Molecularhybridization分子杂交

1、Molecular hybridization （分子杂交） 1.Principle and applicationsMolecular hybridization is based on the feature of denaturation and renaturation of nucleic acidsIt can be used as an approach for qualitative (定性) and quantitative（定量） analysis of DNA or RNA. Hybrid- heterogenous (异源的) Hybridization molecul

2、e Denaturation Hybridization DNA-DNA, DNA-RNA 2. Probe (探针) Notes Probe is a specific DNA or RNA fragment which can bind with the sample DNA or RNA for detection. ATCCGATCG- Source of probe synthesized, cloning genomic DNA or cDNA, as well as RNA. Probe must be labeled(标记) before hybridization. radi

3、oactive or32P-dCTP nonradioactive biotin, digoxigenin, fluorescent dye In a single stranded form for hybridization How a DNA probe bind with an unkown sequenceBase pairing indicatesthe gene of interest3. Ways of Molecular Hybridization A. Transfer blotting (转移印迹) Southern blotting Northern blotting

4、Western blotting Eastern blotting? B. Dot blotting & Slot blotting (点印迹, 狭缝印迹) C. In situ hybridization (原位杂交) A. Transfer blotting (转移印迹) Transfer blotting DNA or RNA is transferred and blotted from gel (胶)to membrane （膜）. From gel to membrane Capillary transfer Electrotransfer Gel MembraneSout

5、hern blotting It is first proposed by Dr. Edwin Southern in Edinburgh University in 1975, and term “Southern blotting” is named for him. Major steps: electrophoresis (电泳) transfer blotting （印迹转移） molecular hybridization（分子杂交）DNA 样品 DNA 探针变性X-ray 片限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳转移印迹胶 膜两部分工作两部分工作标记杂交杂交暴光Three kinds o

6、f molecular hybridization Blotting Southern Northern Western Eastern Sample DNA RNA Protein ?Hybridization DNA-DNA RNA-DNA Protein-Protein molecule (Ag-Ab) 免疫印迹 B. Dot/Slot blotting (点印迹/狭缝印迹)Dot/Slot blot hybridization is relatively easy compared with that of transfer blotting. 不经电泳不经电泳,直接点样直接点样The

7、 samples separation are put directly onto the membrane through dot /slot blot apparatus without electrophoresis. The other steps are similar to those of the transfer blotting. Dot blotSlot blot 仪器SampleDot blot-DNA chip (芯片) Development and combination of multiple fields The specific array (阵列)of re

8、lated genes. e.g., Oncogenes (癌基因) Tumor suppressor genes (抑癌基因) thousands,10 thousands of genes onto glass slide or siliconCharacteristics high sensitivity (高灵敏), high through-out(高通量)DNA chip 芯片 Result of analysisDNAs (cDNAs, synthesized oligonucleotides)Fluorescence labeled samples （cDNA）（）基因芯片的基

9、本原理及生物信息学的作用 基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。 基因芯片把大量已知序列探针集成在同一个基片上，经过标记的若干靶核酸序列通过与芯片特定位置上的探针杂交,便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。 根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。 其中一类是较长的DNA探针（100mer）芯片 这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的表达分析。 另一类是短的寡核苷酸探针芯片 其探针长度为25 mer左右，一般通过在片（

10、原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。原理原理 - - 通过杂交检测信息通过杂交检测信息一组寡核苷酸探针TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC ATACGTTA基因芯片荧光标记的样品 共聚焦显微镜获取荧光图象杂交结果分析探 针 设 计杂交（）基因芯片制备 基因芯片的制备主要有两种基本方法: 一是在片合成法， 在片合成法

11、是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。 另一种方法是点样法。 基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。 （）靶基因样品的制备及芯片杂交 根据基因芯片的检测目的不同,可以把样品制备方法分为 用于表达谱测量的mRNA样品制备 用于多态性(或突变)研究的基因样品的制备（）杂交信号检测 对

12、于用荧光素标记经扩增（也可用其他放大技术）的序列或样品，与芯片上的探针进行杂交，然后冲洗，采集荧光图像。 图像的采集用落射荧光显微镜 或电荷偶联装置照相机 非共聚焦激光扫描仪等进行。 、基因芯片对于生物分子信息检测的作用和意义 在生命科学领域中，基因芯片为分子生物学、生物医学等研究提供了强有力的手段。 利用基因芯片技术，可研究生命体系中不同部位、不同生长发育阶段的基因表达，比较不同个体或物种之间的基因表达，比较正常和疾病状态下基因及其表达的差异。 基因芯片技术也有助于研究不同层次的多基因协同作用的生命过程，发现新的基因功能，研究生物体在进化、发育、遗传过程中的规律。C. In situ hyb

13、ridization(原位杂交) nucleic acids of cells and tissue on the slide are detected by specific nucleic acid probes. It supplies the way for analyzing the location and gene expression at cell level. 发展历史 荧光原位杂交技术(fluorescence in situ Hybridization,FISH)问世于70年代后期,其曾多用于染色 体异常的研究,近年来随着FISH所应用的探针种类的不断增多,特别是全CO

14、SMID探针及染色体原位抑制杂交技 术的出现,使FISH技术不仅在细胞遗传学方面,而且还广泛应用于肿瘤学研究,如诊断、基因定位等放射性同位素原位杂交技术 原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验需重新标记 、已标记的探针表现出明显的不稳定性 、需要较长时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂相进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。FISH的基本原理 很简单, 就是标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退火杂交, 通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况. 荧光原位杂交（FI

15、SH） 它是用荧光素标记特异探针，与染色体做杂交后，根据特异的荧光信号来判断结果。 它可用于标记染色体的识别、特异融合基因的检测、新基因定位，用全染色体涂抹探针识别复杂的染色体结构异常。FISH具有其不可比拟的优点：1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年。2.方法敏感，能迅速得到结果。3.在同一标本上，可同时几种不同探针。FISH的技术特点的技术特点： FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞。间期细胞可以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或印片。 生物素（Biotin）地高辛（digoxigenin ）, dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl f

16、luorene(AAF)均可用于探针标记。直接标记和间接标记 用生物素或地高辛标记称为间接标记, 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号, 因而 步骤较多, 操作麻烦, 其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大 直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记. 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应, 不再需要购买荧光抗 体, 也由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针越来越成为首选, 并采用多种不同颜色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多种异常. 其荧光强度 和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察, 使FISH过程变得简

17、便而易于操作. 探针标记 在已知探针DNA结构及序列情况下可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用Biotin标记的探针应大于100bp，较小的探针可采用PCR技术来标记。 近年来，VYSIS公司成功的生 产了大片段的DNA探针（100400kb）。由于探针较长，故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化面且杂交信号增强。多色信号采集 常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像， 彩色胶片不易多次曝光，限制了这种联合标记探针的应用，使用CCD照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统融合各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。FIS

18、H和G显带技术结合 对已做过G显带的染色体片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）,不仅可以用新近G带外理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子。因此，FISH技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回顾性分析。FISH技术和其他技术的结合 FISH技术和RFLP结合，可以精确地描述原属于染色本长短臂等结构改变和染色体核形或复杂片段的性质。 FISH和细胞免疫化学技术结合，可以同时用多种颜色反应不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点。转录和翻译和产物，有助了解核苷酸结构功能以及表达产物之间关系的研究。多

19、色荧光原位杂交（M-FISH） M-FISH相当于在 一次杂交中给每一条染色体都涂上了不同的颜色, 因而很容易就可看到多条染色体间的复杂易位情况和确定标志染 色体的来源. M-FISH是1996年才建立的一种新技术。使用5种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成24条染色体上24种特异的荧光色彩以供核型分析。它为人们提供了既丰富又完善的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位 。多色荧光染色体显带（Rx-FISH） 能否让每条区带也杂交上不同的颜色呢? 这一想法导 致了彩色核型分析(Rx-FISH)的诞生. Rx-FISH技术是采用多种荧光素标记与人类D

20、NA有高度同原性猿的DNA作为探针，杂交后使人类的24条染色体上呈现特异的带型。这样便可根据彩色的荧光条带进行核型分析。Fishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-bindingdomaintransfectiontransforme

21、dyeastXWell start by making transformed yeast expressing XFishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorin other words is there a protein Y?To find out we are going to go fishing with the two-hybrid

22、system.We will use X as bait.to try to catch Y.As reference in this description, here is howthe yeast two-hybrid expression system works.(if you are unfamiliar with the yeast two-hybrid system then you should review the slide on this system before going fishing)Fishing with the yeast two-hybrid syst

23、emXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-bindingdomaintransfectiontransformedyeastXunknowpredatortissuetotal mRNAreverse transcriptasecDNAyeast plasmid expression vectortrans

24、fectionY?activationdomaintransformedyeastNow well make transformed yeast expressing Y, if Ydoes indeed exist.Fishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-