浅析细菌内毒素检测方法及常见问题教学文案

1、浅析细菌浅析细菌(xjn)内毒素检测方法及常内毒素检测方法及常见问题见问题 第一页，共43页。内内 容容v细菌内毒素简介细菌内毒素简介(jin ji)v细菌内毒素检测方法细菌内毒素检测方法v常见问题及解决方案常见问题及解决方案第二页，共43页。一、细一、细 菌菌 内内 毒毒 素素 简简 介介v主要内容主要内容v 来源来源v 特性特性(txng)v 与热源的关系与热源的关系v 在药检中应用在药检中应用第三页，共43页。v主要来源主要来源v 主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖，这

2、是一种大分子物质分主要是脂多糖，这是一种大分子物质(wzh)，分子量约为，分子量约为106，其粒径约在，其粒径约在1 5纳米纳米 。v 细菌内毒素广泛存在于自然界中。如细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为自来水中含内毒素的量为1至至100EU/ml。第四页，共43页。v主要特性（实验器材处理方法）主要特性（实验器材处理方法）v1.耐热性耐热性v 一般在一般在100加热加热1小时无影响，小时无影响，120加热加热4小时能破坏小时能破坏(phui)98，180200干热干热2小时或小时或250干热半小干热半小时才能完全破坏时才能完全破坏(phui)。v 故：注射剂的一般灭菌条件是

3、不能破故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏坏(phui)内毒素的。内毒素的。v2.不耐酸碱性不耐酸碱性v 内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏(phui)。v 故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡第五页，共43页。v主要特性（实验器材处理方法）主要特性（实验器材处理方法）v3.水溶性与不挥发性水溶性与不挥发性v 热原能溶于水，本身不具挥发性，但能热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染随水蒸气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染(wrn)。v 故：不可用湿热灭菌法处理实验器具故：不可用湿热灭菌法处理实验器具第六页，共43页。v主要

4、特性（去除内毒素方法）主要特性（去除内毒素方法）v4.滤过性滤过性v 原体积很小，约在原体积很小，约在15 nm之间，故能之间，故能通过通过(tnggu)除菌滤器而进入滤液中，除菌滤器而进入滤液中，但不能通过但不能通过(tnggu)石棉滤板，也不能石棉滤板，也不能通过通过(tnggu)半透膜。半透膜。v5.吸附性吸附性v 能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有一定的电荷，因而可被某些离子液中带有一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。交换介质吸附。第七页，共43页。v热原热原=内毒素内毒素 ？v 热原指微生物产生的某些多糖蛋白热原指微生物产生的某些多糖蛋白复

5、合物等使人体发热的物质，不仅仅复合物等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。是细菌内毒素。v 但在药检的范畴，细菌内毒素是主但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以要的热原物质，可以(ky)说无内毒素说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。就无热原，控制内毒素就是控制热原。第八页，共43页。v热原检查方法简介热原检查方法简介v 中国药典热原检查方法是采用中国药典热原检查方法是采用(ciyng)家兔升温法进行检查。家兔升温法进行检查。v 将一定剂量的供试品，静脉注入家兔将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判

6、定供试品中所含热原的限度的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。是否符合规定。第九页，共43页。热原检查法第十页，共43页。v与热源与热源(ryun)对比内毒素检查法优势对比内毒素检查法优势v方便、快捷、经济；方便、快捷、经济；v重现性好、灵敏度高；重现性好、灵敏度高；v避免抗原的产生，克服生物测定的误差；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；v 近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源逐渐替代了热源(ryun)法法第十一页，共43页。v在药检中的应用在药检中的应用v 细菌内毒素检查作为控制药品质量的细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法

7、，已经广泛的被世界各国药典收一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。载。v成品检查成品检查药品安全性检查之一药品安全性检查之一v v半成品（生产过程半成品（生产过程(guchng)）检查）检查事前质控手段，避免造成药品成批报废事前质控手段，避免造成药品成批报废第十二页，共43页。二、细菌二、细菌(xjn)内毒素检测方法内毒素检测方法v中国药典批准使用方法：中国药典批准使用方法：v供试品检测供试品检测(jin c)时，可使用其中任何一种时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测定结果有争议时，除方法进行试验。但当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。另有规定外，以凝胶法结果为准。v本

8、节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。测定(cdng) 方法凝胶法 光度测定法 浊度法 显色基质法 第十三页，共43页。鲎试剂与内毒素反应(fnyng)机理内毒素C因子(ynz)活化(huhu)的C因子凝胶B因子 凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鲎凝血系统酶联反应第十四页，共43页。名词解释名词解释1鲎及鲎试剂鲎及鲎试剂(shj)鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和

9、机械鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应(fnyng)，反，反应应(fnyng)的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。关，是体外检测内毒素的敏感试剂。第十五页，共43页。第十六页，共43页。名词解释名词解释2国家标准品及工作国家标准品及工作(gngzu)标准品标准品国家标准品：国家标准品： （单位：（单位：EU/mlEU/ml） 自大肠埃希菌提取精制而成，用于标

10、定、自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价；工作标准品的效价；工作标准品：工作标准品： 经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符复核、干扰试验及各种度符复核、干扰试验及各种( zhn)( zhn)阳性阳性对照；对照；第十七页，共43页。名词解释名词解释3细菌细菌(xjn)内毒素检查用水内毒素检查用水凝胶法：凝胶法： 内毒素含量小于内毒素含量小于0.015EU/ml0.015EU/ml的灭菌注射的灭菌注射(zhsh)(zhsh)用水；用水； 故：灭菌注射故：灭菌注射(zh

11、sh)(zhsh)用水用水细菌内毒细菌内毒素检查用水素检查用水 光度法：光度法： 内毒素含量应小于内毒素含量应小于0.005EU/ml0.005EU/ml；第十八页，共43页。细菌细菌(xjn)内毒素检测之凝胶法内毒素检测之凝胶法v实验程序实验程序v1、试验准备：试剂、仪器及用具、试验准备：试剂、仪器及用具(yngj)v2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度v3、鲎试剂灵敏度复核、鲎试剂灵敏度复核v4、供试品干扰试验（新药或新方法）、供试品干扰试验（新药或新方法）v5、供试品细菌内毒素凝胶法检测、供试品细菌内毒素凝胶法检测第十九页，共43页。v实验材料实验材料(

12、cilio)及用及用具具v1、仪器、仪器名称要求天平感量0.1mg以下电热干燥箱300恒温水浴箱371 水银或酒精温度计100 1 漩涡混合器/计时器60min1min2、器具(qj)器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径1075mm）、试管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其他酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、记号笔第二十页，共43页。v试剂试剂v1 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号v2 2、内毒素工作标准品、内毒素工作标准品v3 3、内毒素检查用水、内毒素检查用水v4 4、7575乙醇乙醇v常用英文缩写常用英文缩写v

13、BETBET：细菌内毒素检查：细菌内毒素检查 BET BET水：细菌内毒素水：细菌内毒素检查用水检查用水 vMVDMVD：供试品最大有效稀释倍数：供试品最大有效稀释倍数 NC NC：阴：阴性对照性对照vMVCMVC：供试品最低有效浓度：供试品最低有效浓度(nngd) (nngd) PCPC：阳性对照：阳性对照v：鲎试剂灵敏度：鲎试剂灵敏度 L L：供试品细菌内毒：供试品细菌内毒素限值素限值第二十一页，共43页。v灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。目的是为了目的是为了(wi le)对试剂、检测者的操作、环境条件、水

14、平条对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。 v试验举例：内毒素工作标准品为试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；支；v 待测鲎试剂灵敏度待测鲎试剂灵敏度0.25EU/ml。v1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75酒精擦拭后启开，加酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进后

15、进行稀释，步骤如下行稀释，步骤如下(箭头下方为加入箭头下方为加入BET水量水量)：90EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.6ml0.2ml1.8ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml第二十二页，共43页。0.2ml0.2ml1ml1ml1ml1ml水水溶解(rngji)后的标准品水水水水90EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml（2 ）（ ）（0.5 ）（0.25 ）第二十三页，共43页。2 2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为

16、、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml0.1ml装量，则取装量，则取1818支，每支加入支，每支加入0.1mlBET0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml0.1ml，则取若干支，按标示量加入，则取若干支，按标示量加入 BET BET水水溶解，再取溶解，再取0.1ml0.1ml分装于标准玻璃试管（分装于标准玻璃试管（10mm10mm75mm75mm），将试管按如下），将试管按如下形状排列。形状排列。3 3、加样：每列每支加入相应浓度、加样：每列每支加入相应浓度(nngd)(nngd)的内毒素标准品溶液各的内毒素标准品溶液各0.1ml0.1ml，第五列加入第五列加入

17、BETBET水水0.1ml0.1ml。12230.540.25BET水22220.50.50.50.50.250.250.250.25第二十四页，共43页。v反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置置37 水浴中保温水浴中保温602min，将每管拿出缓缓，将每管拿出缓缓(hun hun)倒转倒转180，凝胶不变形为，凝胶不变形为“”，凝胶不能保持完，凝胶不能保持完整为整为“”。v 当当2.0四支管都为阳性，四支管都为阳性，0.25四支管都为阴性时，试验四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度成立，按下面底公式计算

18、复核的灵敏度c ：v clg-1(X/4)v（X:反应终点浓度的对数值。）反应终点浓度的对数值。）v 当当0. 5c 2.0时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度以标示灵敏度为准。为准。第二十五页，共43页。左侧左侧(zu c)管旋转管旋转180凝胶不能保持完整为阴性，记为凝胶不能保持完整为阴性，记为“”；右侧管旋转；右侧管旋转180凝胶凝胶不变形为阳性，记为不变形为阳性，记为“”。第二十六页，共43页。举例：举例：设待复核的鲎试剂设待复核的鲎试剂(shj)标示灵敏度标示灵敏度为为0.125EU/ml:平行管数内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC反应终

19、点浓度CX(lgC)0.250.1250.060.031+-0.06-1.222+-0.125-0.9033+-/0.125-0.9034+-/0.125-0.903clg-1(X/4) lg-1（-1.22）（-0.903）（ -1.22 ）（ -1.22 ）/4 0.104（EU/ml） c在0. 52.0范围(fnwi)内，符合规定。第二十七页，共43页。v方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验v目的：目的：v 确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），得到确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰

20、稀释(xsh)倍数，倍数，为正式干扰实验提供依据。为正式干扰实验提供依据。v影响因素：影响因素：v 新药检查方法建立；新药检查方法建立；v 鲎试剂批号或来源的改变；鲎试剂批号或来源的改变；v 检品生产工艺，配方，成分的改变；检品生产工艺，配方，成分的改变；v 检品关键成分来源的改变；检品关键成分来源的改变；第二十八页，共43页。 方法学验证方法学验证(ynzhng)供试品干扰预试验供试品干扰预试验v供试品溶液的最大稀释(xsh)倍数的计算v MVDCL/ v L:供试品的内毒素限值；v C：供试品溶液的浓度；v 当L以 EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或EU/u表示时，C的

21、单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以EU/ml表示时，C的值不是样品的浓度，就是1)。第二十九页，共43页。 方法学验证方法学验证(ynzhng)供试品干扰预试验供试品干扰预试验v内毒素限值内毒素限值(L)的确定的确定(qudng) v 药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中，式中K为按规定给为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的不产生任何不药途径，人每公斤体重每小时可以接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是良反应的细菌内毒素剂量（亦

22、称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的一固定值，药典上对每一给药途径的K值都有具体的规定。值都有具体的规定。M为按规定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最为按规定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最大剂量。这一个值的确定大剂量。这一个值的确定(qudng)实际上才是计算限值实际上才是计算限值的关键。的关键。第三十页，共43页。方法学验证方法学验证(ynzhng)供试品干扰预试验供试品干扰预试验（1）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典委员会编制的临床用药须知来确定最大剂量。 如儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为准。（2）为保证安全(nqun)用药，对于抗感染、抗

23、肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。第三十一页，共43页。v方法学验证方法学验证供试品干扰试验供试品干扰试验v 目的：验证预干扰中确定的浓度或倍数目的：验证预干扰中确定的浓度或倍数(bish)下的供下的供 试品对于鲎试剂与试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。内毒素的反应有无干扰作用。v 试验方法：须选择两家以上的鲎试剂进行试试验方法：须选择两家以上的鲎试剂进行试验验v 编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液1248210.50.2544

24、44C2/检查用水检查用水1248210.50.254444D无/检查用水2第三十二页，共43页。v方法学验证方法学验证供试品干扰试验供试品干扰试验v结果判定：结果判定：v 如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（c）均在均在0.5-2.0范围范围(fnwi)内时，则认为供试品在该浓内时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，否则需要对供试品做适当处理。度下不干扰试验，否则需要对供试品做适当处理。 v干扰的排除：干扰的排除：v 对供试品进行更大倍数的稀释；对供试品进行更大倍数的稀释；v 选择灵敏度更高的鲎试剂；选择灵敏度更高的鲎试剂；v 其他适宜的方法其

25、他适宜的方法v 如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。 第三十三页，共43页。v供试品细菌内毒素凝胶法检测供试品细菌内毒素凝胶法检测v 检测方法：检测方法： v 结果结果(ji gu)v 判定判定v v 阴性阴性v 阳性阳性v 阳性阳性v 阴性阴性编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数 A无/供试品溶液2 B2/供试品溶液2 C2/检查用水2 D无/检查用水2 注：A 无干扰浓度供试品溶液；B 供试品阳性对照(duzho)；C 阳性对照(duzho)；D 阴性对照(duzho)。第三十四页，共43页。三、常见问题及解决方案三、常见问题及解决方案1、实

26、验前未复核鲎试剂产品的灵敏度、实验前未复核鲎试剂产品的灵敏度 鲎试剂灵敏度的改变或质量不符合要求，会影响实验结果，鲎试剂灵敏度的改变或质量不符合要求，会影响实验结果，因此实验前应复核鲎试剂产品的灵敏因此实验前应复核鲎试剂产品的灵敏2、实验器具的洁净度不符合要求、实验器具的洁净度不符合要求 一般用硫酸清洁液浸泡，用自来水冲洗干净，再用新鲜蒸馏一般用硫酸清洁液浸泡，用自来水冲洗干净，再用新鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（水冲洗三道，并干热（250）恒温）恒温1h即可。实验用的玻璃即可。实验用的玻璃器具必须严格器具必须严格(yng)无菌无热原，建议不要使用一次性塑料无菌无热原，建议不要使用一次性塑料制品。

27、制品。第三十五页，共43页。3、实验条件达不到要求、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台。应备有一台超净工作台。 4、温度不符合要求、温度不符合要求 实验室温度为实验室温度为252较好，恒温水浴箱温度为较好，恒温水浴箱温度为371为宜。为宜。5、忽视样品、忽视样品(yngpn)本身干扰本身干扰 第三十六页，共43页。 供试品若经干扰试验证实存在供试品若经干扰试验证实存在(cnzi)干扰因素，可采用适宜的方法来消除干扰。干扰因素，可采用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原则是不能影响供试品消除干扰的

28、一个重要原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。中的内毒素生物活性。 (1).供试品稀释法供试品稀释法 MVD=CL / 鲎试剂灵敏度鲎试剂灵敏度()越高越高(数值越小数值越小)，供试品的，供试品的稀释倍数越大，干扰越小。稀释倍数越大，干扰越小。第三十七页，共43页。 (2). (2).物理方法物理方法 如加热法如加热法( (血液制品血液制品) )、冷析法、冷析法( (甘露醇甘露醇 ) ) (3). (3).化学方法化学方法 如调节如调节PHPH值值( (奎诺酮类奎诺酮类) )、调节金属离子、调节金属离子( (血液保养液、血液保养液、FDP)FDP) (4). (4).生物方法生物方法 如抗增液的使用，阻断如抗增液的使用，阻断G G因子反应，防止假阳性；因子反应，防止假阳性； (5). (5).其它其它(qt)(qt)方法方法 如过滤法、溶剂抽提等如过滤法、溶剂抽提等 第三十八页，共43页。6 6、鲎试剂浓度达不到要求、鲎试剂浓度达不到要求 开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安瓿壁上开启内毒素标准品和鲎