放射免疫技术

1、人民卫生出版社人民卫生出版社免疫学检验免疫学检验人民卫生出版社人民卫生出版社第十九章第十九章 放射免疫技术放射免疫技术人民卫生出版社人民卫生出版社放射免疫技术的基本概念及类型放射免疫技术的基本概念及类型放射标记物的鉴定与纯化。放射标记物的鉴定与纯化。RIA和和IRMA的测定原理及关键技术。的测定原理及关键技术。1.RIA和和IRMA的临床应用与评价的临床应用与评价本章要点本章要点人民卫生出版社人民卫生出版社目录目录 放射性核素和放射性标记物的制备放射性核素和放射性标记物的制备1放射免疫分析性放射免疫分析性2免疫放射分析免疫放射分析3人民卫生出版社人民卫生出版社 放射免疫技术放射免疫技术是将放射

2、性核素高敏感的示踪特点是将放射性核素高敏感的示踪特点和抗原抗体反应的高特异性特点相结合的一种体和抗原抗体反应的高特异性特点相结合的一种体外测定超微量物质的新技术。外测定超微量物质的新技术。 其基本模式是应用放射性核素标记抗原或抗体，其基本模式是应用放射性核素标记抗原或抗体，通过免疫反应进行定量测定。通过免疫反应进行定量测定。 具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，在医剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，在医学检验中得到了广泛应用。学检验中得到了广泛应用。 放射免疫技术根据其方法学原理的不同主要有两放射免疫技术

3、根据其方法学原理的不同主要有两种类型：种类型：RIARIA和和IRMAIRMA。 前前 言言人民卫生出版社人民卫生出版社第一节第一节 放射性核素和放射性标记物的制备放射性核素和放射性标记物的制备 放射性核素作为放射性免疫技术的标记物，放射性核素作为放射性免疫技术的标记物，选择何种放射性核素以及如何制备放射标选择何种放射性核素以及如何制备放射标记物（将放射性核素与抗原或抗体连接），记物（将放射性核素与抗原或抗体连接），是建立放射免疫技术的基础。是建立放射免疫技术的基础。人民卫生出版社人民卫生出版社一、一、放射性核素的基本知识放射性核素的基本知识 基本概念基本概念指在自然条件下可发生自发性的转化，

4、由一种指在自然条件下可发生自发性的转化，由一种放射性核素转变成另一种放射性核素，并同时放射性核素转变成另一种放射性核素，并同时释放射线（释放射线（、），又称为放射性衰变。），又称为放射性衰变。 基本类型基本类型 依据其衰变方式依据其衰变方式 衰变、衰变、衰变、衰变、衰变衰变 最常用的放射性核素是最常用的放射性核素是125125I I 人民卫生出版社人民卫生出版社125125I I的优点的优点 化学性质比较活泼，标记方法简单，且容易获得化学性质比较活泼，标记方法简单，且容易获得 高比活性的标记物；高比活性的标记物； 在衰变过程中产生在衰变过程中产生射线，便于测量且效率高；射线，便于测量且效率高；

5、 半衰期适中（半衰期适中（6060天左右），且废弃物较容易处理。天左右），且废弃物较容易处理。125125I I的缺点的缺点 用用125125I I取代取代H H，可能使原物质免疫活性受到影响；，可能使原物质免疫活性受到影响； 易因发生辐射损伤而使标记抗原变性；易因发生辐射损伤而使标记抗原变性； 作为商品化试剂的产品货架期较短。作为商品化试剂的产品货架期较短。人民卫生出版社人民卫生出版社放射性核素放射活性的检测放射性核素放射活性的检测利用射线照射闪烁体（利用射线照射闪烁体（NaINaI晶体），导致晶体晶体），导致晶体分子激发，在退激发时，闪烁体发出一定波长分子激发，在退激发时，闪烁体发出一定波

6、长的荧光；再由光电倍增管将极微弱的荧光转换的荧光；再由光电倍增管将极微弱的荧光转换成光电子并放大成光电子并放大107107倍；从光电倍增管输出的倍；从光电倍增管输出的电信号经过放大器放大，经单道分析器甄别处电信号经过放大器放大，经单道分析器甄别处理，并在定标器上显示。理，并在定标器上显示。 人民卫生出版社人民卫生出版社二、二、放射性核素标记抗原抗体方法放射性核素标记抗原抗体方法 主要包括主要包括间接标记法间接标记法直接标记法（氯胺直接标记法（氯胺T法）法）人民卫生出版社人民卫生出版社125125I I- -125125I I或或125125I I+ +125125I-I-标记物标记物（混合物）

7、（混合物）Ch-TCh-T、LPOLPO氧化氧化取代反应取代反应（一）直接标记法（一）直接标记法氯胺氯胺T T法（法（C Ch-Th-T） 氯胺氯胺T T将将125125I I的的I I氧化氧化为为I I+ +，I I+ +取代蛋白质取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形酪氨酸苯环的氢，形成稳定的放射标记物成稳定的放射标记物（二碘酪氨酸），最（二碘酪氨酸），最后加入偏重亚硫酸钠后加入偏重亚硫酸钠（还原剂）终止反应。（还原剂）终止反应。人民卫生出版社人民卫生出版社使用无还原剂的使用无还原剂的高比放射性碘源高比放射性碘源被标记物用量要被标记物用量要少少C Ch-Th-T用量要低用量要低控制总反应体积控制总反

8、应体积200l200l反应时间反应时间1 1分钟分钟2 2分钟分钟弱碱性反应条件弱碱性反应条件 人民卫生出版社人民卫生出版社（二）间接标记法（二）间接标记法预先将预先将125125I I用用C Ch-Th-T法标法标记琥珀酰胺酯，制成的记琥珀酰胺酯，制成的125125I I 化脂功能基团可与化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记基反应，从而使待标记物被碘化。物被碘化。 人民卫生出版社人民卫生出版社三、三、放射标记物的纯化与鉴定放射标记物的纯化与鉴定 （一）放射标记物的纯化（一）放射标记物的纯化因游离的因游离的125125I I与与125125I I标记抗原

9、（抗标记抗原（抗体）分子的大小体）分子的大小相差悬殊，故采相差悬殊，故采用凝胶层析即可用凝胶层析即可进行分离纯化进行分离纯化 聚合、聚合、损伤物损伤物 标记蛋白标记蛋白游离游离125125I I人民卫生出版社人民卫生出版社比放射活性比放射活性 高比放射性高比放射性高纯度高纯度完整免疫活性完整免疫活性放射化学纯度放射化学纯度单位标记物单位标记物中结合于被标中结合于被标记物上的放射记物上的放射性占总放射性性占总放射性的百分率的百分率应大于应大于95% 95% 免疫活性免疫活性标记物与抗体标记物与抗体结合的能力结合的能力标记物与过量标记物与过量抗体反应百分比抗体反应百分比该值越大该值越大, , 标标

10、记物免疫活性好记物免疫活性好 （二）放射标记物的鉴定（二）放射标记物的鉴定人民卫生出版社人民卫生出版社计算法计算法自身置换法自身置换法 比放射活性比放射活性单位化学量标记单位化学量标记物中所含的放射性物中所含的放射性强度强度单位：单位：Ci/g Ci/g mCi/mg mCi/mg Ci/mmol Ci/mmol 比放射性过高，比放射性过高，将影响标记物免疫将影响标记物免疫活性活性 人民卫生出版社人民卫生出版社比放射性计算法比放射性计算法 结果欠准，计算简便结果欠准，计算简便依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性来计算标记物的

11、比放射性. .人民卫生出版社人民卫生出版社比放射性自身置换法比放射性自身置换法比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性。标记物的比放射性。作一条常规的作一条常规的RIARIA标准曲线，反应体系包括定标准曲线，反应体系包括定量标记抗原、不同浓度的非标记标准品抗原、量标记抗原、不同浓度的非标记标准品抗原、限量抗体；同时另作一条不加非标记标准品、限量抗体；同时另作一条不加非标记标准品、只加抗体和不同剂量的标记抗原的自身置换曲只加抗体和不同剂量的标记抗原的自身置换曲线。线。 人民卫生出版社人民卫生出版社 自身置换曲线自身置换曲线 标准曲线标准曲线 反

12、应平衡后，测定反应平衡后，测定B/T%B/T%。若从两条曲线上取一点相同的若从两条曲线上取一点相同的B/T%B/T%，则（标记物则（标记物+ +标准品）标准曲线标准品）标准曲线= =（标记物）（标记物）自身置换曲线。由此便可直接计算自身置换曲线。由此便可直接计算标记抗原的含量，并进一步求得比标记抗原的含量，并进一步求得比放射活性放射活性 。人民卫生出版社人民卫生出版社 自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只适用于适用于RIARIA的标记抗原。使用时应注意：的标记抗原。使用时应注意： 标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力标记物与未标记物对抗体（受体）的

13、亲和力 应相同；应相同； 非特异性结合应较小，且计算时应扣除；非特异性结合应较小，且计算时应扣除； 制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤 应相同，特别是应相同，特别是B B与与F F分离的条件要一致分离的条件要一致。人民卫生出版社人民卫生出版社第二节第二节 放射免疫分析放射免疫分析 放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）是以放射性核素标）是以放射性核素标记的抗原（记的抗原（AgAg* *）与未标记抗原（）与未标记抗原（AgAg）竞争）竞争结合特异抗体（结合特异抗体（AbAb）来对待检样品中的抗）来对待检样品中的抗原进行定量测定的一种技术。原进行定量测

14、定的一种技术。人民卫生出版社人民卫生出版社一、检测原理一、检测原理 RIARIA属于竞争性分析，属于竞争性分析，其基本原理是由于其基本原理是由于AgAg* *和和AgAg（待测物（待测物Ag)Ag)对特对特异性抗体具有相同的结异性抗体具有相同的结合力，当三者同时存在合力，当三者同时存在于同一反应体系时，于同一反应体系时，AgAg* *和和AgAg相互竞争结合相互竞争结合特异性抗体。特异性抗体。 AgAg* *和和AgAg具有等同的具有等同的与与AbAb结合能力结合能力人民卫生出版社人民卫生出版社AbAb限量，限量，AgAg* *定量定量, ,AgAg* *和和AgAg的量大于的量大于AbAb结

15、合位点，二者结合位点，二者通过竞争方式与通过竞争方式与AbAb结合；随着结合；随着AgAg增加，增加，AgAg* *与与AbAb结合形成结合形成AgAg* *AbAb复合物的放复合物的放射量降低射量降低, ,二者变化二者变化成函数关系。成函数关系。 人民卫生出版社人民卫生出版社( (标准标准Ag/Ag/样品样品Ag)Ag)二、方法与类型二、方法与类型 非平衡法，即标准品抗原（或待检样非平衡法，即标准品抗原（或待检样本）和特异性抗体，优先使非标记抗本）和特异性抗体，优先使非标记抗原与特异性抗体达到平衡，然后再加原与特异性抗体达到平衡，然后再加入标记抗原竞争与抗体结合。入标记抗原竞争与抗体结合。两

16、种类型两种类型平衡法，即标记抗原、标准品抗原（或平衡法，即标记抗原、标准品抗原（或待检样本）、特异性抗体同时加入反应待检样本）、特异性抗体同时加入反应体系中。体系中。人民卫生出版社人民卫生出版社三、关键技术三、关键技术 抗原抗体反应抗原抗体反应分离结合标记物（分离技术）分离结合标记物（分离技术）放射性测定放射性测定数据处理数据处理人民卫生出版社人民卫生出版社AgAg* *AgAg反应条件反应条件体积体积温度温度时间时间pHpHAbAb( (标准标准Ag/Ag/样品样品Ag)Ag)（一）抗原抗体反应（一）抗原抗体反应 牢固牢固的抗的抗原抗原抗体复体复合物合物人民卫生出版社人民卫生出版社二抗体沉淀

17、法二抗体沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 试剂法试剂法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分离彻底，迅速分离彻底，迅速分离试剂和过程不分离试剂和过程不影响反应平衡影响反应平衡效果不受反应介质效果不受反应介质影响影响 操作应简单、重复操作应简单、重复性好性好经济经济 （二）分离结合标记物（二）分离结合标记物 人民卫生出版社人民卫生出版社晶体闪烁计数器晶体闪烁计数器 包括了包括了NaINaI闪烁晶闪烁晶 体、光电倍增管体、光电倍增管 以及计数器以及计数器测量的放射性信测量的放射性信 号是仪器输出的号是仪器输出的 电脉冲数：每分电脉冲数：每分 钟计数钟计数(cpm)(cpm) 参数参数cpm

18、cpmB/T (%)B/T (%)F/T (%)F/T (%)B/F (%)B/F (%)B/BB/B0 0 (%)(%)注：注：T T即是即是B B与与F F的总和的总和（三）数据处理（三）数据处理 标准曲线标准曲线人民卫生出版社人民卫生出版社RIARIA由于具有敏感度高、特异性强、精密度高、由于具有敏感度高、特异性强、精密度高、重复性好、用血量少、可测定小分子量和大分子重复性好、用血量少、可测定小分子量和大分子量物质等优点，在医学检验中应用极为广泛，常量物质等优点，在医学检验中应用极为广泛，常用于各种激素和药物等的测定。用于各种激素和药物等的测定。但由于放射性核素的放射性对人体会产生一定但

19、由于放射性核素的放射性对人体会产生一定的危害性，且其废物的储存和销毁会对环境造成的危害性，且其废物的储存和销毁会对环境造成污染，因此操作时必须加以注意。污染，因此操作时必须加以注意。四、评价与应用四、评价与应用 人民卫生出版社人民卫生出版社第三节第三节 免疫放射分析免疫放射分析 免疫放射分析（免疫放射分析（IRMAIRMA）是从放射免疫分析是从放射免疫分析（RIARIA）的基础上发展起来的核素标记免疫）的基础上发展起来的核素标记免疫测定，其特点为用核素标记的抗体直接与测定，其特点为用核素标记的抗体直接与待检抗原反应，并用固相免疫吸附剂作为待检抗原反应，并用固相免疫吸附剂作为B B或或F F的分

20、离手段。的分离手段。人民卫生出版社人民卫生出版社一、检测原理一、检测原理 IRMA属于非竞争性免疫结合反应，其基本检测属于非竞争性免疫结合反应，其基本检测 原理是将放射性核素（原理是将放射性核素（125I）标记在抗体上，并）标记在抗体上，并 用过量的标记抗体与待测抗原进行非竞争性结合用过量的标记抗体与待测抗原进行非竞争性结合 反应，并采用固相免疫吸附方式对反应，并采用固相免疫吸附方式对B和和F进行分离。进行分离。检测免疫复合物的放射性，从而得到待检样本的检测免疫复合物的放射性，从而得到待检样本的 浓度。浓度。人民卫生出版社人民卫生出版社二、方法与类型二、方法与类型 （一）单位点（一）单位点 I

21、RMAIRMA人民卫生出版社人民卫生出版社（二）双位点（二）双位点 IRMAIRMA人民卫生出版社人民卫生出版社三、关键技术三、关键技术 抗原抗体反应抗原抗体反应分离技术分离技术放射性测定放射性测定数据处理数据处理人民卫生出版社人民卫生出版社AbAb* *AgAgAbAb( (待检待检Ag)Ag)（一）抗原抗体反应（一）抗原抗体反应 固相固相抗原抗原抗体抗体复合复合物物*牢固牢固的抗的抗原抗原抗体复体复合物合物人民卫生出版社人民卫生出版社固相固相吸附吸附分离技术分离技术 （二）分离技术（二）分离技术 一般采用物理吸附法：用碳酸盐缓冲液将预一般采用物理吸附法：用碳酸盐缓冲液将预包被抗体稀释到包被

22、抗体稀释到3g/ml10g/ml，室温过夜，室温过夜，弃包被缓冲液（含有未结合物质和过剩标记弃包被缓冲液（含有未结合物质和过剩标记物），并洗涤去掉结合不牢固抗体，从而达物），并洗涤去掉结合不牢固抗体，从而达到分离的目的；然后，再加入到分离的目的；然后，再加入1%牛血清白牛血清白蛋白溶液，封闭、保存备用。蛋白溶液，封闭、保存备用。人民卫生出版社人民卫生出版社晶体闪烁计数器晶体闪烁计数器 包括了包括了NaINaI闪烁晶闪烁晶 体、光电倍增管体、光电倍增管 以及计数器以及计数器测量的放射性信测量的放射性信 号是仪器输出的号是仪器输出的 电脉冲数：每分电脉冲数：每分 钟计数钟计数(cpm)(cpm) 参数参数cpmcpmB/T (%)B/T (%)F/T (%)F/T (%)B/F (%)B/F (%)B/BB/B0 0 (%)(%)注：注：T T即是即是B B与与F F的总和的总和（三）数据处理（三）数据处理 人民卫生出版社人民卫生出版社IRMA的优点的优点 效率高、操作简效率高、操作简便便 灵敏度高灵敏度高