WesternBlot详解及问题分析学习教案

1、会计学1WesternBlot详解及问题详解及问题(wnt)分析分析第一页，共43页。第1页/共42页第二页，共43页。第2页/共42页第三页，共43页。第3页/共42页第四页，共43页。p 高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原-抗体反应p 1-5ng中等大小(dxio)的靶蛋白第4页/共42页第五页，共43页。第5页/共42页第六页，共43页。l蛋白样品的制备lSDS-PAGEl转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物(d w)显色第6页/共42页第七页，共43页。第7页/共42页第八页，共43页。第8页/共42页第九页，共43页。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20

2、mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚兰20%甘油ddH2O第9页/共42页第十页，共43页。第10页/共42页第十一页，共43页。（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g 蛋白质结合(jih)1.4g SDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比第11页/共42页第十二页，共43页。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳第12页/共42页第十三页，共43页。第13页/共42页第十四页，共43页。第14页/共42页第

3、十五页，共43页。 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定(ydng)的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。第15页/共42页第十六页，共43页。单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；加速(ji s)剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机

4、理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化(ynghu)还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化学催化（核黄素TMTED）体系。第16页/共42页第十七页，共43页。凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离(fnl)胶配方表： 第17页/共42页第十八页，共43页。 作用作用缓冲液缓冲液PHPH凝胶浓度凝胶浓度浓缩胶浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶分离胶

5、使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳(din yn)缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。第18页/共42页第十九页，共43页。ddH2O0.1%SDS:8%第19页/共42页第二十页，共43页。灌制积层胶 插入(ch r)梳子 第20页/共42页第二十一页，共43页。Staking gelSeparating gel第21页/共42页第二十二页，共43页。第22页/共42页第二十三页，共43页。n第23页/共42页第二十四页，共43页。第24页/共42页第二十五页，共43页。第25页/共42页第二十六页，共43页。第26页/共42页第二十七页，共43页。第27页/共

6、42页第二十八页，共43页。一抗、二抗孵育(f y)第28页/共42页第二十九页，共43页。辣根过氧化物酶法（HRP）碱性(jin xn)磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)第29页/共42页第三十页，共43页。体与抗原分离，适用于任何化学体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。发光底物系统。第30页/共42页第三十一页，共43页。第31页/共42页第三十二页，共43页。第32页/共42页第三十三页，共43页。第33页/共42页第三十四页，共43页。第34页/共42页第三十五页，共43页。第35页/共42页第三十六页，共43页。转移(zhuny)到膜上的蛋白很少蛋白分子量 10KD蛋白的

7、等电点 9SDS浓度不合适凝胶太厚 原因对策蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜更换高pH值Buffer在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率延长转膜时间第36页/共42页第三十七页，共43页。膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高 原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度背景(bijng)太高第37页/共42页第三十八页，共43页。杂交(zjio)信号很弱抗体保存不当抗原不充足膜的漂洗过度 原因对

8、策抗体长期保存应在70，使用前做效价检测增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照减少漂洗的时间和次数第38页/共42页第三十九页，共43页。一抗不是唯一特异的二抗出现非特异结合 原因对策制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合出现(chxin)非特异带第39页/共42页第四十页，共43页。第40页/共42页第四十一页，共43页。第41页/共42页第四十二页，共43页。NoImage内容(nirng)总结会计学。第1页/共42页。针对(zhndu)水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)。SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylami