11DNA重组技术的基本工具45ppt

1、专题一专题一 基因工程基因工程 假如你是一位假如你是一位育种专家育种专家，你能培育出下面几，你能培育出下面几种种“生物生物”吗？请问你准备用什么方法？吗？请问你准备用什么方法？这些定向改造基因的设想能实这些定向改造基因的设想能实现吗？现吗？基因工程基因工程一一. .基因工程的概念基因工程的概念 1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具剪刀剪刀针线针线运输车运输车问题探讨：问题探讨：苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌基因工程培育抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程的简要过程普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌（有抗虫性状）（有抗虫性状）提取

2、提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有抗虫特性有抗虫特性) )重组重组DNADNA导入导入形成形成“分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子缝合针分子缝合针” DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体主要来源：主要来源：（1）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”简称：简称：分布：分布：主要在主要在原核生物原核生物中中二二. .基因工程的工具基因工程的工具原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNADNA的入侵的入侵，但生物在长期，但生物在

3、长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具防御性工具，当外源当外源DNADNA侵入时，会利用限制酶侵入时，会利用限制酶将外源将外源DNADNA切割掉切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到起到切割外源切割外源DNADNA、使之失效，从而达到保护自身的、使之失效，从而达到保护自身的目的目的。 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A2 2、作用特点：、作用特点：2、作用特点：、作用特点：（1）

4、限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”3 3、限制酶识别序列、限制酶识别序列思考与探究思考与探究 P7P72 2、为什么限制酶不剪切细菌本身的、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？ 通过长期的进化，含有某种限制通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其酶的细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备这不具备这种限制酶的识别切割序列种限制酶的识别切割序列，或者，或者通过通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。碱基上，使限制酶不能将其切开。这这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身

5、的会使自身的DNADNA被切断，并且可以防止被切断，并且可以防止外源外源DNADNA的入侵。的入侵。 限制酶所识别的序列的特点限制酶所识别的序列的特点 中心轴线两侧的双链中心轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是上的碱基是反向对称反向对称重复排列的。重复排列的。3 3、限制性核酸内切酶的作用特点、限制性核酸内切酶的作用特点能识别特定核苷酸序列；能识别特定核苷酸序列；（专一性）（专一性）3 3、限制性核酸内切酶的作用特点：、限制性核酸内切酶的作用特点：从特定部位的两从特定部位的两个核苷酸之间切开。个核苷酸之间切开。（切点：切点：） T1234512345 A（专一性）（专一性）黏性末端黏性末端黏性

6、末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶EcoR能能识别识别GAATTC序列，并在序列，并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶限制酶SmaSma能识别能识别GGGCCCGGGCCC序列，并在序列，并在G G和和C C之间切开。之间切开。（1 1）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”4.4.作用结果：作用结果：（2 2）“分子缝合针分子缝合针” ” DNA DNA连接酶连接酶（2 2）“分子缝合针分子缝合针” ” DNA DNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶P6P6 DNAD

7、NA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗? ?为什么为什么? ?AG T AC T A A T DNADNA母链母链DNA聚聚合酶合酶DNADNA聚合酶聚合酶TTAG A TA TCCGACGGTTTAA1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)能将能将DNADNA双链上的双链上的两个缺口同

8、时连接两个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板【探规寻律】【探规寻律】几种酶的作用部位几种酶的作用部位限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、连接酶、DNA聚合聚合酶作用于酶作用于部位部位,DNA解旋酶作用于解旋酶作用于部位。部位。（3 3）“分子运输车分子运输车” ” 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体载体需要的条件：载体需要的条件：有有11多个限制酶切点多个限制酶切点对受体细胞无害对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选有某些标记基因，便于筛选常用运载体：常用运载体： 质粒质粒 动植物病毒动植物病毒

9、（3 3）噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ （最常用）（最常用）双链环状双链环状DNADNA小结基因工程基因工程的工具的工具限制限制 酶酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键产生黏末端或平末端产生黏末端或

10、平末端DNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键 种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4 DNADNA连接酶连接酶运载运载工工 具具具备的具备的条件条件能在宿主细胞中自我复制能在宿主细胞中自我复制并稳定存在并稳定存在具一种至多种限制酶切点具一种至多种限制酶切点具标记基因具标记基因质粒、质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒噬菌体衍生物、动植物病毒基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定1.限制酶在限制酶在DNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的种不同限制酶切割形成的DNA片段片段:你是否能用你是否能用DNA连接连接酶将它们连接起来？酶将它们连接起来？ CTGCA G ACTG