物反响器、搅拌型生物反响器 经过不同类型搅拌器的灵敏运用有利于植物培育经过不同类型搅拌器的灵敏运用有利于植物培育的高度混合，反响器内的温度、溶氧以及营养物浓度的高度混合，反响器内的温度、溶氧以及营养物浓度易控制，实验结果显示浆型搅拌器适用于植物细胞培易控制，实验结果显示浆型搅拌器适用于植物细胞培

33、育。育。 3 鼓泡塔生物反响器与气升式生物反响器鼓泡塔生物反响器与气升式生物反响器 这类反响器经过外部循环泵或紧缩空气作为动力，这类反响器经过外部循环泵或紧缩空气作为动力，使反响器内的培育物上下混合。使反响器内的培育物上下混合。 1鼓泡塔生物反响器鼓泡塔生物反响器 鼓泡塔生物反响器是经过反鼓泡塔生物反响器是经过反响器底部的喷嘴及多孔板而实气体分散。响器底部的喷嘴及多孔板而实气体分散。 鼓泡塔生物反响器主要优点是：没有运动部件，鼓泡塔生物反响器主要优点是：没有运动部件，操作不易染菌，在无机械能输入情况下，提供了较高操作不易染菌，在无机械能输入情况下，提供了较高的热量和质量传送；适用于对剪切敏感性

34、细胞的培育，的热量和质量传送；适用于对剪切敏感性细胞的培育，放大相对容易。缺陷是混合不匀，缺乏有关反响器内放大相对容易。缺陷是混合不匀，缺乏有关反响器内的非牛顿流体的流动与传送特性的数据等。的非牛顿流体的流动与传送特性的数据等。 2气升式生物反响器气升式生物反响器 气升式生物反响器有内循环气升式生物反响器有内循环式和外循环式两种类型。其培育物流动性比鼓泡塔式和外循环式两种类型。其培育物流动性比鼓泡塔更为均匀。气升式生物反响器是植物细胞培育最适更为均匀。气升式生物反响器是植物细胞培育最适宜的反响器之一，可以在低剪切下到达较好的混合宜的反响器之一，可以在低剪切下到达较好的混合和较高的氧传送效果。而

35、且不易污染，操作费用也和较高的氧传送效果。而且不易污染，操作费用也较低。较低。4、转鼓式生物反响器、转鼓式生物反响器 转鼓式生物反响器是经过转动促进反响器内的氧转鼓式生物反响器是经过转动促进反响器内的氧及营养物的混合，设置挡板有助于提高氧的传送，及营养物的混合，设置挡板有助于提高氧的传送，在高密度培育时有高的传氧才干，在高密度培育时，在高密度培育时有高的传氧才干，在高密度培育时，转鼓式优于搅拌式。其缺陷是难于大规模放大。转鼓式优于搅拌式。其缺陷是难于大规模放大。四、酶工程制药技术根底四、酶工程制药技术根底一酶工程技术一酶工程技术 酶工程酶工程 是酶学与工程学相互浸透结合，开展构成是酶学与工程学

36、相互浸透结合，开展构成的生物技术，它研讨酶和运用酶的特异催化功能，并的生物技术，它研讨酶和运用酶的特异催化功能，并经过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。经过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。 除了第一代酶酶制剂和第二代酶一固定化酶的除了第一代酶酶制剂和第二代酶一固定化酶的广泛运用外，第三代酶，即包括辅助因子再生系统在广泛运用外，第三代酶，即包括辅助因子再生系统在内的多酶反响器也已获得迅速开展。内的多酶反响器也已获得迅速开展。 酶工程的主要内容包括酶的消费、分别、纯化、酶工程的主要内容包括酶的消费、分别、纯化、酶的固定化、酶与固定化酶的反响器以及酶与固定化酶的固定化、酶与固定化酶

37、的反响器以及酶与固定化酶的运用等。酶的运用等。 随着生物技术与生物制造业的深化开展，当前酶工程技术的主要研讨方向是： 酶的分别、纯化和工业化消费以及新酶的发现与运用； 酶和细胞的固定化技术与酶反响器包括酶传感器的研讨； 基因工程与蛋白质工程技术在酶的分子设计与酶消费中的运用； 有机相中酶促反响的研讨与运用； 酶的抑制剂，激活剂的开发与运用研讨； 抗体酶与核酶的研讨与运用；抗体酶与核酶的研讨与运用； 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研讨。讨。二固定化酶的概念和优点二固定化酶的概念和优点 固定化酶固定化酶 是指借助于物理和化学的方法把酶束是指借助于物理

38、和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂，是近代缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂，是近代酶工程技术的主要研讨领域。广义的固定化酶又包酶工程技术的主要研讨领域。广义的固定化酶又包括固定化酶和固定化细胞两类。括固定化酶和固定化细胞两类。三固定化酶的制备方法三固定化酶的制备方法 酶的固定化方法有下述酶的固定化方法有下述4种：种：吸附法；吸附法；包埋包埋法；法；交联法；交联法；共价键结合法。共价键结合法。 1、吸附法、吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。用物理吸吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。用物理吸附法制成固定化酶，酶活力损失很少。但附着在载附法制成固定化酶，酶活力损失很少

39、。但附着在载体上的酶，易于零落，适用价值少。体上的酶，易于零落，适用价值少。 离子吸附法是将酶与含有离子交换剂的非水溶性载体相结合，酶吸附于载体上较为结实，在工业上用途颇广。离子吸附法常用的载体有： 阴离子交换剂；阳离子交换剂 用于物理吸附法的载体有高岭土 磷酸钙凝胶、多孔玻璃、氧化铝、硅胶 羟基磷灰石、纤维素、胶原、淀粉等。 2、包埋法 包埋法又分为凝胶包埋法及微囊化包埋法两类。 凝胶包埋法是将酶或细胞限制于高聚物网格中；微囊化法是将酶或细胞定位于不同构型膜外壳内。六固定化酶生物反响器的主要类型六固定化酶生物反响器的主要类型 反响器的方式很多，根据进料和出料的方式，可反响器的方式很多，根据进

40、料和出料的方式，可概括分为间歇式和延续式两大类，后者又有两种根本概括分为间歇式和延续式两大类，后者又有两种根本方式：延续流动搅拌罐式反响器和填充床反响器；方式：延续流动搅拌罐式反响器和填充床反响器； 还有一些衍生方式：延续流动搅拌罐超滤膜反还有一些衍生方式：延续流动搅拌罐超滤膜反响器、循环反响器和流化床反响器等。响器、循环反响器和流化床反响器等。第四节第四节 生物制药中试放大工艺设计生物制药中试放大工艺设计 一、生物制药中试放大工艺特点一、生物制药中试放大工艺特点一中试放大实验的目的一中试放大实验的目的 当实验室研讨任务进展到一定阶段，就应思索中当实验室研讨任务进展到一定阶段，就应思索中试放大

41、，以验证明验室工艺道路的可行性以及在实验试放大，以验证明验室工艺道路的可行性以及在实验室阶段难以处理或尚未发现的问题。室阶段难以处理或尚未发现的问题。 经过中试研讨要到达三个根本要求：经过中试研讨要到达三个根本要求： 建立稳定的制造规程为正式消费提供多种必要的建立稳定的制造规程为正式消费提供多种必要的工艺条件与参数；工艺条件与参数； 为临床前研讨与临床实验的评价提供足量的合格为临床前研讨与临床实验的评价提供足量的合格产品；产品； 拟定符合GMP要求的制造规程与检定规程，保证有足量的合格受试药物衡定供应临床实验，而且用于临床前实验和临床实验的受试药物该当具有完全一样的质量。 还要确定采用与临床实

42、验所用药品的一样制造工艺，以保证在日后消费中的产品与供临床实验所用药品的质量一样。 由于消费工艺的任何变卦都能够潜在性地改动最新产品的特性包含有效成分和杂质的变化。二进入中试应具备的条件二进入中试应具备的条件 实验进展到什么阶段才干进入中试？尚难制定一实验进展到什么阶段才干进入中试？尚难制定一个规范。但除了人为要素外，至少以下一些内容在进个规范。但除了人为要素外，至少以下一些内容在进入中试前应该根本具备。入中试前应该根本具备。 收率稳定，质量可靠；收率稳定，质量可靠； 操作条件曾经确定；产品，中间体及原料的分操作条件曾经确定；产品，中间体及原料的分析方法曾经指定；析方法曾经指定； 生物资料的资

43、源包括菌种、细胞株等已确生物资料的资源包括菌种、细胞株等已确定并已系统鉴定；定并已系统鉴定； 进展过物料平衡，进展过物料平衡，“三废问题己有初步的处三废问题己有初步的处置方法；置方法； 提出中试规模及所需原辅料的规格和数量； 提出平安消费的要求。 根据上述要求，在调查工艺条件的研讨阶段中，必需留意和处理以下问题。 1、原辅资料规格的过渡实验、原辅资料规格的过渡实验 在小试后，普通采用的原辅资料如原料、试剂、在小试后，普通采用的原辅资料如原料、试剂、溶剂、纯化载体等规格较高，目的是为了排除原料溶剂、纯化载体等规格较高，目的是为了排除原料中所含杂质的不良影响，从而保证明验结果的准确性。中所含杂质的

44、不良影响，从而保证明验结果的准确性。但是当工艺各线确定之后，在进一步调查工艺条件时，但是当工艺各线确定之后，在进一步调查工艺条件时，应尽量改用大规模消费时容易得到的原辅资料。应尽量改用大规模消费时容易得到的原辅资料。 为此，应调查某些工业规格的原辅资料所含杂质为此，应调查某些工业规格的原辅资料所含杂质对反响收率和产质量量的影响，制定原辅资料质量规对反响收率和产质量量的影响，制定原辅资料质量规范，规定各种杂质的允许限制。范，规定各种杂质的允许限制。2、设备选型与资料质量实验、设备选型与资料质量实验 在小试阶段，大部分实验是在小型玻璃仪器中进在小试阶段，大部分实验是在小型玻璃仪器中进展，但在工业消

45、费中，物料要接触到各种设备资料，展，但在工业消费中，物料要接触到各种设备资料， 有时某种材质对某一反响有极大影响，甚至使整有时某种材质对某一反响有极大影响，甚至使整个反响无法进展。故在中试时，要对设备资料的质量个反响无法进展。故在中试时，要对设备资料的质量及设备的选型进展实验，为工业化消费提供数据。及设备的选型进展实验，为工业化消费提供数据。3、反响条件限制实验、反响条件限制实验 反响条件限制实验可以找到最适宜的工艺条件反响条件限制实验可以找到最适宜的工艺条件如培育基种类、反响温度、压力、如培育基种类、反响温度、压力、pH等，普通均等，普通均有一个答应范围。有些反响对工艺条件要求很严，超有一个

46、答应范围。有些反响对工艺条件要求很严，超越一定限制后，就会呵斥艰苦损失。在这种情况下，越一定限制后，就会呵斥艰苦损失。在这种情况下，应进展工艺条件的限制实验，以全面掌握反响规律。应进展工艺条件的限制实验，以全面掌握反响规律。4、原辅资料，中间体及产质量量分析方法研讨、原辅资料，中间体及产质量量分析方法研讨 在生物制药工艺研讨中，有许多原辅资料，尤其在生物制药工艺研讨中，有许多原辅资料，尤其是中间体和新产品均无现成分析方法，因此，必需研是中间体和新产品均无现成分析方法，因此，必需研讨它们的鉴定方法，以便制定简便易行，准确可靠的讨它们的鉴定方法，以便制定简便易行，准确可靠的检验方法。检验方法。5、下游工艺的研讨、下游工艺的研讨 在生物制药工艺中，上游工艺固然非常重要，如在生物制药工艺中，上游