神经信号与电生理学方法(li)

1、神经系统的信号传递与电生理学神经系统的信号传递与电生理学研究方法研究方法 一、神经系统的信号传递一、神经系统的信号传递 二、电生理学方法介绍二、电生理学方法介绍医学院生理学研究所医学院生理学研究所 李景新 88383902一、神经系统的信号传递一、神经系统的信号传递1. 1. 神经元轴突内神经活动的电变化神经元轴突内神经活动的电变化Measuring the resting membrane potential1) 1) 电信号电信号Methods of Recording Action Potentials1)1)电信号电信号神经纤维静息电位与动作神经纤维静息电位与动作电位波形与产生机制电位

2、波形与产生机制The voltage-gated channelStructure of the voltage-gated sodium channel2. 2. 神经元神经元- -神经元间化学性突触传递神经元间化学性突触传递Synaptic arrangements in the CNSVarious sizes of CNS synapses2. 2. 神经元神经元- -神经元间化学性突触传递神经元间化学性突触传递2. 神经元神经元-神经元间化学性突触传递神经元间化学性突触传递A membrane ion channelThe properties: ion selectivity an

3、d gating.A membrane ion channelThe properties: ion selectivity and gating.Transmitter actions at G-protein-coupled receptors. The binding of neurotransmitter to the receptor leads to the activation of G-proteins. Activated G-proteins activate effector proteins, which may be (a) ion channels or (b) e

4、nzymes that generate intracellular second messengers.二、电生理学方法二、电生理学方法n细胞外纪录细胞外纪录 (extracellular recording): n细胞内纪录细胞内纪录 (intracellular single unit recording)：n电压钳（电压钳（voltage clamp）n膜片钳（膜片钳（patch clamp） n脑电图脑电图 (EEG)n诱发电位（诱发电位（evoked potential） n微电泳（微电泳（microelectrophoresis） n抗体微量注射抗体微量注射 n正电子发射断层扫描

5、术正电子发射断层扫描术n磁共振成像术磁共振成像术 （1) 阴极射线示波器（阴极射线示波器（oscillograph）：）： （2）生物电放大器）生物电放大器(amplifier): 频率相应范围大（通频带从频率相应范围大（通频带从0100kHz)，有足够高的放大能力，低噪声，高输入阻抗，高的辨差比。有足够高的放大能力，低噪声，高输入阻抗，高的辨差比。（3）电子刺激器（）电子刺激器（electronic stimulator）: 矩形脉冲：刺激强度（幅度矩形脉冲：刺激强度（幅度: 最大瞬时值，最大瞬时值，0.001200V之间，连续可调）、时间（波宽：之间，连续可调）、时间（波宽：10 s1s）

6、、频率）、频率(波宽和延迟时间之和小于频率的倒数波宽和延迟时间之和小于频率的倒数)、延迟、延迟 ；刺激；刺激方式：单，连续，双脉冲刺激；同步输出：触发其他需要与刺激同步的仪方式：单，连续，双脉冲刺激；同步输出：触发其他需要与刺激同步的仪器（示波器，微电泳，照相等）一起工作。刺激隔离器（器（示波器，微电泳，照相等）一起工作。刺激隔离器（insulator）。）。（4） 储存和分析电生理实验结果的仪器：储存和分析电生理实验结果的仪器： 常用的主要仪器常用的主要仪器 电记录的技术电记录的技术(A) 细胞外记录法记录法记录单个细胞或一群细胞的电活动。细胞外记录法记录法记录单个细胞或一群细胞的电活动。(

7、B) 微电极细胞内记录法记录膜内外的电位差：静息电位和动作电位。微电极细胞内记录法记录膜内外的电位差：静息电位和动作电位。(C) 膜片钳记录法记录当膜上单个通道开启或关闭时的电流。膜片钳记录法记录当膜上单个通道开启或关闭时的电流。工作原理：工作原理：把引导电极安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的把引导电极安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。活动部位的神经元去极化，未活动部位极化状态，在容积导电活动。活动部位的神经元去极化，未活动部位极化状态，在容积导体中两部位电位不同，电流流动，放置在细胞表面的电极会纪录出两体中两部位电位不同，电流流动，放置在细胞表面的电极会纪录出两者间的电位

8、差。者间的电位差。优点：优点：方便，电极不插入细胞。方便，电极不插入细胞。特点：特点：细胞外电位的波形因记录细胞的不同部位而异细胞外电位的波形因记录细胞的不同部位而异 细胞外纪录细胞外纪录 (Extracellular(Extracellular Recording) Recording)Wang et al., J Comp Neurol, 2001膈神经及呼吸相关神经元放电记录细胞内纪录细胞内纪录 I Intracellular Single Unit Recording细胞内纪录细胞内纪录 Intracellular Single Unit Recording 由于插入神经元内胞体并记录

9、细由于插入神经元内胞体并记录细胞内电位的微电极技术的发展，胞内电位的微电极技术的发展，Eccles等首先将微电极插入脊髓运动等首先将微电极插入脊髓运动神经元的胞体，记录哺乳类动物脊髓神经元的胞体，记录哺乳类动物脊髓的大运动神经元胞内电位。的大运动神经元胞内电位。运动神经元的胞体直径运动神经元的胞体直径70 m;微电极尖端直径微电极尖端直径0.5 m；跨膜电位差跨膜电位差6080mV。图图 用微电极在猫脊髓运动神经元内记录的突触后电位用微电极在猫脊髓运动神经元内记录的突触后电位A.B.C:三种不同的阈下刺激；三种不同的阈下刺激； D:10次刺激引起的峰电位。次刺激引起的峰电位。图图 刺激神经在单

10、根肌纤维的终刺激神经在单根肌纤维的终板上所诱发的电位板上所诱发的电位a. 正常终板电位和相继发生的正常终板电位和相继发生的肌肉峰电位；肌肉峰电位；b,c,d,e: 箭毒进行箭毒进行性地阻滞肌反应性地阻滞肌反应; e只留下终板只留下终板电位，神经肌肉传递被箭毒阻滞电位，神经肌肉传递被箭毒阻滞了。了。图图 枪乌贼星状神经节的突触前纤维表现枪乌贼星状神经节的突触前纤维表现的动作电位和在突触后神经元诱发的局的动作电位和在突触后神经元诱发的局部电位。部电位。 20世纪世纪50年代，年代，Hodgkin and Huxley 首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定

11、。进行膜电流的测定。工作原理：工作原理：离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。电生理实验以离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。电生理实验以电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电压以确定离子通道的电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的变化又会状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化。因而，影响该离子的通透性的变化。因而，须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个固定水平。电压钳技术

12、是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流，补固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流，补充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流（大小相等方向相反）。充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流（大小相等方向相反）。意义意义 ：1）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在指令电位的水平；）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在指令电位的水平；2）通过电流检测装置，记录到补充入胞内的注入电流，它相当于离子电流的反相电通过电流检测装置，记录到补充入胞内的注入电流，它相当于离子电流的反相电流。这样可流。这样可测定在不同膜电位水平的离子电流，了解膜通道的电导及功能活动

13、。测定在不同膜电位水平的离子电流，了解膜通道的电导及功能活动。电压钳电压钳 voltage clampvoltage clamp应用：应用：定量分析刺激与细胞后膜电导的变化。反映定量分析刺激与细胞后膜电导的变化。反映整个细胞膜上所有通道活动的综合结果。整个细胞膜上所有通道活动的综合结果。不足：不足：此项技术不能了解单个离子通道的功能活动此项技术不能了解单个离子通道的功能活动状态。另外，牵制的面积大，包含大量的随机开放状态。另外，牵制的面积大，包含大量的随机开放和关闭的通道，形成的背景噪音也大，掩盖单一通和关闭的通道，形成的背景噪音也大，掩盖单一通道的微弱电流，另外，小神经元插入两个电极不容道的

14、微弱电流，另外，小神经元插入两个电极不容易。易。电压钳装置图和电压钳实验记录的膜电流电压钳装置图和电压钳实验记录的膜电流 1976年由德国年由德国Neher 和和Sakmann 发明（发明（1991 Nobel Prize）。）。工作原理：工作原理：同电压钳，即在人为设置电压并固定的情况下记录分析离子通道。同电压钳，即在人为设置电压并固定的情况下记录分析离子通道。膜片钳技术使用玻璃微电极吸管把只含膜片钳技术使用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个个离子通道、面积为几个mm2的细的细胞膜通过负压吸引封接起来。由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端胞膜通过负压吸引封接起来。由于电极

15、尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端下的那片膜与膜的其他部分从电学上隔离。因此，片膜内通道开放所产生的电下的那片膜与膜的其他部分从电学上隔离。因此，片膜内通道开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的膜片钳放大器测量此电流强度，即代表单流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的膜片钳放大器测量此电流强度，即代表单一离子通道电流。一离子通道电流。性能：性能：电极尖端电极尖端(15 m)与膜之间电阻与膜之间电阻 10 9 （ G , 10G100G ）的高封）的高封接（接（giga-seals）, 大大提高了膜片钳的可靠性和灵敏性，可测量大大提高了膜片钳的可靠性和灵敏性，可测量0.06pA的电的电流，流，

16、1 m的空间分辨力和的空间分辨力和10 s时间的分辨力。时间的分辨力。意义：意义：膜上电压依赖型离子通道有开与关两种电导状态。通道膜片钳技术可直膜上电压依赖型离子通道有开与关两种电导状态。通道膜片钳技术可直接观察离子通道接观察离子通道“开启开启”和和“关闭关闭”。膜片钳膜片钳 P Patch ClampPatch clamping record ionic currents through single channels The patch contains a voltage-gated Na+ channel, Changing the membrane potential from 65

17、 mV to 40 mV, Cause the channel to open,and current (I) will flow through it (e).The amplitude of the measured current at a constant membrane voltage reflects the channel conductance, and the duration of the current reflects the time the channel is open. b. Applying suction through the electrode tip

18、.c. Withdraw the electrode from the cell, the membrane patch was torn away.d. Ionic currents was measured as steady voltages across the membrane.a. A glass electrode onto the membrane of the neuron.The opening and closing of Na+ channels upon membrane depolarization(a) The electrical potential acros

19、s a patch of membrane. When the membrane potential is changed from 65-40mV, the Na+ channels pop open.(b) Three different channels respond to the voltage step.(c): A model for how changes in the conformation of the Na+ channel protein might yield its functional properies.The shortcut pathwaya) G-pro

20、teins in heart muscle are activated by ACh binding to muscanrinic receptors.b) The activated G subunit directly gates a K+ channel.A patch-clamp recording from a transmitter-gated ion channel.Ionic current passes through the channels when the channels are open in the presence of neurotransmitter.Ibu

21、profen Inhibits Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatormediated Cl Secretion原理原理:应用光学记录技术，把特别研制的荧光染料与细应用光学记录技术，把特别研制的荧光染料与细胞膜结合，在有动作电位发生时，这种燃料的光吸收特胞膜结合，在有动作电位发生时，这种燃料的光吸收特性发生改变。性发生改变。种类：种类： 正电子发射断层扫描术（正电子发射断层扫描术（positron emission tomography, PET） 磁共振成像术（磁共振成像术（magnetic resonace imaging）作

22、用：作用：显示显示清醒人的大脑中受刺激区域，或发动运动时清醒人的大脑中受刺激区域，或发动运动时的活动状态。的活动状态。神经元活动的无创伤技术神经元活动的无创伤技术正电子发射断层扫描术Positron Emission Tomography, PET脑功能性磁共振成像术脑功能性磁共振成像术 Magnetic Resonace Imaging功能性磁共振成像技术检测视皮层的功能活动功能性磁共振成像技术检测视皮层的功能活动A 未刺激时组织的去氧血红蛋白比例高；未刺激时组织的去氧血红蛋白比例高；B. 刺激后组织氧合血红蛋白增高；刺激后组织氧合血红蛋白增高；C. 视觉刺激后脑影像视皮层活动区。视觉刺激后

23、脑影像视皮层活动区。Onimaru and Homma, J Neurosci, 2003Respiratory Pacemaking Neurons in Parafacial Area突触前神经末梢的递质以量子式释放，量很微少。突触前神经末梢的递质以量子式释放，量很微少。因此在进行因此在进行神经递质功能测定时，只能用最小而有效神经递质功能测定时，只能用最小而有效的剂量模拟神经递质的生理功能。的剂量模拟神经递质的生理功能。这是与药理学方法这是与药理学方法明显的区别。药理学研究可能用很大的剂量，所引起明显的区别。药理学研究可能用很大的剂量，所引起的效应可能与生理效应不同甚至相反。的效应可能与生

24、理效应不同甚至相反。 微电泳（微电泳（microelectrophoresis） 抗体微量注射抗体微量注射 神经递质功能测定的生理学方法神经递质功能测定的生理学方法 定义：定义：借助微电极通过一定的电流将解离物质电泳到神经元附近，观察神经递质借助微电极通过一定的电流将解离物质电泳到神经元附近，观察神经递质或其他药物对该神经元的作用。或其他药物对该神经元的作用。 基本原理：基本原理：外加电流通过含解离物质溶液的微电极时，将微电极内的解离物质从外加电流通过含解离物质溶液的微电极时，将微电极内的解离物质从管尖释放出来。例如微电极接正极，动物头皮接负极时，带阳离子的物质从微电极管尖释放出来。例如微电极接正极，动物头皮接负极时，带阳离子的物质从微电极中释出。相反，微电极接负极，头皮接正极时，带负离子的物质从微电极释出。微中释出。相反，微电极接负极，头皮接正极时，带负离子的物质从微电极释出。微电泳时解离物质从微电极释出量，与它通过的电荷量成正比。因此，通常用微电极电泳时解离物质从微电极释出量，与它通过的电荷量成正比。因此，通常用微电极的电流强度表示解离物质的释放量。的电流强度表示解离物质的释放量。 方法：方法：1）拉制微电极：五管：每管尖端直径）拉制微电极：五管：每管尖端直径1-3 m, 五管总直径五管总直径510 m.其中，其中，一管为记录，一管为对照，三管为药物。一管